范文華, 戴建軍, 張樹山, 孫玲偉, 吳彩鳳, 張德福*

(1.上海海洋大學, 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心, 201306 上海; 2.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所, 上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室, 201106 上海)

精液冷凍是長期保存精子細胞活力的技術(shù)手段，后續(xù)可通過人工授精恢復畜禽生殖能力。冷凍-解凍過程易造成精子的物理和化學性損傷，在稀釋液中添加冷凍保護劑可大大降低這種損傷。卵黃(egg yolk，EY)是哺乳動物精液冷凍稀釋液中常添加的保護劑，存在動物源性病原微生物污染的風險，且其成分復雜，不易制備標準濃度的冷凍保護劑[1]。此外，卵黃中含有大量卵磷脂等脂質(zhì)，導致稀釋液粘度增加，抑制精子呼吸并降低精子運動能力[2]。因此，尋求卵黃替代物成為精液冷凍標準化生產(chǎn)的必然趨勢。Salmani等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊精液冷凍中使用大豆卵磷脂替代雞蛋卵黃，凍后精子活力活率可達33.8%和66.0%，與卵黃組(EY組)的35.4%和67.2%無顯著性差異，起到保護凍融后精子免受冷凍損傷的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，2%的大豆卵磷脂可替代卵黃在山羊精液冷凍保存中進行應用，凍后活力和活率可達52.14%和57.44%[4]。

哺乳動物的精子質(zhì)膜中含有較高濃度的多不飽和脂肪酸，在凍融過程中易氧化應激產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)導致脂質(zhì)過氧化(lipid peroxides, LPO)反應，或生成過量脂質(zhì)過氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)導致線粒體的功能障礙，從而影響精子能量代謝，使精子活力下降，受胎率降低[5]。大量研究表明，在精液冷凍稀釋液中添加抗氧化劑可抑制LPO反應，改善精子運動能力[6-8]。原花青素(proanthocyanidins, PC)是一種多酚類天然強抗氧化劑，其氧化性優(yōu)于維生素C和維生素E，能有效清除自由基，抑制ROS的形成，增強抗氧化能力[9]。Attia等[10]研究證實，PC具有清除自由基功能，可減輕雄性小鼠生殖細胞的突變，提高小鼠精子活力。瞿靜雯等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在兔精子獲能液中添加1 mg·mL-1PC能有效保護精子質(zhì)膜和頂體完整性，對精子獲能有明顯促進作用。孫艷青等[12]研究表明，豬精液超低溫冷凍保存中添加40 μg·mL-1PC，精子抗氧化能力得到大幅提高。呂松潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)，湖羊精液冷凍中添加10 μg·mL-1PC，可有效降低精子氧化損傷，提高凍精質(zhì)量。

以上凍精研究均在以雞蛋卵黃為冷凍保護劑的稀釋液中添加抗氧化劑，在山羊大豆卵磷脂冷凍稀釋液中PC添加的研究報道較少。因此，本研究通過比較添加PC對山羊凍后精子質(zhì)量、抗氧化指標和凋亡的影響，探究大豆卵磷脂冷凍稀釋液中添加PC對山羊凍精中的抗氧化保護作用，為進一步提高大豆卵磷脂在山羊精液冷凍中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物

除特別說明外，所有試劑均購自Sigma(美國)公司。

采精用6只崇明白山羊種公羊來源于上海市農(nóng)業(yè)科學院食草動物綜合試驗站，年齡2～3歲，體格健壯，繁殖性能優(yōu)良。

1.2 稀釋液的配制

基礎(chǔ)稀釋液的配制：稱取檸檬酸1.825 2 g、葡萄糖0.504 4 g和 TRIS 3.634 2 g，溶解后加入200 IU·mL-1雙抗(遠征藥業(yè)，石家莊)、6 mL甘油，混勻，定容至100 mL。

試驗共分6組，對照組(EY組)為在基礎(chǔ)稀釋液中添加20.0%(體積分數(shù))卵黃，試驗組(SL0、SL1、SL2、SL3和SL4)為在基礎(chǔ)稀釋液中添加2.0%(質(zhì)量體積分數(shù))大豆卵磷脂，再添加0、10、20、40、60 μg·mL-1的PC(源葉生物公司，純度 95%)。

1.3 精液采集及處理

1.3.1精液采集 山羊精液采用假陰道法采集[14]，經(jīng)常規(guī)檢測，活力在80%以上可用于后續(xù)試驗。

1.3.2精液冷凍 將6只種公羊精液混合，按照精液與稀釋液1∶3的比例稀釋混勻，移入4℃冰箱中緩慢降溫平衡2 h。平衡后的樣品在4 ℃條件下裝入0.25 mL細管，封口后于液氮面上方3 cm處熏蒸15 min，投入液氮保存。

1.3.3精液解凍 從液氮中取出細管樣品，迅速放于70 ℃水浴鍋中解凍5 s，用稀釋液1∶10稀釋，37 ℃孵育10 min后進行指標檢測。

1.4 精子質(zhì)量檢測

1.4.1精子活力與活率 解凍后精液孵育10 min，輕輕混勻，取10 μL精液滴在預熱的邁朗精子計數(shù)板中，置于37 ℃恒溫載物臺上，使用邁朗精液自動分析儀在200×光學顯微鏡(SJ-TMDI608，邁朗)下隨機選取3個視野，計算精子活力和活率。

(1)

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1.4.2精子質(zhì)膜完整率檢測 采用低滲腫脹試驗法(hypoosmotic swelling test，HOST)檢測精子質(zhì)膜完整性[15]。HOST低滲溶液(0.9 g果糖、0.49 g檸檬酸鈉，溶于100 mL雙蒸水中)37 ℃預熱。取50 μL樣品添加到500 μL低滲溶液中，37 ℃水浴1 h，于200×光學顯微鏡下隨機觀察3個視野，計算彎尾精子數(shù)與總精子數(shù)的比例。

(3)

1.4.3精子頂體完整率檢測 采用吉姆薩染色法[16]測定精子頂體完整率。解凍后精液使用預熱的無甘油基礎(chǔ)稀釋液50倍稀釋，取10 μL滴于載玻片上涂片，風干。甲醇固定，風干后沖洗干凈。吉姆薩染色12 h，沖洗干凈，風干后于油鏡下隨機觀察3個視野，統(tǒng)計頂體完整染成紫紅色精子數(shù)和總精子數(shù)比例，計算精子頂體完整率。

(4)

1.4.4精子線粒體活性檢測 使用羅丹明123(Rh 123)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染法檢測精子線粒體活性。解凍后精液稀釋至1.5×106mL-1，加入10 μL羅丹明123(1 μmoL·L-1)和10 μL碘化丙啶(1 mg·mL-1)混合， 37 ℃避光孵育30 min 后，吸取10 μL樣品制片。在400×倒置熒光顯微鏡(卡爾ZEISS，Axiovert A1)波長520 nm下隨機選取四個視野(n≥200)觀察，精子呈現(xiàn)紅色熒光為死精，精子尾部呈現(xiàn)綠色熒光有線粒體活性[17]，統(tǒng)計精子線粒體活性比率。

(5)

1.4.5精子抗氧化指標檢測 使用碧云天的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)試劑盒，分別檢測解凍后精子的抗氧化指標。

1.4.6精子凋亡指標檢測 使用CASPACETMFITC-VAD-FMK原位熒光標記試劑盒(Promega公司)和TUNEL凋亡檢測試劑盒(碧云天)檢測凍后精子總caspase和TUNEL凋亡率。每200 μL精液加入4%多聚甲醛，室溫固定1 h。PBS清洗后加入0.1% Triton冰浴2 min，PBS清洗后分別進行凋亡檢測?？俢aspase檢測時加入50 μL CASPACETMFITC-VAD-FMK檢測液，混勻后37 ℃避光孵育5 min。TUNEL檢測時加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h。樣品經(jīng)PBS洗滌后懸浮，利用流式細胞儀(貝克曼庫爾特，F(xiàn)C500 MPL)測定凋亡精子數(shù)，計算凋亡率。

(6)

1.5 統(tǒng)計分析

每組試驗重復三次，每次每組至少解凍兩管。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果表示為“平均值±標準誤”，P< 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加原花青素對山羊凍精質(zhì)量的影響

由表1可知，添加PC濃度為40 μg·mL-1(SL3組)時，解凍后精子各項指標最高，活率、活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別為58.49%、53.45%、50.46%、55.37%，與未添加PC的EY組(20%卵黃)和SL0組(2%大豆卵磷脂)差異顯著(P<0.05)。SL3組質(zhì)膜完整率與SL2組差異不顯著(P>0.05)，但活率、活力和頂體完整率均顯著高于SL2組(P<0.05)。當PC濃度增加至60 μg·mL-1(SL4組)時，凍精質(zhì)量最差，各項指標與EY組(20%卵黃)和SL0組(2%大豆卵磷脂)相比均顯著下降(P<0.05)。可見，在大豆卵磷脂稀釋液中添加40 μg·mL-1PC可有效提高山羊凍融后精液質(zhì)量。

表1 不同濃度原花青素下山羊凍精質(zhì)量Table 1 Quality of goat frozen semen under different concentrations of PC

注：尾部彎曲為質(zhì)膜完整；尾部未彎曲為質(zhì)膜不完整。Note：Cured tail means membrane-intact sperm; unbent tail means membrane-damaged sperm.圖1 精子尾部卷曲Fig.1 Sperm tail curling

2.2 添加原花青素對凍后山羊精子線粒體活性的影響

添加不同濃度PC對山羊精子凍后線粒體活性影響結(jié)果如圖3所示。當大豆卵磷脂冷凍保護稀釋液添加PC濃度為40 μg·mL-1PC(SL3組)時，解凍后精子線粒體活性顯著高于EY組(20%卵黃)和SL0組(2%大豆卵磷脂)(P<0.05)。當濃度增加至60 μg·mL-1(SL4組)時，線粒體活性顯著下降(P<0.05)，說明大豆卵磷脂稀釋液中添加PC具有濃度效應， 當PC添加濃度為40 μg·mL-1時，解凍后山羊精子線粒體活性得到顯著提高。

圖2 精子頂體完整性Fig.2 Sperm acrosome integrity

2.3 添加原花青素對山羊凍精抗氧化能力的影響

大豆卵磷脂稀釋液中添加PC質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1(SL3組)時，ROS和MDA值最低，分別為0.435和7.03 nmol·L-1，與EY組和SL0組相比差異顯著(P<0.05)；SL3組的SOD和GSH-PX值最高，分別為224.87 U·mL-1和129.6 U·L-1，顯著高于EY組和SL0組。當添加PC質(zhì)量濃度至60 μg·mL-1(SL4組)時，SOD和GSH-PX酶活力大幅下降，ROS和MDA值上升，表現(xiàn)為氧化損傷，與EY組和SL0組差異顯著(P<0.05)?？梢?，在大豆卵磷脂稀釋液中添加最適濃度外源抗氧化劑PC能有效提高山羊凍精抗氧化能力，減少精子氧化損傷。

注：圖中不同字母表示差異顯著(P <0.05)。Note:Different letters in the figure mean significant difference between the treatments (P <0.05).圖3 精子線粒體活性Fig.3 Mitochondrial activity of sperm

注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters in the figure mean significant difference between the treatments (P<0.05).圖4 不同濃度原花青素對山羊凍精抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of PC on the antioxidant capacity of frozen-thawed goat semen

2.4 添加原花青素對山羊冷凍-解凍精子凋亡的影響

大豆卵磷脂稀釋液中添加PC對山羊凍精凋亡影響結(jié)果見表2。當PC添加濃度為40 μg·mL-1(SL3組)時，經(jīng)caspase原位熒光染色和TUNEL檢測后流式細胞儀測定精子凋亡率(圖5)，總caspase凋亡率和TUNEL凋亡率均最低，且與EY和SL0組凍融精子細胞凋亡率相比差異顯著(P<0.05)；繼續(xù)提高PC添加濃度至60 μg·mL-1(SL4組)時，凍精的凋亡比例迅速增加，與40 μg·mL-1(SL3組)差異顯著(P<0.05)。結(jié)果說明，當添加PC濃度為40 μg·mL-1時解凍后山羊精子凋亡率最低，對提高精子細胞抗凋亡具有積極影響。

表2 不同原花青素下山羊冷凍-解凍精子凋亡率Table 2 Quality of goat frozen-thawed semen under different concentrations of PC

圖5 流式細胞儀檢測解凍后精子凋亡率Fig.5 D-plots and histogram analysis of spermatozoa apoptosis rate after thawed

3 討論

3.1 原花青素的應用對山羊凍精常規(guī)品質(zhì)的影響

本研究在大豆卵磷脂稀釋液中添加原花青素(PC)，發(fā)現(xiàn)其對提高山羊凍精的抗凍能力具有濃度依賴效應，添加不同濃度PC后凍精品質(zhì)常規(guī)指均有差異。結(jié)果顯示，添加 40 μg·mL-1的PC能顯著提高山羊凍精質(zhì)量，解凍后精子活力、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性最高，分別達58.49%、53.45%、50.46%、55.37%和55.16%，顯著高于卵黃組和未添加PC組，這可能是由于PC中的酚性羥基被氧化釋放出H+，競爭性的與自由基及氧化物結(jié)合，緩解精子細胞氧化應激反應有關(guān)。該結(jié)果與呂松潔等[13]以卵黃為基礎(chǔ)稀釋液中的研究結(jié)果相一致，其發(fā)現(xiàn)10 μg·mL-1的PC可提高湖羊的凍精效果。精子質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸所含雙鍵是維持膜流動性和精子活力所必需的化學鍵，ROS異常增加可破壞雙鍵，由于精子質(zhì)膜中缺乏相關(guān)細胞質(zhì)酶，無法修復由ROS引起的損傷，致使脂類化合物聚集，精子活率和活力下降[18-19]。PC作為一種高效抗氧化劑，其高分子結(jié)構(gòu)中的二羥酚基可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應，使自由基失活，減少ROS含量，有效降低線粒體膜和脂質(zhì)膜的脂質(zhì)過氧化反應[20]。

3.2 原花青素的應用對山羊凍精抗氧化性的影響

孫艷青等[12]研究表明，豬精液凍存中PC最佳添加濃度為40 mg·L-1;李方舟[21]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊精液低溫保存中葡萄籽原花青素的最適添加濃度為30 mg·L-1。本研究結(jié)果顯示，添加一定濃度的PC可改善解凍后精子細胞內(nèi)源性抗氧化酶活性，有效降低ROS和MDA含量，當添加PC濃度為40 μg·mL-1時，SOD和GSH-PX水平最高，ROS和MDA含量最低。PC最適添加濃度不同可能與不同物種稀釋液配方和保存方式有關(guān)。上述研究均證實PC對精子保存中抗氧化作用有顯著提高,這可能與PC的結(jié)構(gòu)和抗氧化保護機制有關(guān)。一方面，PC可參與精子質(zhì)膜磷脂、花生四烯酸的代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，降低脂質(zhì)過氧化損傷[22]；另一方面PC結(jié)構(gòu)中的酚羥基會在氧化后釋放，優(yōu)先與自由基結(jié)合形成惰性化合物，降低精子細胞內(nèi)MDA含量[23]。這與涂瓏瓏[24]研究結(jié)果相一致，其發(fā)現(xiàn)PC可通過降低脂質(zhì)過氧化水平，緩解小鼠精子由4-硝基酚誘導的毒性損傷和生殖損傷的。SOD和GSH-PX作為哺乳動物精子細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，SOD可將超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，有效清除自由基；GSH-PX可清除ROS，且在DNA損傷的修復中也發(fā)揮重要作用[25]。Yousef等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PC可有效提高細胞中GSH、SOD和CAT(catalase)等抗氧化酶活性，也有研究將大鼠離體組織與PC共浴，結(jié)果表明大鼠組織中MDA含量顯著下降[27]，與本研究結(jié)果一致。

3.3 原花青素的應用對凍融后山羊精子凋亡的影響

Caspase酶家族活化是細胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)，存在于多數(shù)凋亡途徑中，對Caspase酶水平的檢測來評估精子早期凋亡水平[28]。精子細胞內(nèi)DNA斷裂通常由凋亡異常引起，檢測DNA鏈的完整性是評估精子質(zhì)量的重要指標，TUNEL法可通過非放射性核素方法檢測凋亡晚期過程中DNA斷裂情況[29]。本研究在山羊精液冷凍過程中添加40 μg·mL-1PC，解凍后精子細胞caspase凋亡率和TUNEL凋亡比例顯著降低，證實了大豆卵磷脂稀釋液中添加PC對山羊冷凍精液的抗凋亡保護作用。添加40 μg·mL-1PC組解凍后精子細胞TUNEL凋亡率(41.36%)低于caspase凋亡率(54.33%)，可能是由于凍融后進入早期凋亡的精子細胞較高于中晚期凋亡的精子。而凍精稀釋液中添加一定濃度PC后，精子凋亡率明顯下降，可能與PC能夠降低p53基因表達，增加抗凋亡基因Bcl-2表達含量，從而減少細胞凋亡有關(guān)。李華文等[30]研究發(fā)現(xiàn)，PC可通過P53和caspase-3途徑抑制肝細胞非正常凋亡，調(diào)節(jié)細胞存活率，這與本研究結(jié)果一致。

有關(guān)花青素毒性和安全性研究報道較少。瞿靜雯等[11]研究PC對兔精子獲能發(fā)現(xiàn)，當PC的添加濃度大于1.0 mg·mL-1時，導致精子頂體反應率下降。本研究中增加PC濃度至60 μg·mL-1后，PC開始表現(xiàn)為對精子的毒副作用，表現(xiàn)為解凍后精子活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整率下降。可能與高濃度的PC添加打破了精子細胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，引發(fā)過度氧化應激，誘導精子細胞構(gòu)象和完整性發(fā)生不可逆損傷有關(guān)。

綜上所述，在山羊精液冷凍過程中，PC在大豆卵磷脂稀釋中的添加具有濃度依賴效應，40 μg·mL-1的PC對山羊凍精有顯著抗氧化保護作用，可通過降低氧化損傷和細胞凋亡、提高線粒體功能，從而達到提高冷凍效率的目的。高濃度的PC則表現(xiàn)為對冷凍精液的毒性作用。