王迎香，唐子惟，彭 騰，陳胡蘭，高天宇，何沛煜，張軍銀

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137）

黃精，傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎功能。明代繆希雍撰寫的藥學(xué)著作《本草經(jīng)疏》中曾記載：“雖非治療之所急，而為養(yǎng)性之上藥。故仙經(jīng)累贊其能服餌駐顏，久而彌勝矣”。黃精因性平、無(wú)毒，在2002年被收錄在藥食同源目錄中，一直延續(xù)至今。經(jīng)過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃精多糖能夠抑制腫瘤，提高動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)糖尿病模型有顯著作用[1?5]。黃精水煎液提取物對(duì)體外皮膚紫外線實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗衰老作用[6]，提示在人體保健方面具有延緩衰老功效。此外，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[7]對(duì)黃精有效成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，黃精可用于抗疲勞。有研究對(duì)保健食品進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)中藥類保健品占據(jù)較大的市場(chǎng)份額。其中以增強(qiáng)免疫力功能的保健食品占額最多，黃精的添加使用頻率高達(dá)中藥類原料排名前20[8?9]。現(xiàn)已有黃精代泡茶、黃精粉等產(chǎn)品用于食品營(yíng)養(yǎng)。黃精中主要活性成分為多糖類，多糖含量的測(cè)定是黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的重要考察項(xiàng)目。因此，準(zhǔn)確測(cè)量黃精的多糖含量對(duì)保健食品的應(yīng)用開(kāi)發(fā)具有深遠(yuǎn)意義。

植物多糖為天然高分子化合物，因其復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)而具有廣泛的活性作用[10?11]，添加于保健食品的多糖對(duì)腸道調(diào)節(jié)有積極影響[12?14]。測(cè)定多糖的方法涵括比色法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，其中比色法因操作方便而被廣泛采用。有學(xué)者[15?16]探究比色法測(cè)定原理，比色法通常利用濃硫酸與多糖樣品混合進(jìn)行短時(shí)間的水解反應(yīng)，生成寡糖和單糖，再與顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行吸光度測(cè)定。此過(guò)程中，濃硫酸水解的完全、顯色劑的選擇等條件對(duì)多糖的測(cè)量都表現(xiàn)出影響。在測(cè)量黃精多糖時(shí)蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法使用頻率最高。

兩種方法原理相似，但反應(yīng)條件不同，顯色劑不同，二者用于測(cè)量其他藥材多糖含量時(shí)存在差異[17]。蒽酮-硫酸法測(cè)定黃精多糖收錄于2020年藥典一部，但該方法穩(wěn)定性需要控制好測(cè)定條件，如蒽酮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定需現(xiàn)用現(xiàn)配、注意避光等問(wèn)題[18]。本課題組前期多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顯色前配制蒽酮時(shí)間過(guò)早，對(duì)測(cè)定吸光度影響較大，管控配制時(shí)間過(guò)于繁瑣。有現(xiàn)代大量研究發(fā)現(xiàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定黃精多糖操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好[19?20]。苯酚-硫酸法測(cè)定多糖技術(shù)雖較為成熟，但在采用苯酚-硫酸法測(cè)定黃精多糖時(shí)存在所用苯酚濃度、硫酸用量、顯色時(shí)間等條件不統(tǒng)一的問(wèn)題，如用過(guò)多的濃硫酸會(huì)糖碳化從而影響吸光度[21]。目前2020版中國(guó)藥典中測(cè)量黃精多糖并未規(guī)范此方法，為建立更合適的苯酚-硫酸測(cè)量黃精多糖的方法，本研究選取苯酚濃度、苯酚用量、硫酸用量、加熱時(shí)間、加熱溫度五個(gè)因素進(jìn)行單因素考察。在此基礎(chǔ)上對(duì)苯酚-硫酸法的測(cè)定條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立適宜酒蒸黃精多糖測(cè)量的最優(yōu)顯色條件，旨在為未來(lái)中國(guó)藥典制定酒黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有力研究基礎(chǔ)，為該藥材資源的合理開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精藥材 采于四川省達(dá)州市大竹縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室龍飛副教授鑒定為百合科多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）的干燥根莖；D-葡萄糖對(duì)照品 四川維克奇生物有限公司；黃酒 紹興舜豐釀酒有限公司；98%濃硫酸 四川西隴科學(xué)有限公司；苯酚 成都市科隆化學(xué)品有限公司；蒽酮 成都市科隆化學(xué)品有限公司。

紫外分光光度計(jì)SPECORD 200 plus 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；手提式中藥粉碎機(jī) 溫嶺林大機(jī)械有限公司；電蒸鍋 廣東山姆斯電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒蒸黃精多糖溶液制備 參照2020年藥典一部方法。

1.2.1.1 酒蒸黃精制備 取凈黃精，照酒蒸法（通則0213）。每100 kg黃精，用黃酒20 kg拌勻，于300 W電蒸鍋上蒸制6 h，晾至室溫，切4 mm厚片，干燥。得到酒蒸黃精飲片，打粉，過(guò)5號(hào)篩，備用。

1.2.1.2 多糖溶液制備 精密稱定酒黃精細(xì)粉0.25 g，加80%乙醇150 mL，水浴加熱回流1 h，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，棄去濾液。將殘?jiān)蜑V紙置于燒瓶中，加水150 mL，沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過(guò)濾，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次，每次10 mL，合并濾液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容，備用。

1.2.2 蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制好葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與蒽酮-硫酸溶液后，參照2020年藥典一部中測(cè)量黃精多糖時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品多糖含量測(cè)定 精密量取多糖溶液1.0 mL，同“1.2.2.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品含量。

1.2.3 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖 參照本課題組已有研究基礎(chǔ)[22]測(cè)量黃精多糖含量。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2 mL刻度線，搖勻，試管置于冰水浴中。試管中加入1 mL苯酚溶液，搖勻后盡快加入7 mL的濃硫酸溶液，搖勻。放冷后于40 ℃水浴中保溫30 min，取出放入冰水水浴5 min，取出后恢復(fù)至室溫。以相應(yīng)顯色試劑作為空白組，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算回歸方程。

1.2.3.2 樣品多糖含量測(cè)定 精密量取多糖溶液1.0 mL，同“1.2.3.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品含量。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度考察試驗(yàn) 分別移取“1.2.1”項(xiàng)下黃精多糖溶液1.0 mL于具塞試管中，按照蒽酮-硫酸法進(jìn)行顯色，以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計(jì)特定波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定吸光度5次，計(jì)算RSD值，考察精密度。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.2 重現(xiàn)性考察試驗(yàn) 分別移取5份“1.2.1”項(xiàng)下黃精多糖溶液1.0 mL于具塞試管中，按照蒽酮-硫酸法進(jìn)行顯色，以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計(jì)特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值，考察重現(xiàn)性。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.3 穩(wěn)定性考察試驗(yàn) 分別移取“1.2.1”項(xiàng)下黃精多糖溶液1.0 mL于具塞試管中，按照蒽酮-硫酸法進(jìn)行顯色，以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計(jì)特定波長(zhǎng)下進(jìn)行時(shí)間-吸光度曲線的掃描，考察穩(wěn)定性。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.4 加樣回收率考察試驗(yàn) 精密量取5份已測(cè)含量的黃精多糖溶液，分別加入已知含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照蒽酮-硫酸法進(jìn)行顯色，以相應(yīng)空白組為參比，在紫外分光光度計(jì)特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。苯酚-硫酸法同上。

1.2.5 苯酚-硫酸法工藝優(yōu)化 選擇苯酚-硫酸法進(jìn)行深入工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)已有研究[23?25]選定五個(gè)單因素條件進(jìn)行試驗(yàn)。按照“1.2.3”項(xiàng)苯酚-硫酸法顯色條件，進(jìn)行單因素對(duì)吸光度的影響考察。在固定苯酚用量1.0 mL、苯酚濃度5%、硫酸用量7 mL、加熱溫度50 ℃、加熱時(shí)間20 min的條件下，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平：苯酚用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）、加熱時(shí)間（10、15、20、25、30 min）、加熱溫度（40、50、60、70、80 ℃）、苯酚濃度（3%、4%、5%、6%、7%）、硫酸用量（5、6、7、8、9 mL）。

1.2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取苯酚用量（A）、苯酚濃度（B）、硫酸用量（C）3個(gè)因素為自變量，結(jié)合Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken分析，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)苯酚-硫酸法測(cè)定黃精多糖含量條件進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)因素見(jiàn)表1。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken experimental designs

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS23.0進(jìn)行顯著性篩選，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大波長(zhǎng)的確定

兩種方法顯色后，以相應(yīng)試劑為空白，于分光光度計(jì)上進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，見(jiàn)圖1~圖2。在400~800 nm的可見(jiàn)光范圍內(nèi)，苯酚-硫酸法最大吸收波長(zhǎng)為489 nm，但多次掃描過(guò)程中波峰出現(xiàn)平峰，集中在488~491 nm區(qū)間，為規(guī)范化操作故參照文獻(xiàn)中苯酚-硫酸測(cè)定方法取490 nm進(jìn)行試驗(yàn)。蒽酮-硫酸法最大吸收波長(zhǎng)為580 nm，參照中國(guó)藥典中蒽酮-硫酸測(cè)定方法取582 nm進(jìn)行試驗(yàn)。

圖 1 蒽酮-硫酸法波長(zhǎng)掃描Fig.1 Wavelength scanning of anthrone sulfuric acid method

圖 2 苯酚-硫酸法波長(zhǎng)掃描Fig.2 Wavelength scanning of anthrone sulfuric acid method

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 蒽酮-硫酸法 按“1.2.2.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。擬合得到線性回歸方程y=0.0269x+0.0739，R2=0.9991。表明該線性方程在葡萄糖濃度3.3~26.4 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖 3 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of anthrone sulfuric acid method

2.2.2 苯酚-硫酸法 按“1.3.3.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。擬合得到線性回歸方程y=0.0689x?0.0225，R2=0.9992。表明該線性方程在葡萄糖濃度3.5~14 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖 4 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of phenol sulfuric acid method

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

分別采用兩種方法對(duì)黃精多糖進(jìn)行顯色反應(yīng)，連續(xù)測(cè)量吸光度值5次，測(cè)得吸光度分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 顯示，連續(xù)測(cè)定5次吸光度后，苯酚-硫酸法的RSD=0.01%，蒽酮-硫酸法的RSD=0.20%，表明苯酚-硫酸法相比蒽酮-硫酸法精密度高。

2.4 重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果

分別采用兩種方法對(duì)5份黃精多糖進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定吸光度值，測(cè)得吸光度分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 顯示，對(duì)5份黃精多糖溶液進(jìn)行吸光度測(cè)定后，苯酚-硫酸法的RSD=1.73%，蒽酮-硫酸法的RSD=1.84%，表明苯酚-硫酸法相比蒽酮-硫酸法重現(xiàn)性好。

2.5 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

采用兩種方法分別對(duì)黃精多糖溶液進(jìn)行顯色，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行時(shí)間掃描，掃描時(shí)間為120 min，掃描結(jié)果如圖5。

圖 5 時(shí)間掃描曲線Fig.5 Time scan curve

圖5 時(shí)間掃描顯示，顯色后吸光度在120 min內(nèi)波動(dòng)較小，說(shuō)明兩種方法顯色的黃精多糖吸收曲線受環(huán)境溫度和時(shí)間的影響變化不大，在120 min內(nèi)保持穩(wěn)定。二者相比之下，苯酚-硫酸法波動(dòng)較蒽酮-硫酸法更加微小，穩(wěn)定性好。

2.6 加樣回收率測(cè)試結(jié)果

精密稱取已知多糖含量的黃精粉末，分為兩組平行實(shí)驗(yàn)。加入精密稱定的葡萄糖對(duì)照品，設(shè)置五水平，平行重復(fù)三次。分別采用兩種顯色方法進(jìn)行吸光度測(cè)量，計(jì)算平均回收率，測(cè)試結(jié)果如表4。

表4 顯示，蒽酮-硫酸法平均回收率低于苯酚-硫酸法。蒽酮-硫酸法的RSD=1.38%，遠(yuǎn)高于苯酚-硫酸法，表明苯酚-硫酸法所測(cè)結(jié)果相對(duì)更加穩(wěn)定，苯酚-硫酸法用于多糖顯色更加可行。

綜合方法學(xué)考察結(jié)果，蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法各項(xiàng)RSD都在規(guī)定范圍內(nèi)，兩種方法可靠、可行。二者RSD結(jié)果對(duì)比來(lái)看，苯酚-硫酸法每一項(xiàng)都低于蒽酮-硫酸法，表明用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量更精確度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好、加樣回收率高。綜合實(shí)際操作性，苯酚-硫酸法加熱溫度和時(shí)間都低于蒽酮-硫酸法，處理樣品時(shí)更加方便快捷。因此，下一步將進(jìn)行苯酚-硫酸法顯色條件優(yōu)化。

表 2 精密度測(cè)試結(jié)果Table 2 Precision test results

表 3 重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果Table 3 Reproducibility test results

表 4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery test results

2.7 多糖含量測(cè)定

用兩種方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，以相應(yīng)的顯色試劑為空白組，帶入線性方程計(jì)算結(jié)果，蒽酮-硫酸法測(cè)得含量為8.01%，苯酚-硫酸法測(cè)得含量為7.89%。

2.8 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8.1 苯酚用量對(duì)吸光度影響 不同苯酚用量對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖6。加入5%濃度苯酚，用量從0.5 mL增加到1.5 mL時(shí)，溶液吸光度迅速升高，且達(dá)到極值。繼續(xù)增大苯酚用量，達(dá)到1.5 mL后吸光度趨于平緩，后有下降趨勢(shì)。這與參考文獻(xiàn)[21]得到的結(jié)果一致，推測(cè)在低用量時(shí)吸光度與反應(yīng)底物呈正相關(guān)，苯酚用量達(dá)到飽和后吸光度不再增加。后呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，推測(cè)是多糖與濃硫酸反應(yīng)的同時(shí)過(guò)多的苯酚與濃硫酸產(chǎn)生磺基化反應(yīng)[26]，導(dǎo)致多糖未完全脫水形成糖醛衍生物與苯酚結(jié)合顯色。雖然苯酚與濃硫酸反應(yīng)生成物含有顯色團(tuán)，但相比于糖與苯酚的結(jié)合顯色，整體表現(xiàn)為吸光度減少的趨勢(shì)。故苯酚用量選1.5 mL適宜。

圖 6 苯酚用量對(duì)吸光度的影響Fig.6 Effect of phenol dosage on absorbance

2.8.2 苯酚濃度對(duì)吸光度影響 不同苯酚濃度對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖7。加入1 mL苯酚，吸光度與苯酚濃度整體成正比關(guān)系。在濃度為5%時(shí)吸光度達(dá)到增長(zhǎng)率最大，加大苯酚濃度，增長(zhǎng)趨于平緩且有下降趨勢(shì)。推測(cè)同“2.8.1”項(xiàng)下，苯酚濃度達(dá)到一定程度后顯色反應(yīng)飽和，過(guò)多的苯酚影響了多糖與濃硫酸的反應(yīng)導(dǎo)致吸光度下降。故苯酚濃度選擇5%合適。

2.8.3 硫酸用量對(duì)吸光度影響 不同硫酸用量對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖8。在低用量范圍內(nèi)，吸光度與硫酸用量整體呈現(xiàn)正趨勢(shì)相關(guān)。在7 mL時(shí)吸光度達(dá)到最大值，后增長(zhǎng)緩慢且有下降趨勢(shì)。推測(cè)是因?yàn)? mL時(shí)反應(yīng)達(dá)到飽和，再增大用量，多余的濃硫酸使糖碳化，影響顯色效果[21]。故硫酸用量為7 mL合適。

圖 7 苯酚濃度對(duì)吸光度的影響Fig.7 Effect of phenol concentration on absorbance

圖 8 硫酸用量對(duì)吸光度的影響Fig.8 Effect of sulfuric acid dosage on absorbance

2.8.4 加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)吸光度影響 不同加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)吸光度影響見(jiàn)圖9~圖10?？疾旖Y(jié)果利用SPSS軟件進(jìn)行單因素分析，發(fā)現(xiàn)這二者因素的數(shù)據(jù)并不具有顯著差異性（P?0.05），提示加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)吸光度的影響甚微。推測(cè)是因?yàn)楸椒?濃硫酸顯色反應(yīng)原理是樣品中的多糖在濃硫酸作用下脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚進(jìn)行縮合反應(yīng)，此顯色反應(yīng)本身為放熱反應(yīng)，放出大量熱量，外界溫度對(duì)反應(yīng)影響較小[17]。故二者對(duì)吸光度影響并不明顯。在進(jìn)行苯酚-硫酸法測(cè)量多糖工藝優(yōu)化時(shí)可忽略加熱溫度、加熱時(shí)間二者影響。

圖 9 加熱溫度對(duì)吸光度的影響Fig.9 Effect of heating temperature on absorbance

圖 10 加熱時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.10 Effect of heating time on absorbance

2.9 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.9.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)“2.8”項(xiàng)下單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取苯酚用量（A）、苯酚濃度（B）、硫酸用量（C）3個(gè)因素為自變量進(jìn)行條件優(yōu)化。結(jié)合Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken分析，設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，試驗(yàn)結(jié)果如表5。

表 5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface test

2.9.2 模型擬合與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)“2.9.1”項(xiàng)下試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并建立二次多元回歸方程：

回歸方程分析結(jié)果如表6。模型的F=66.69，P<0.0001，表明試驗(yàn)選擇的二次模型具有顯著性，且失擬項(xiàng)P=0.1153，不顯著，模型與實(shí)際非正常誤差所占比例較小，說(shuō)明模型擬合良好，能夠較準(zhǔn)確反映吸光度與苯酚用量、苯酚濃度、硫酸用量之間的關(guān)系。回歸方程的確定系數(shù)R2=0.9885，表明此模型能夠反映97.37%的吸光度變化；校正確定系數(shù)R2adj=0.9737，二者都大于0.9，接近于1，表明此模型與實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合效果好，作吸光度的預(yù)測(cè)可靠。變異系數(shù)C.V.=4.16<5，變異系數(shù)越小，表明偏離程度越小，該模型精確度高。分析各項(xiàng)P值表現(xiàn)的顯著性，因素C、C2的P值呈現(xiàn)高度顯著性（P<0.001），對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響高度顯著（P<0.001）；因素B、A2、B2也有極顯著影響（P<0.01）；因素A、AB、BC也有顯著影響（P<0.05）。通過(guò)比較F值大小可知，在選定水平范圍內(nèi)各因素對(duì)吸光度的影響大小為：硫酸用量>苯酚濃度>苯酚用量。

表 6 方差分析和顯著性差異結(jié)果Table 6 Analysis of variance and significant difference results

2.9.3 等高線圖及響應(yīng)面圖分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制等高線圖及響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖11。通過(guò)等高線圖和響應(yīng)面圖能夠直觀反映各因素之間的交互影響。等高線為平面圖，愈趨近于橢圓形則表明交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，反之，圓形則不顯著。響應(yīng)面為立體圖，坡度愈陡，交互作用影響顯著，反之，平緩則不顯著。結(jié)合各因素的等高線圖與響應(yīng)面圖可見(jiàn)，因素B與C，即苯酚濃度、硫酸用量二者交互作用最明顯，其次是因素A與B，即苯酚用量與苯酚濃度。

圖 11 各因素交互作用影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.11 Contour map and response surface map of interaction of various factors

根據(jù)上述結(jié)果，結(jié)合模擬方程進(jìn)行優(yōu)化，得到的預(yù)測(cè)最優(yōu)條件為：苯酚用量1.54 mL、苯酚濃度4.42%、硫酸用量6.49 mL，預(yù)測(cè)吸光度為0.7455，結(jié)合實(shí)際操作的可行性，調(diào)整實(shí)際參數(shù)為苯酚用量1.5 mL、苯酚濃度4.5%、硫酸用量6.5 mL。

2.9.4 工藝驗(yàn)證 按“2.9.3”項(xiàng)下確定的實(shí)際可行的最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，當(dāng)測(cè)量條件苯酚用量1.5 mL、苯酚濃度4.5%、硫酸用量6.5 mL時(shí)測(cè)定吸光度為0.7327，接近預(yù)測(cè)值，該最優(yōu)工藝穩(wěn)定可靠。酒黃精樣品多糖平均含量8.50%，RSD=0.87%。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)選取了五因素五水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，其中苯酚用量、苯酚濃度、硫酸用量表現(xiàn)出顯著差異性（P<0.05），而加熱溫度、加熱時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此選取苯酚用量、苯酚濃度、硫酸用量進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。各因素對(duì)吸光度的影響大小為：硫酸用量>苯酚濃度>苯酚用量。優(yōu)化后的最佳顯色條件是苯酚用量1.5 mL、苯酚濃度4.5%、硫酸用量6.5 mL。對(duì)酒黃精多糖進(jìn)行測(cè)定，平均含量為8.50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%。

本實(shí)驗(yàn)選取了多糖含量測(cè)定常用的兩種方法進(jìn)行測(cè)定。在線性關(guān)系、精確度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、加樣回收率的考察結(jié)果中，蒽酮-硫酸法及苯酚-硫酸法二者均能可靠、有效測(cè)定酒黃精中的多糖含量。但蒽酮-硫酸法需提前配制，保存不便易變質(zhì)，在穩(wěn)定性試驗(yàn)中明顯低于苯酚-硫酸法。此外，兩種方法對(duì)同一樣品測(cè)量結(jié)果存在差異，苯酚-硫酸法低于蒽酮硫酸法，與課題組前期研究[22]結(jié)果一致。孫曉燕等[27]研究發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法受酒蒸黃精中所含蛋白質(zhì)影響較小，測(cè)量更加靈敏，酒黃精多糖含量更加準(zhǔn)確。苯酚-硫酸法所要求的反應(yīng)條件較為簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單快捷。但是在苯酚-硫酸法的操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)苯酚長(zhǎng)期暴露在空氣中易氧化，加入試管后濃硫酸應(yīng)盡快加入，以免造成人為誤差。蒽酮-硫酸法易受蛋白質(zhì)等物質(zhì)影響，按照藥典中黃精多糖的提取方法進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)未完全除凈，對(duì)蒽酮法測(cè)量多糖存在較大干擾?，F(xiàn)常用Sevage法、酶法、三氯乙酸法進(jìn)行黃精多糖的純化[28?30]，故認(rèn)為藥典中所收錄的黃精多糖溶液提取方法還需進(jìn)一步考慮蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，更新優(yōu)化提取方法。

本實(shí)驗(yàn)建立了適宜酒蒸黃精多糖的最優(yōu)苯酚-硫酸測(cè)量工藝，填補(bǔ)了目前酒黃精研究領(lǐng)域中的空缺，為后期全面深入研究黃精九蒸九曬炮制品、生品中多糖含量的測(cè)量提供了科學(xué)依據(jù)；為未來(lái)中國(guó)藥典制定酒黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了有力的研究基礎(chǔ)；為黃精藥食同源產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了參考價(jià)值。