王嘉悅， 李天駒， 付 豪， 秦 波

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一類危害極大的傳染性疾病。近年來，“功能性治愈”這一概念被越來越多的醫(yī)務工作者所重視。所謂的“功能性治愈”，也稱“臨床治愈”，是指完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續(xù)檢測不到，HBeAg陰轉(zhuǎn)，伴或不伴HBsAg血清學轉(zhuǎn)換，殘留cccDNA可持續(xù)存在，肝臟炎癥緩解和肝組織病理學改善，終末期肝病發(fā)生率顯著降低[1]。雖然“臨床治愈”還不是完全意義上的治愈，但這是一種類似于急性HBV感染自發(fā)性清除的狀態(tài)，可以實現(xiàn)有效的免疫學控制，是我們目前所追求的理想的治療目標[2]。然而目前指南和專家共識中均認為，這只是部分患者可以達到的目標。因此，需要探索如何讓更多的患者實現(xiàn)這一目標。

聚乙二醇干擾素（Peg-IFN）作為CHB治療的一線用藥，與核苷酸類似物（NA）相比，有著獨特的優(yōu)勢。有研究表明干擾素治療后HBsAg血清轉(zhuǎn)陰率高，轉(zhuǎn)歸好[3]；對于CHB患者來說，以Peg-IFN為基礎的治療比單用拉米夫定療法更能有效地實現(xiàn)HBsAg的清除或血清轉(zhuǎn)換，且療效優(yōu)于常規(guī)干擾素[4]；對于長期NA不太可能達到治療目標的患者，改用Peg-IFN可以實現(xiàn)較高的HBsAg清除率[5]；接受Peg-IFN治療的HBeAg陰性的CHB患者在停止治療后持續(xù)24周的病毒學應答率顯著高于單用拉米夫定者[6]。Peg-IFN既可直接在RNA水平抑制病毒復制，同時也可以作為免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用[7]。同樣有研究報道以Peg-IFN為基礎的聯(lián)合治療可以誘導HBV特異性T細胞的恢復[8]；Peg-IFN治療還可顯著地增強CHB患者NK細胞的百分比和功能[9]。同樣地，Shi等[10]研究發(fā)現(xiàn)在Peg-IFN治療后功能得到恢復的CD56brihgtNK細胞可以通過TRAIL誘導的細胞溶解和TNF-α/IFN-γ介導的非細胞溶解途徑促進HBsAg和cccDNA清除。有研究還發(fā)現(xiàn)具有較低效應記憶γδT細胞比例的CHB患者在Peg-IFNα-2a治療中可能更易獲得應答[11]。綜上可見，宿主免疫功能在Peg-IFN抗HBV治療中發(fā)揮著重要作用。

根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[1]和《慢性乙型肝炎臨床治愈（功能性治愈）專家共識》[2]的相關(guān)內(nèi)容，我們將“早期應答”定義為：CHB患者在接受Peg-IFN治療24周時，HBV DNA下降＞2 lg IU/mL或治療中HBsAg快速下降（12周或24周時HBsAg＜200 IU/mL或下降＞1 lg IU/mL）。本研究將以接受Peg-IFN治療的HBeAg陰性的CHB患者為研究對象，探索影響早期應答的因素，以及外周血T淋巴細胞的分布及動態(tài)變化與Peg-IFN抗HBV療效的相關(guān)性，為預測Peg-IFN療效以及尋找新的抗HBV治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究納入2017年4月—2020年8月于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科門診就診的CHB患者204例。

納入標準：①成年患者（年齡≥18歲）；②血清HBsAg＜3 000 IU/mL、抗-HBs陽性或陰性、HBeAg陰性、抗-HBe陽性或陰性；③同意使用Peg-IFNα-2b（派格賓）治療，180 μg每周一次，皮下注射，并且堅持每月監(jiān)測血常規(guī)、肝功能，每3個月監(jiān)測乙肝病毒標志、HBV DNA定量，每半年監(jiān)測腹部B超、肝臟彈力成像、肝纖譜、甲胎蛋白（AFP）等指標；④已了解本項研究及治療中的風險并簽署知情同意書。

排除標準：①合并其他感染性疾病，如丙型、戊型病毒性肝炎以及HIV感染等；②干擾素治療絕對禁忌證，如：妊娠或短期內(nèi)有妊娠計劃、精神病史、未能控制的癲癇、失代償期肝硬化、未控制的自身免疫病，嚴重感染、視網(wǎng)膜疾病、心功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病等基礎疾??；③合并心血管、泌尿系統(tǒng)、結(jié)締組織及血液系統(tǒng)等嚴重慢性疾?。虎苁褂肞eg-IFNα-2b的過程中出現(xiàn)嚴重過敏反應及骨髓抑制等不良反應。

納入符合標準的患者，登記其個人信息及病史，并通過重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診系統(tǒng)獲取患者的檢驗報告，包括血常規(guī)、肝功能、乙肝病毒標志、HBV DNA定量、腹部B超、AFP等指標。本研究已通過重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的審批，審查批號：2020-409。

1.2 樣本采集及處理

采集10名健康志愿者以及納入該研究的部分患者在不同治療階段（基線、12周、24周）的外周血10 mL，通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。細胞計數(shù)儀計數(shù)，選擇合適的細胞數(shù)（不低于2×106/管）分管，梯度凍存（使用程序性凍存盒或4℃，30 min；-20℃，2 h；-80℃，過夜）后于液氮中長期保存。主要試劑有RPMI1640（Gibco）、胎牛血清FBS（Gibco）、人外周血淋巴細胞分離液（TBD公司）、無菌PBS溶液（博士德生物）、無血清細胞凍存液（深圳達科為生物）等。

1.3 流式細胞技術(shù)分析T淋巴細胞的分布差異

從液氮罐中取出PBMC，快速復蘇細胞后計數(shù)，確保細胞數(shù)目不低于2×106/管。再進行Fc封閉：2.5 μL Human TruStain FcX?（ Fc receptor blocking solution） /50 μL細胞體系，避光靜息8 min，免洗，直接用于后續(xù)染色。在50 μL PBS溶液重懸的細胞體系中，加入相應的流式抗體，避光孵育20 min，之后 PBS溶液洗滌 2次（離心：300×g，5 min，室溫），最后用400 μL PBS溶液重懸后移入流式管，采用流式細胞儀檢測。數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件進行分析。使用的流式抗體：美國BioLegend公司提供的Human TruStain FcXTM（Fc Receptor Blocking Solution）、PE Anti-Human CD3、PerCP/Cy5.5 Anti-Human CD4、FITC Anti-Human CD8、Brilliant Violet 650TMAnti-Human CD25、APC Anti-Human CD127以及相應的同型抗體Brilliant Violet 650TMMouse IgG1,κ、APC Mouse IgG1,κ。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件及GraphPad Prism 8.0進行作圖和分析。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）或頻數(shù)表示；正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。臨床資料中，不滿足正態(tài)性和方差齊性的組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗，無序計數(shù)資料主要采用χ2檢驗，并應用logistic逐步回歸分析法對早期應答的影響因素進行分析。實驗數(shù)據(jù)資料中滿足正態(tài)分布及方差齊性者，兩組間比較采用非配對t檢驗；兩組間不符合方差齊性者采用Welch's 校正非配對t檢驗；若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用Mann-Whitney秩和檢驗。當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床治療

共納入204例患者，男133例，女71例，曾經(jīng)接受過NA或IFN治療51例，無NA或IFN抗病毒治療史153例。在這204例患者中，實現(xiàn)早期應答的患者120例，未實現(xiàn)早期應答的患者84例。完成至少48～52周療程的患者137例，其中HBsAg清除的患者66例。而這66例患者中僅有4例未實現(xiàn)早期應答，29例在治療結(jié)束時抗-HBs呈陽性（抗-HBs定量＞10 mIU/mL），約為42.06 mIU/mL。所有入組患者在治療期間均使用Peg-IFNα-2b治療，劑量為180 μg，每周1次，皮下注射，并堅持每月門診隨訪。部分患者合并使用NA，如恩替卡韋、替諾福韋等。當入組患者出現(xiàn)肝功能異常時，合并使用保肝藥，如甘草酸二銨、水飛薊素等；當入組患者出現(xiàn)白細胞或血小板降低時，合并使用地榆升白片、益血生膠囊等藥物，嚴重時給予皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子注射液等對癥措施。

2.2 影響Peg-IFNα-2b治療CHB實現(xiàn)早期應答的臨床因素分析

根據(jù)患者的治療情況，將其分為早期應答組（early response group， ERG）和早期不應答組（early non-response group， NERG），并對兩組患者的性別、年齡、抗病毒治療史、基線時的HBsAg、HBV DNA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TB）、直接膽紅素（DB）以及治療12周時的ALT、AST、TB、DB進行單因素分析。

結(jié)果顯示ERG （女51例，男69例）與NERG （女20例，男64例）患者的性別分布差異有統(tǒng)計學意義，ERG女性占比高于NERG（P=0.006）。同時發(fā)現(xiàn)，兩組患者的年齡、治療12周時的ALT、AST和DB的差異亦有統(tǒng)計學意義，ERG患者的年齡小于NERG（P=0.019），治療12周時的ALT （P=0.001）、AST （P=0.001） 和DB（P=0.043）高于NERG。其余指標的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 Peg-IFNα-2b治療CHB實現(xiàn)早期應答的單因素分析Table 1 Univariate analysis of predictors for early response of Peg-IFNα-2b in the treatment of chronic hepatitis B

以單因素分析P＜0.05且專業(yè)上有意義的因素，如性別（1=男，2=女）、年齡、治療12周時的ALT、AST和DB為自變量，早期應答（1=有，0=無）為因變量，進行多因素logistic回歸分析，方法選擇逐步回歸法，進入和排除標準分別為0.05和0.10。結(jié)果顯示性別、年齡以及治療12周時的AST是早期應答的獨立影響因素。女性、年齡越小及治療12周時AST越高，其早期應答發(fā)生的可能性越大（P＜0.05）。尚不能認為治療12周時的ALT和DB對早期應答的發(fā)生有影響（P＞0.10）。見表2。

2005年，紐約南區(qū)的聯(lián)邦檢察長發(fā)出傳票，指稱美國國會多數(shù)黨領袖比爾·傅利斯特 (Bill Frist)因涉嫌股票內(nèi)線交易而遭調(diào)查。傅利斯特出身心臟外科醫(yī)生，潔身自好，在朝野上下一度口碑甚佳，從政后也面臨著如何出污泥而不染的考驗。盡管長達18個月的外查內(nèi)調(diào)后來無疾而終，這一事件對國會參、眾兩院的議員們都是一記不容忽視的警鐘。

表2 接受Peg-IFNα-2b治療CHB實現(xiàn)早期應答的多因素logistic回歸分析Table 2 Multivariate logistic regression analysis of predictors for early response of Peg-IFNα-2b in the treatment of chronic hepatitis B

2.3 Peg-IFNα-2b治療早期外周血T淋巴細胞的分布及動態(tài)變化

對采集的樣本進行分組：健康對照（healthy control，HC，n=10） 組、CHB基 線 組（CHB/CHB 0周組，n=13）、實現(xiàn)早期應答的患者標本為ERG （不包括HBsAg清除時的血標本，因為HBsAg對于免疫功能存在抑制的作用[12]）以及未實現(xiàn)早期應答的患者標本為NERG；再根據(jù)已完成的療程分為：ERG 0周（n=8）和NERG 0周（n=5）、ERG 12周（n=16）和NERG 12周（n=12）、ERG 24周（n=8）和 NERG 24周（n=5）。通過流式細胞技術(shù)對PBMC中的CD4+T細胞、CD8+T細胞、Treg細胞等進行分析。見圖1。

圖1 外周血PBMC 流式分析圖Figure 1 Flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells

2.3.1 CD4+T細胞在治療早期外周血中的分布CD4+T細胞占總T細胞的百分比（CD4+T細胞百分比）在CHB組與HC組、ERG 0周與NERG 0周、ERG 12周與NERG 12周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統(tǒng)計學意義：CHB組高于HC組（P=0.025），ERG 0周高于NERG 0周（P=0.007），ERG 12周高于NERG 12周（P=0.006），ERG 0周同樣高于ERG 24周（P=0.012）。在整個治療早期（療程在24周內(nèi)），CD4+T細胞百分比在ERG中明顯下降，在NERG中緩慢上升，在其他各組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 CD4+ T細胞在治療早期外周血中的分布Figure 2 The distribution of CD4+ T cells in peripheral blood at early stage of treatment

2.3.2 CD8+T細胞在治療早期外周血中的分布 CD8+T細胞占總T細胞的百分比（CD8+T細胞百分比）在CHB組與HC組、ERG 12周與NERG 12周、ERG 24周 與 NERG 24周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統(tǒng)計學意義：CHB組低 于 HC組（P=0.015），ERG 12周 低 于 NERG 12周（P=0.034），ERG 24周 高 于 NERG 24周（P=0.042），ERG 0周低于 ERG 24周（P=0.002）。在整個治療早期，CD8+T細胞百分比在ERG中明顯上升，在NERG中平緩或緩慢下降 。CD8+T細胞百分比在其他各組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 CD8+ T細胞在治療早期外周血中的分布Figure 3 The distribution of CD8+ T cells in peripheral blood at early stage of treatment

2.3.3 CD4+/CD8+T細胞比值在治療早期的變化 CD4/CD8比值在CHB組與HC組、ERG 0周與NERG 0周、ERG 12周與NERG 12周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統(tǒng)計學意義：CHB組高于HC組（P=0.016），ERG 0周高于NERG 0周（P=0.030），ERG 12周同樣高于NERG 12周（P=0.026），ERG 0周 明 顯 高 于 ERG 24周（P=0.006）。在整個治療早期，CD4/CD8比值在ERG中呈明顯下降，在NERG中緩慢上升。但是CD4/CD8比值在其他各組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CD4/CD8比值在治療早期的變化Figure 4 The change of CD4+/CD8+ ratio at early stage of treatment

2.3.4 Treg細胞在治療早期外周血中的分布 Treg細胞占CD4+T細胞的百分比（Treg細胞百分比）在HC組與CHB組、ERG 24周與NERG 24周、NERG 0周與NERG 24周中差異均有統(tǒng)計學意義：CHB組高于HC組（P=0.025）、ERG 24周高于NERG 24周（P=0.002）、NERG 0周高于 NERG 24周（P=0.033）。在整個治療早期，Treg細胞百分比在ERG呈平緩或緩慢上升趨勢，在NERG則先平穩(wěn)后明顯下降，尤其是在治療12～24周時。Treg細胞百分比在其他各組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 Treg細胞在治療早期外周血中的分布Figure 5 Distribution of Treg cells in peripheral blood at early stage of treatment

3 討論

要實現(xiàn)早期應答，Peg-IFNα-2b的免疫調(diào)節(jié)功能也發(fā)揮著重要的作用。Fletcher等[16]通過在具有完全免疫能力的CHB動物模型中研究重組IFNα確定了其免疫調(diào)節(jié)作用，而非直接的抗病毒活性，與治療反應最密切相關(guān)，表明NK/T細胞的細胞溶解和非細胞溶解機制介導了對重組IFNα治療的抗病毒應答?？梢姡琓淋巴細胞在Peg-IFNα-2b抗HBV治療中的重要性。

然而，持續(xù)刺激引起的T細胞功能障礙或T細胞衰竭是多種慢性感染（如CHB）和癌癥中的一種免疫狀態(tài)[17]。CD8+T細胞在適應性免疫應答中起著核心作用，其特征在于大量擴增并分化為細胞毒性效應細胞，以清除異常細胞或外來因子。耗盡的CD8+T細胞與其功能的逐漸受損有關(guān)，尤其是在細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生和抗原消除中。本研究中CHB組CD4+T細胞百分比、CD4/CD8比值高于HC組，CD8+T細胞百分比低于HC組的結(jié)果反映出CHB患者CD8+T細胞的嚴重耗竭。

在Peg-IFN治療的早期（24周），CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4/CD8比值以及Treg細胞的動態(tài)變化與早期應答的實現(xiàn)密切相關(guān)。其中，CD8+T細胞占主導地位，在實現(xiàn)早期應答的過程中其耗竭程度有所減輕，且與HBsAg的快速下降有關(guān)。CD8+T細胞在治療早期的上升趨勢以及因其上升而引起的CD4/CD8比值的下降預示著HBsAg快速下降的可能性，進而預示著實現(xiàn)功能性治愈的可能性。Thimme等[18]也通過大猩猩模型證明了CD8+T細胞在控制HBV感染中的重要性。而治療前較高的CD4+T細胞百分比也是預測HBsAg快速下降的影響因素之一，雖然在隨后的治療中出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于CD8+T細胞升高而導致的相對下降。至于Treg細胞百分比在ERG 24周中高于NERG 24周以及在NERG中出現(xiàn)下降趨勢（12～24周）可能的原因是負反饋調(diào)節(jié)。由于早期應答的免疫活動較不應答活躍，反射性地引起免疫抑制細胞Treg細胞百分比的升高。同時，這也提示治療24周時Treg細胞的百分比對于預測Peg-IFN的療效有一定作用?？傊?，分析Peg-IFNα-2b治療期間宿主免疫功能的狀態(tài)，不能以單個指標來做出判斷與決策，只有多指標結(jié)合，分析整個治療過程中的動態(tài)變化，才能更加準確地判斷患者的免疫狀態(tài)并預測療效。本研究的不足在于重點關(guān)注了免疫細胞，卻未涉及相應的細胞因子，對于免疫細胞功能的研究不夠徹底，有待進一步深入研究。

綜上所述，女性、年齡越小、治療12周時的AST越高，則在Peg-IFN治療CHB早期實現(xiàn)HBV DNA及HBsAg快速下降的可能性越大。外周血T淋巴細胞的分布以及治療早期的動態(tài)變化與CHB實現(xiàn)早期應答密切相關(guān)。其中，CD8+T細胞占主導地位。治療早期CD8+T細胞百分比的升高以及因其升高而導致的CD4/CD8比值的下降可用來預測Peg-IFNα-2b的療效。本研究也在免疫學角度為后期對于實現(xiàn)功能性治愈的研究提供了理論依據(jù)。