王 藤，施婭楠，李 祥，黃艾祥,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)有限公司，云南曲靖 655000）

大河烏豬因其肉質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特聞名[1?2]。大河烏豬火腿是采用10 kg以上的新鮮后腿為原料，經(jīng)預(yù)冷排酸、上鹽腌制、脫水平衡、掛曬發(fā)酵等加工而成。風(fēng)味是干腌火腿最重要的指標(biāo)之一，不同揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成賦予產(chǎn)品不同的風(fēng)味特征[3]。有關(guān)火腿風(fēng)味的研究主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-嗅味計(jì)技術(shù)及電子鼻技術(shù)等。Théron等[4]利用GC-MS結(jié)合GC-O分析及鑒定巴約那火腿中的揮發(fā)性物質(zhì)和氣味活性成分。食品的揮發(fā)性化合物不僅與含量有關(guān)，還與感覺閾值有關(guān)。相對(duì)氣味活度值（ROAV）法是一種確定食品中關(guān)鍵揮發(fā)性化合物的方法[5]；Sun等[6]通過ROAV法確定了燉雞的風(fēng)味成分。

目前，許多學(xué)者對(duì)宣威火腿、金華火腿中的理化成分、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[7?9]、加工工藝進(jìn)行了研究[10?12]，而對(duì)大河烏豬火腿的研究卻很鮮見，Shi等[13]揭示了大河烏豬火腿腌制24 d后自然發(fā)酵過程中風(fēng)味化合物的變化。其次，腌制具有改善肉的色、香、味，防腐的作用，有關(guān)肉制品腌制的報(bào)道主要集中于比較不同腌制方式對(duì)肉制品的腌制效果[14]及腌制對(duì)肉制品食用品質(zhì)的影響[15]，而腌制時(shí)間對(duì)肉制品風(fēng)味物質(zhì)影響的研究鮮有報(bào)道，譚汝成[16]研究表明腌制能促進(jìn)前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和風(fēng)味物質(zhì)的形成。

因此，本研究采用SPEM-GC-MS結(jié)合ROAV對(duì)大河烏豬干腌火腿在4個(gè)不同腌制時(shí)間（15、18、21、24 d）加工過程中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，研究不同腌制時(shí)間對(duì)揮發(fā)性化合物的變化及形成的影響，以期為大河烏豬干腌火腿加工工藝優(yōu)化及品質(zhì)控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大河烏豬火腿10±1 kg，云南東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)有限公司提供；甲醇色譜級(jí) 美國(guó)Sigma公司。

含SPME裝置的多功能樣品處理平臺(tái)、SPME萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS） 美國(guó)Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大河烏豬干腌火腿的生產(chǎn) 新鮮后腿：10±1 kg的大河烏豬鮮后腿；

預(yù)冷排酸：3±1 ℃、RH=85%~90%室內(nèi)冷涼18 h以上，使腿中心溫度3~4 ℃；

俢割整形：用快刀剔除“吊肉”，刮盡殘毛，擠出血水，將腿修割成橢圓形、肌肉外露；

低溫上鹽腌制：采用上鹽堆碼干腌腌制，按每只鮮腿重的5.5%稱取食鹽，再按食鹽總重50%、30%、20%的比例，分別在第1、3、15 d搓揉上鹽并翻堆后堆碼腌制，腌制條件（3±1 ℃、RH=85%）；

中溫脫水平衡：60 d，6±1 ℃、RH=75%~80%；

高溫發(fā)酵產(chǎn)香：270 d，23±1 ℃、RH=65%；

質(zhì)檢成品。

1.2.2 火腿采樣 從腌制時(shí)間為（15、18、21、24 d）的4個(gè)組中分別隨機(jī)抽取4只火腿樣品，共計(jì)16只，將半膜肌和股二頭肌混合，真空包裝并保存在

?20 ℃。

1.2.3 SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析頂空固相微萃取條件 參照Huan等[17]的方法，稱取已攪碎的肉樣5.00 g于20 mL頂空瓶中；將老化后的萃取頭插入頂空瓶上部，50 ℃吸附40 min，210 ℃解析5 min。

GC條件參照高韶婷等[18]的方法，略做修改。色譜柱：DB-5 MS毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min升至250 ℃并保持7 min；載氣He（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比1:30。

MS條件傳輸線溫度280 ℃，離子源EI，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，數(shù)據(jù)采集模式為全掃描（Scan），質(zhì)量掃描范圍m/z 50~450 amu。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定 揮發(fā)性物質(zhì)的定性：揮發(fā)性化合物利用NIST08.L譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)得到的譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行串聯(lián)檢索和人工解析，獲得未知化合物與質(zhì)譜庫中已知化合物的匹配度，匹配度大于80即初步確定未知物為該物質(zhì)。

揮發(fā)性物質(zhì)的定量：采用峰面積歸一化法[19]。

關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)評(píng)定方法：采用相對(duì)香氣活度值法（relative odor activity value，ROAV）[20]。

式中：ROAVi為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)氣味活度值；Ci為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量；Tstan為氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值；Cstan為氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量；Ti為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SIMCA14.1、OriginPro2019b繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腌制時(shí)間對(duì)大河烏豬火腿揮發(fā)性成分的影響

不同腌制時(shí)間下的大河烏豬火腿的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果如表1所示；腌制時(shí)間對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對(duì)含量的影響如表2所示。

從表1~表2可見：4個(gè)不同腌制期的揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量均存在差異。共鑒定出77種揮發(fā)性化合物，包括醛類15種、醇類13種、烴類10種、酮類4種、酯類5種、酸類8種、芳香族化合物9種、其他13種；且腌制15、18、21、24 d的揮發(fā)性成分的種類分別為57、57、54、41種。不同腌制時(shí)間的大河烏豬火腿共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包括醛類（異戊醛、己醛等）；醇類（乙醇、正己醇等）；酮類（2,3-辛二酮等）；酸類（丁酸、異戊酸、己酸等）。醛類和醇類在每個(gè)腌制期中二者含量之和超過揮發(fā)性風(fēng)味成分總量的一半。此外，有些物質(zhì)隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)而消失，例如反-2-辛烯醛、肉豆蔻醛、1-戊醇等。

表 1 不同腌制時(shí)間的大河烏豬火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Volatile compounds of Dahe black pig ham under different curing time

表 2 腌制時(shí)間對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對(duì)含量的影響Table 2 Effects of curing time on the types and relative content of volatile flavor substances

續(xù)表 1

在4個(gè)腌制期中，檢測(cè)到醛類物質(zhì)的相對(duì)含量最多，此結(jié)果與Sabio等[23]在研究巴約訥、伊比利亞火腿時(shí)得出的結(jié)果一致。己醛、壬醛是大河烏豬火腿中含量最豐富的醛類，研究結(jié)果與伊斯特拉火腿的典型特征風(fēng)味物質(zhì)相似[24]。此外，醛類化合物含量隨著腌制期的延長(zhǎng)沒有規(guī)律性，分別為52.08%、40.84%、64.26%、34.91%，推測(cè)由于醛類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)活潑，在腌制過程中受溫度、時(shí)間等影響，導(dǎo)致其相對(duì)含量變化。醇類化合物主要來自脂質(zhì)氧化、氨基酸降解[25]。醇類化合物的相對(duì)含量隨著腌制時(shí)間而增加，可能是腌制過程中食鹽的生物滲透作用能夠加速酯類氧化，NaCl破壞細(xì)胞膜的完整性，促使氧化劑進(jìn)入脂質(zhì)基質(zhì)來促進(jìn)脂質(zhì)氧化[26]。本研究共鑒定出13種醇，含量最豐富的是1-辛烯-3-醇，與Radov?i?等[27]的報(bào)道一致，其已被鑒定為金華火腿、如皋火腿、盤縣火腿的特征風(fēng)味[28?29]。來自于脂肪酸烷氧自由基均裂的烴類物質(zhì)[29]閾值較高。隨腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，烴類物質(zhì)的種類幾乎保持不變，當(dāng)腌制期為21 d時(shí)，其相對(duì)含量最低，為2.24%，其相對(duì)含量突然驟降是由于1,1,3,3-四乙氧基丙烷在其余3個(gè)腌制期中含量較高但在此階段未檢出。

酮類化合物來源于微生物代謝、脂肪氧化，具有奶油味、果香味[30]。在大河烏豬火腿中，酮類物質(zhì)含量較低，且2-壬酮為主要酮類物質(zhì)。由酸和醇經(jīng)酯化作用而成的酯類大多具有果香味。本研究中，隨腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，酯類化合物相對(duì)含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，推測(cè)原因可能是在腌制15、18、21 d時(shí)，生成的酯類含量大于酯類氧化消耗的，而腌制24 d時(shí)，酯類氧化的速度加快，所消耗的量增多。酸類化合物來源于甘油和磷酸的氧化降解、美拉德反應(yīng)[31]。在4個(gè)腌制期均檢測(cè)到了丁酸、異戊酸、己酸、辛酸、癸酸。隨腌制時(shí)間的增加，酸類物質(zhì)的相對(duì)含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且在18 d達(dá)最大值，為5.68%?？赡苡捎陔缰茣r(shí)間低于18 d時(shí)，原料表面的微生物作用產(chǎn)酸使火腿中的酸類物質(zhì)增加，而隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，火腿中的食鹽濃度達(dá)到一定程度，從而發(fā)揮防腐作用，抑制微生物的生長(zhǎng)[32]。苯類物質(zhì)具有較高的閾值，對(duì)火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。不同腌制時(shí)間下加工的大河烏豬火腿分別檢測(cè)出7、6、2、5種芳香族類風(fēng)味物質(zhì)，苯乙烯和4-甲基苯酚是4個(gè)腌制期均存在的風(fēng)味物質(zhì)。

在其他類中，鑒定出多種雜環(huán)類化合物、吡嗪類等。雜環(huán)類化合物由于通過硫胺素的降解、氨基酸的熱解形成，多數(shù)具有肉香。其次，吡嗪類化合物賦予肉品堅(jiān)果及烘烤香味[33]。在大河烏豬火腿中，檢測(cè)到的吡嗪類物質(zhì)有2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪。在盤縣火腿、金華火腿中均鑒定出多種雜環(huán)類化合物、吡嗪類物質(zhì)[28?29]。

2.2 揮發(fā)性化合物聚類分析（HCA）

為進(jìn)一步觀察4個(gè)腌制期的火腿樣品組間和組內(nèi)的相似程度與差異，采用SIMCA14.1繪制聚類圖，以77種風(fēng)味物質(zhì)含量為變量，其聚類分析結(jié)果顯示（圖1），由圖（樣品編號(hào)1~4、5~8、9~12、13~16分別表示腌制15、18、21、24 d的火腿樣品）4個(gè)不同腌制時(shí)間的大河烏豬火腿樣品被聚為2大類（腌制15、18 d和腌制21、24 d聚在一起）和4個(gè)小類（1~4、5~8、9~12、13~16聚在一起），說明4個(gè)不同腌制時(shí)間的火腿樣品具有明顯差異，即揮發(fā)性物質(zhì)的組成及相對(duì)含量存在較大的差異。故利用聚圖能很好地區(qū)分不同腌制時(shí)間大河烏豬火腿的揮發(fā)性風(fēng)味。

圖 1 不同腌制時(shí)間下大河烏豬火腿的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Dahe black pig ham under different curing time

2.3 ROAV鑒定不同腌制時(shí)間的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)

結(jié)合各風(fēng)味物質(zhì)的感覺閾值，計(jì)算ROAV值，進(jìn)一步確定大河烏豬火腿的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。通過相關(guān)文獻(xiàn)共找到38種揮發(fā)性物質(zhì)的氣味閾值（見表1）[21?22]。因此，本實(shí)驗(yàn)只對(duì)查詢到閾值的風(fēng)味物質(zhì)做出分析。當(dāng)0.1≤ROAV<1時(shí)，該揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)火腿的總體風(fēng)味起輔助作用；ROAV≥1時(shí)，該揮發(fā)性物質(zhì)為火腿的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)；在不同腌制時(shí)間大河烏豬火腿的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中（表1），壬醛的相對(duì)含量較高，且閾值只有1 μg/kg，故對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。以壬醛作為基準(zhǔn)物來計(jì)算其他揮發(fā)性化合物的ROAV，則壬醛的ROAV為100。對(duì)各相關(guān)組分的ROAV分析結(jié)果如表3。

由表3可知，4個(gè)不同腌制時(shí)間的大河烏豬火腿中，ROAV≥0.1的共有11種醛類、3種醇類、2種烴類、2種酮類、2種芳香族化合物、1種呋喃類。腌制15、18、21、24 d火腿的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)（ROAV≥1）分別為11、10、10、9種。異戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2,3-辛二酮是4個(gè)不同腌制時(shí)期的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)；其中，醛類為主要的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，醛類主要呈堅(jiān)果味、油脂味、青草味且多數(shù)醛類物質(zhì)對(duì)火腿風(fēng)味起積極貢獻(xiàn)的作用[33]。其次，對(duì)大河烏豬火腿有重要修飾作用的風(fēng)味物質(zhì)分別為苯甲醛、2-正戊基呋喃。當(dāng)腌制期18 d時(shí)，己醛的ROAV值是4個(gè)腌制期中最低的，為21.85。已醛呈強(qiáng)烈的生油脂味，含量過多則會(huì)使人發(fā)嘔。由此可見，大河烏豬火腿風(fēng)味形成與腌制密切相關(guān)。

表 3 不同腌制時(shí)間下大河烏豬火腿關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)及對(duì)應(yīng)的ROAVTable 3 Key flavor compounds of Dahe black pig ham and corresponding ROAV under different curing time

2.4 關(guān)鍵揮發(fā)性化合物的PCA

為進(jìn)一步研究4個(gè)腌制期對(duì)大河烏豬干腌火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，選取14種對(duì)大河烏豬干腌火腿揮發(fā)性風(fēng)味有貢獻(xiàn)（ROAV≥1）的化合物進(jìn)行PCA，得分圖和載荷圖分別如圖2所示。

由圖2可知，4個(gè)腌制時(shí)間的PC1貢獻(xiàn)的方差為55.83%，PC2貢獻(xiàn)的方差為27.84%，前兩個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為83.67%，能較好地反映原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息。其中，PC1中載荷正向最高的物質(zhì)為1-辛烯-3-醇，載荷負(fù)向最高的物質(zhì)為異戊醛；PC2中載荷正向最高的物質(zhì)為正辛醛，載荷負(fù)向最高的物質(zhì)為雙戊烯。上述結(jié)果說明1-辛烯-3-醇、異戊醛、正辛醛、雙戊烯是不同腌制期火腿中含量變化最明顯的揮發(fā)性物質(zhì)，因此，可以根據(jù)上述物質(zhì)區(qū)分不同腌制時(shí)間的大河烏豬火腿。

不同腌制時(shí)間的大河烏豬火腿總體可分為4類，腌制15、18、21、24 d的樣品各自聚為一類且具有較明顯的分離趨勢(shì)，說明這4個(gè)腌制期關(guān)鍵中風(fēng)味物質(zhì)含量和種類存在較大差異，與聚類（圖1）結(jié)果一致，表明腌制時(shí)間對(duì)大河烏豬火腿的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有一定影響。

圖 2 不同腌制時(shí)間下大河烏豬火腿關(guān)鍵揮發(fā)性化合物主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of key volatile compounds of Dahe black pig ham under different curing time

3 結(jié)論

腌制時(shí)間影響大河烏豬火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成，腌制15、18、21、24 d的揮發(fā)性成分的種類分別為57、57、54、41種，共鑒定出醛類、醇類、烴類等揮發(fā)性化合物共77種，醛類物質(zhì)相對(duì)含量最多；聚類分析表明4個(gè)不同腌制時(shí)間的火腿樣品具有明顯差異，即揮發(fā)性物質(zhì)的組成及相對(duì)含量存在較大的差異；ROAV分析表明腌制15、18、21、24 d的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物（ROAV≥1）的種類分別為11、10、10、9種；異戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2,3-辛二酮為關(guān)鍵揮發(fā)性化合物；PCA表明1-辛烯-3-醇、異戊醛、正辛醛、雙戊烯是不同腌制期火腿中相對(duì)含量變化最明顯的揮發(fā)性物質(zhì)。本研究結(jié)果可為大河烏豬火腿工藝技術(shù)的優(yōu)化和風(fēng)味品質(zhì)的改良提供理論依據(jù)。