李冬梅，李志陽，楊 君，郝志明，楊 潔，林春華

（廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)林學(xué)院，廣東廣州 510503）

簕菜，學(xué)名白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）又稱苦刺（昆明、汕頭）、三加皮（邵武、漳州、寧德）、三葉五加（臺(tái)灣、日本）、鵝掌簕等，為五加科五加屬的攀援灌木，多生于林緣、灌叢或山坡。簕菜主要分布于我國華南、西南、華中等地區(qū)，在馬來西亞、新加坡、印度、日本等地也存在[1]。簕菜不僅作為民間常用草藥，也是一種營養(yǎng)和保健價(jià)值都很高的野生蔬菜，據(jù)《本草綱目》記載，簕菜具有“解百毒”之稱，可清熱排毒、消暑解渴、解煙酒，具“久服輕身耐老”獨(dú)特食療功效[2]。因此是藥膳兩用蔬菜，是開發(fā)功能食品的理想原料，且安全無毒[3?5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品營養(yǎng)學(xué)研究表明，簕菜的化學(xué)成分包括黃酮、酚酸、多糖、萜類、皂苷、揮發(fā)油等多種類型化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛抗疲勞[6?7]、抑菌美白[8]、降血糖[9?10]、抗癌[11?12]、抗氧化[13]等多種活性作用和保健功效[14?15]。

隨著飲酒人數(shù)及人均酒精消費(fèi)量的增多，酒精性肝病的發(fā)病率逐年上升，無論是美國[16]、芬蘭[17]、韓國[18]等發(fā)達(dá)國家還是我國[19]，酒精性肝病是造成肝硬化的主要病因。酒精性肝病己嚴(yán)重威脅到人類健康，成為全社會(huì)關(guān)注的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題[20]。廣東江門市恩平等地盛產(chǎn)簕菜，十多年前已經(jīng)開始了人工種植，2015年，“恩平簕菜”入選國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志。據(jù)當(dāng)?shù)鼐用袼?，食用簕菜有解酒和護(hù)肝的作用，但目前尚未有簕菜解酒護(hù)肝方面相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究建立白酒致大鼠醉酒模型和大鼠急性酒精肝損傷模型，探討簕菜醇提物、水提物的解酒護(hù)肝作用，從防醉酒、加速酒精代謝促解酒、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和減緩肝組織細(xì)胞損傷角度，研究簕菜對(duì)大鼠的解酒護(hù)肝作用，以期為進(jìn)一步發(fā)掘簕菜的保健功能拓寬思路，也為簕菜解酒護(hù)肝保健功能食品的開發(fā)奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

簕菜莖葉 2020年7月采于廣州市增城區(qū)中新鎮(zhèn)校區(qū)東門試驗(yàn)田，種苗由廣東恩平雪莊簕菜茶廠基地提供，品種為青梗；56°紅星二鍋頭 北京紅星股份有限公司；SPF級(jí)雄性SD大鼠 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，健康8周齡、體重200±20 g左右，許可證編號(hào)：SCXK（粵）2018-0002；蘇木精 Solarbio公司；蘆丁、沒食子酸、齊墩果酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；海王牌金樽片 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20191205；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、微量還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

JJ-2組織粉碎機(jī) 常州金壇良友儀器有限公司；723可見分光光度計(jì) 上海光學(xué)儀器一廠；HWS-24水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DLSB-5L/10低溫冷卻液循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RV3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精其儀器有限公司；H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BPC-250F恒溫培養(yǎng)箱

上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Tecan Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；JB-P5包埋機(jī)、JB-L5凍臺(tái) 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機(jī) 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；Donatello脫水機(jī)、Giotto染色機(jī) 意大利DIAPATH公司；GFL-230烤箱 天津市萊玻璃儀器設(shè)備有限公司；ckx53顯微鏡 日本OLUMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 簕菜提取物的制備

1.2.1.1 醇提物制備 稱取經(jīng)60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥10 h，組織粉碎機(jī)粉碎后過100目篩的簕菜莖葉粉30 g，置于圓底燒瓶中，加入270 mL 80%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h，過濾殘?jiān)?，重?fù)提取1次，合并濾液，減壓濃縮，將濃縮液于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干燥，得簕菜醇提膏狀物。采用分光光度法[21]，以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品，測得簕菜醇提物中總黃酮為470.91 mg/100 g；采用福林酚法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測得簕菜醇提物中總酚類為9.253 g/100 g；以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測得簕菜醇提取物中總皂苷（以人參皂苷Re計(jì)）的含量為910 mg/100 g。

1.2.1.2 水提物制備 稱量干燥粉碎后過100目篩的簕菜莖葉粉30 g，置于圓底燒瓶中，加入270 mL蒸餾水，80 ℃水浴回流提取2 h，過濾殘?jiān)?，重?fù)提取1次，合并濾液，減壓濃縮，將濃縮液于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干燥，得簕菜水提膏狀物。參照苯酚-硫酸法[22]，以無水葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，測得簕菜水提物粗多糖為105.2 mg/g。

1.2.2 大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒時(shí)間的測定 取56只大鼠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成8組，每組7只。8個(gè)組分別是：酒精模型組、陽性對(duì)照組（海王金樽）（0.27 g/kg），簕菜醇提物低劑量組（0.4 g/kg）、中劑量組（0.8 g/kg）和高劑量組（1.6 g/kg），簕菜水提物低劑量（0.4 g/kg）、中劑量（0.8 g/kg）和高劑量組（1.6 g/kg）。

各組大鼠禁食不禁水12 h，海王金樽組、簕菜提取物組分別按0.1 mL/10 g灌胃給予藥物和不同濃度簕菜提取物，酒精模型組按照0.1 mL/10 g灌胃給予蒸餾水。30 min后，酒精模型組、陽性對(duì)照組、簕菜干預(yù)組按13 mL/kg體重用56o白酒灌胃。記錄給酒、給藥時(shí)間，以及大鼠翻正反射消失時(shí)間（以大鼠腹部朝上，背部朝下，如果大鼠能夠保持該狀態(tài)>30 s，說明大鼠的翻正反射消失，即醉酒）和翻正反射恢復(fù)時(shí)間（經(jīng)過一段時(shí)間，大鼠能夠翻身），計(jì)算酒精耐受時(shí)間（翻正反射消失時(shí)間?給酒時(shí)間）、睡眠時(shí)間（翻正反射恢復(fù)時(shí)間?翻正反射消失時(shí)間）、醒酒時(shí)間（翻正反射恢復(fù)時(shí)間?給酒時(shí)間）[23]。

1.2.3 大鼠血液中乙醇濃度和ALT、AST活性的測定 另取56只大鼠，分組及給受試物同“1.2.2”項(xiàng)，外加空白對(duì)照組，從灌胃白酒開始計(jì)時(shí)，分別在0.5、1、2、4 h對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶取血，每份血樣取500 μL于10 mL離心管中，加入500 μL 20%三氯乙酸除蛋白，6000 r/min離心5 min，取上清液，采用酸性重鉻酸鹽氧化法[24]檢測血液中乙醇的質(zhì)量濃度。4 h眼眶取血，3000 r/min 4 ℃離心5 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定ALT和AST活性。

1.2.4 大鼠肝組織中各項(xiàng)指標(biāo)的測定 另取56只大鼠，分組及給受試物同“1.2.2”項(xiàng)，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，從給藥第1 d起，每次給藥后30 min，除正常對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水外，其余各組動(dòng)物均按13 mL/kg劑量灌胃56o白酒[25]。于第8 d處死大鼠，取出肝臟，制備肝組織勻漿，5000 r/min離心，取上清液，按照試劑盒說明書測ADH、ALDH和SOD活性及GSH、MDA含量，每只大鼠肝組織包埋1份樣本后做HE檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用（x ˉ±s）表示，同一指標(biāo)組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 簕菜提取物對(duì)大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒時(shí)間的影響

由表1可見，與酒精模型組比較，除水提物低劑量組對(duì)酒精耐受時(shí)間無顯著變化（P>0.05）外，陽性對(duì)照組、簕菜醇提物各劑量組和簕菜水提物中、高劑量組均可極顯著延長酒精耐受時(shí)間，并縮短睡眠、醒酒時(shí)間（P<0.05，P<0.01）。但醇提物中劑量、高劑量組和水提物中劑量、高劑量組對(duì)大鼠酒精耐受、睡眠、醒酒時(shí)間的影響不存在量效關(guān)系，且簕菜醇提物防醉酒作用優(yōu)于簕菜水提取物，其原因可能與簕菜醇提物中含有總黃酮、總多酚、總皂苷等多個(gè)解酒護(hù)肝功能組分有關(guān)。

2.2 簕菜提取物對(duì)大鼠血液乙醇含量的影響

如表2所示，與模型組比較，陽性對(duì)照組、簕菜醇提物低、中、高劑量組和簕菜水提物低、中、高劑量組在0.5、1、2、4 h時(shí)均可極顯著降低大鼠血液中乙醇質(zhì)量濃度（P<0.01）。簕菜提取物各劑量組均能降低大鼠血液中乙醇含量，其機(jī)制與大鼠肝臟中促進(jìn)酒精代謝的ALD和ALDH酶活性升高有關(guān)（結(jié)果見2.4）。

表 1 簕菜提取物對(duì)大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒時(shí)間的影響（x ˉ±s，n=7）Table 1 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the drunkenness, sleep and sobering times of SD rats (x ˉ±s, n=7)

表 2 簕菜提取物對(duì)大鼠血液中乙醇含量的影響（x ˉ±s，n=7）Table 2 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the ethanol content in rat blood (x ˉ±s, n=7)

2.3 簕菜提取物對(duì)大鼠血清ALT和AST活力的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組大鼠血清ALT和AST活力極顯著升高（P<0.01）；提示本實(shí)驗(yàn)采用白酒灌胃復(fù)制酒精性肝損傷模型建立成功，說明乙醇灌胃造模已造成大鼠肝細(xì)胞線粒體的損害[26]。與模型組比較，水提物低劑量組大鼠血清AST活力無顯著變化（P>0.05），水提物中劑量組兩者活力顯著降低（P<0.05），陽性對(duì)照組和簕菜其它各劑量組兩者活力極顯著降低（P<0.01）。

在正常生理狀態(tài)下，血清中ALT、AST的活性不高，但當(dāng)肝功能異常以及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，ALT、AST就會(huì)由破損處釋放入血液，導(dǎo)致血中含量升高，肝中含量降低，臨床上將血清中ALT、AST水平作為判斷肝損傷程度的“金指標(biāo)”[27?28]。表3結(jié)果表明，簕菜提取物能在一定程度上通過降低大鼠血清中的ALT、AST活力，減少酒精對(duì)肝細(xì)胞的損傷，起到較好的護(hù)肝作用，簕菜醇提物效果優(yōu)于簕菜水提物，其原因可能是簕菜醇提物中含有總黃酮、總多酚、總皂苷等多個(gè)解酒護(hù)肝功能組分有關(guān)。

2.4 簕菜提取物對(duì)大鼠肝組織酒精代謝酶ADH和ALDH活性的影響

表4 可見，與空白組比較，模型組大鼠肝組織中ADH、ALDH活性極顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、各簕菜提取物干預(yù)組均可極顯著提高兩者活性（P<0.01）。

人體攝入的乙醇約有90%是在肝臟內(nèi)分解代謝的，乙醇在肝臟內(nèi)可以被ADH、CAT等代謝系統(tǒng)氧化為乙醛，然后在線粒體中通過ALDH將乙醛催化為乙酸，乙酸以乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)代謝，分解為二氧化碳和水[29]。因此，檢測酒精代謝酶ADH和ALDH是評(píng)價(jià)藥物解酒功能的重要方法[25]。以上結(jié)果表明，簕菜醇提物和水提物均能顯著提高醉酒大鼠肝臟中酒精代謝酶ADH、ALDH的活性，促進(jìn)酒精的代謝。

2.5 簕菜提取物對(duì)大鼠肝組織GSH、MDA含量和SOD活性的影響

表5 顯示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織GSH含有量、SOD酶活力顯著降低（P<0.01），而MDA含量極顯著升高（P<0.01），表明酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生了一定程度的損傷。與模型組比較，陽性對(duì)照組、各簕菜提取物干預(yù)組中肝組織GSH含有量極顯著增加（P<0.01），MDA含量極顯著減少（P<0.01）。

正常肝臟內(nèi)存在SOD、GSH能夠清除自由基起到抗氧化的作用，而酒精的攝入引起自由基攻擊健康肝細(xì)胞，消耗大量的SOD、GSH，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，其中MDA起關(guān)鍵作用，生成大量過氧化物的產(chǎn)物MDA[30]。以上結(jié)果表明，簕菜醇提物和水提物均能增強(qiáng)肝損傷大鼠肝臟的抗氧化能力，從而起較好的保肝作用。

表 3 簕菜提取物對(duì)大鼠血清中ALT和AST活力的影響（x ˉ±s，n=7）Table 3 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the activities of ALT and AST in rat serum (x ˉ±s, n=7)

表 4 簕菜提取物對(duì)大鼠肝組織ADH、ALDH活性的影響（x ˉ±s，n=7）Table 4 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the activity of ADH, ALDH in rat liver tissue (x ˉ±s, n=7)

表 5 簕菜提取物對(duì)大鼠肝組織GSH、MDA含量和SOD活性的影響（x ˉ±s，n=7）Table 5 Effect of Acanthopanax trifoliatus extract on the contents of GSH,MDA and the activity of SOD in rats liver tissue (x ˉ±s, n=7)

2.6 簕菜提取物對(duì)大鼠肝臟病理組織學(xué)變化的影響

由HE染色結(jié)果可以看出，空白對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，核結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞索清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚（圖1A）；酒精模型組大鼠肝細(xì)胞彌漫性氣球樣變，胞漿疏松化，細(xì)胞核固縮，肝細(xì)胞灶狀壞死（圖1B）；陽性對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇正常，未見肝細(xì)胞壞死區(qū)（圖1C）；簕菜醇提物低、中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞肝細(xì)胞索排列尚整齊，肝細(xì)胞灶狀壞死程度較輕（圖1D、E、F）；簕菜水提物低、中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞索排列尚整齊，肝竇正常，肝細(xì)胞灶狀壞死程度較輕（圖1G、H、I）。以上結(jié)果表明，海王金樽、簕菜醇提物和水提物均能一定程度減輕酒精對(duì)肝細(xì)胞損傷，其中海王金樽、高劑量簕菜醇提物、高劑量水提物對(duì)酒精性肝損傷的緩解作用較佳。

圖 1 簕菜提取物對(duì)急性酒精中毒大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)變化的影響（HE, 400×）Fig.1 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the pathological changes of liver in rats with acute alcoholism (HE, 400×)

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，簕菜醇提物和水提物均可顯著延長大鼠酒精耐受時(shí)間，縮短睡眠、醒酒時(shí)間（P<0.05），對(duì)延長大鼠酒精耐受時(shí)間方面，醇提物的效果優(yōu)于水提物；簕菜醇提物和水提物均可降低大鼠血液中乙醇質(zhì)量濃度，提高大鼠肝組織中乙醇代謝酶ADH和ALDH的活性；兩種提取物均能顯著抑制酒精引起的大鼠血清ALT和AST活性升高（P<0.05），對(duì)降低AST活性而言，醇提物的效果優(yōu)于水提物；兩種提取物均可使大鼠肝臟組織GSH含量升高，MDA含量降低，SOD活性增強(qiáng)；兩種提取物均可在一定程度上減輕酒精引起的肝細(xì)胞變性程度?？傮w而言，簕菜醇提物的解酒護(hù)肝作用優(yōu)于水提物，這與野葛葉[23]的研究結(jié)果相似。已有研究結(jié)果表明，對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的保健食品最常用的5種功效成分分別是總黃酮、粗多糖、葛根素、總皂苷、?；撬醄26]。由此推測，簕菜醇提物的解酒護(hù)肝作用優(yōu)于水提物，可能是簕菜醇提物中含有較高含量總黃酮、總多酚、總皂苷等功效成分，這些成分共同作用，而簕菜水提物的主要功效成分為粗多糖的原因所致。

綜上所述，簕菜提取物通過加速乙醇代謝促解酒、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和減緩肝組織細(xì)胞損傷等方面，從而起到較好的解酒護(hù)肝作用。本研究為簕菜提取物的合理開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。今后，可對(duì)簕菜醇提物、水提物進(jìn)一步篩選，對(duì)其解酒護(hù)肝活性組分進(jìn)行深入研究，明確其有效功能成分，開發(fā)簕菜解酒護(hù)肝功能食品。