席璟睿，張懿琳，吳夢琪，張文清，徐志珍，夏 瑋

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點實驗室，上海 200237）

枸杞（Lycium barbarumL.），又名枸杞子，是一種茄科落葉灌木的成熟果實，是我國傳統(tǒng)藥食同源的中藥材。其味甘性平，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎，益精明目的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)和增強免疫能力等多種活性[1?4]。枸杞子中含有多糖、黃酮、類胡蘿卜素、氨基酸、甜菜堿、腦苷脂、谷甾醇、微量元素和維生素等成分。在這些成分中，多糖被認(rèn)為是枸杞的主要活性成分。枸杞多糖（LBPs）具有多種藥理活性，在預(yù)防和治療某些慢性疾病中起著重要作用，如糖尿病、炎癥、癌癥和免疫缺陷等[5?7]。目前市場上存在大量的枸杞多糖產(chǎn)品如營養(yǎng)保健品和膳食補充劑等[8]，因此判定枸杞多糖產(chǎn)品的質(zhì)量好壞及原料真?zhèn)螛O為重要。一般采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法[9]測定多糖含量來控制枸杞多糖產(chǎn)品的質(zhì)量，但此類方法選擇性較差，無法得到多糖的單糖組成以及糖殘基連接方式等結(jié)構(gòu)信息，所以不能有效地鑒別出摻假品。因此，迫切需要制定有效可靠的評價標(biāo)準(zhǔn)，以便科學(xué)地評價枸杞多糖的質(zhì)量。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的質(zhì)量檢測技術(shù)[10?11]。多糖的活性與其單糖組成、糖殘基連接方式、相對分子質(zhì)量及空間結(jié)構(gòu)等有著密切的聯(lián)系，因此建立基于多糖結(jié)構(gòu)信息的指紋圖譜可以有效、科學(xué)地評價多糖產(chǎn)品的質(zhì)量。關(guān)于枸杞多糖的指紋圖譜目前已有相關(guān)報道。符夢凡[12]通過柱前衍生化HPLC法，以葡萄糖為基準(zhǔn)物質(zhì)，建立了枸杞多糖的HPLC特征圖譜，并將該方法應(yīng)用于不同來源及不同廠家枸杞多糖的質(zhì)量評價。蔣梅等[13]以三氟乙酸水解枸杞子多糖，采用PMP柱前衍生化HPLC方法測定枸杞子多糖的單糖組成，構(gòu)建了枸杞子多糖的HPLC指紋圖譜。徐金楠等[14]采用中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對三個產(chǎn)地紅果及黑果枸杞多糖樣品的IR、HPGPC、基于單糖組成的柱前衍生化HPLC圖譜進(jìn)行比較分析，以便用于枸杞及相關(guān)產(chǎn)品的多糖的質(zhì)量控制。Liu等[15]建立了基于IR、UV、HPGFC以及PMP柱前衍生化HPLC的枸杞多糖多維指紋圖譜，采用化學(xué)計量學(xué)的手段進(jìn)行評價分析。目前關(guān)于枸杞多糖指紋圖譜的大多數(shù)研究只關(guān)注完全酸水解產(chǎn)生的單糖，但能夠提供更多信息的寡糖片段則未受到重視[16]。因此可采用部分酸水解的方法將多糖降解為單糖和特征寡糖片段，然后經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化后通過高效液相色譜（HPLC）分析[17]，獲得與多糖組成和結(jié)構(gòu)相關(guān)的獨特指紋信息[18]。

本研究采用水提醇沉法從16 批不同產(chǎn)地的枸杞中提取多糖，采用三氟乙酸（TFA）進(jìn)行部分酸水解，水解產(chǎn)物采用PMP柱前衍生化HPLC方法進(jìn)行測定，構(gòu)建枸杞多糖的部分酸水解產(chǎn)物指紋圖譜。采用相似度評價（SA）、聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）[19]等化學(xué)計量學(xué)手段對指紋圖譜進(jìn)行分析，揭示不同產(chǎn)地枸杞多糖樣品的差異，篩選影響產(chǎn)地差異的標(biāo)志性成分，并對枸杞多糖市售產(chǎn)品進(jìn)行真?zhèn)舞b別，為枸杞多糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16批枸杞樣品（100 g） 分別購于寧夏、甘肅、河北、青海、內(nèi)蒙古、新疆和云南等地，見表1。該16批樣品經(jīng)上海市中藥研究所葉愈青高級工程師鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.（S1~S4、S6~S16）和河北血杞Lycium chinenseMiller var.potaninii（Pojarkova） A.M.Lu（S5）的干燥成熟果實[20]。乙腈、甲醇（色譜純）、三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） Adamas公司；無水乙醇、無水甲醇、三氯甲烷 均為分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；D-甘露糖（Man）、L-阿拉伯糖（Ara）、D-半乳糖（Gal）、L-鼠李糖（Rha）和D-木糖（Xyl） 上海源聚生物科技有限公司；D-葡萄糖（Glc） 上海化學(xué)試劑公司；D-半乳糖醛酸（GalA）、D-葡萄糖醛酸（GlcA） Aladdin公司（中國）。

表 1 原材料批次與產(chǎn)地Table 1 16 batches of LBPs sample source

WKZ-4型中藥粉碎機 青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；SHB-IIIA 型循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1290超高效液相色譜儀-6530四級桿飛行時間質(zhì)譜儀 UHPLC-6530 QTOF-MS/MS，美國Agilent公司；AE24型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 稱取枸杞50 g，60 ℃干燥5 h 后粉碎，取10 g枸杞粉末60 ℃ 下用95%乙醇脫脂2 h。收集濾渣并干燥。以 1:20料液比90 ℃熱水浸提2 h，重復(fù)兩次，收集上清液減壓濃縮至1/4體積，加入4倍體積的95%乙醇靜置過夜。過濾后將沉淀加5倍體積的丙酮-石油醚混合液（體積比1:1）室溫下洗滌20 min，于65 ℃真空干燥1 h，即得固形物枸杞多糖。

稱取10.0 mg干燥的枸杞多糖樣品于安瓿瓶中，加入2 mL 1.5 mol/L的三氟乙酸（TFA），封口，于100 ℃水解2 h。水解完畢，冷卻后于40 ℃旋干，加適量甲醇旋干以除盡三氟乙酸，殘渣溶于2 mL超純水待衍生化。移取100 μL枸杞多糖水解樣品溶液，加入50 μL的0.6 mol/L NaOH和100 μL PMP-甲醇溶液，混勻后70 ℃反應(yīng)100 min，冷卻至室溫。再加入0.3 mol/L HCl 100 μL 和超純水750 μL，三氯甲烷重復(fù)萃取3次，靜置后取水層，0.45 μm濾膜過濾后待色譜分析。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定L-阿拉伯糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖，D-半乳糖醛酸，D-木糖和L-鼠李糖等8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg定溶于10 mL，配制0.5 mg·mL?1的單糖混合對照品溶液。移取100 μL混合單糖對照品溶液，加入50 μL的0.6 mol/L NaOH和100 μL PMP-甲醇溶液，混勻后70 ℃反應(yīng)100 min，冷卻至室溫。再加入100 μL的0.3 mol/L HCl和750 μL超純水，三氯甲烷重復(fù)萃取3次，靜置后取水層，0.45 μm濾膜過濾后待色譜分析。

1.2.3 色譜條件 采用Agilent 1260高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.7）-乙腈（體積比84:16）；DAD檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min?1；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4 液質(zhì)聯(lián)用條件 采用Agilent 1290超高效液相色譜儀聯(lián)合Q-TOF質(zhì)譜儀以及DAD檢測器對枸杞多糖的部分酸水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜柱：Agilent UHPLC XDB-C18 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相：A 20 mmol/L pH 5.5 乙酸銨緩沖液：B 乙腈=84:16（v/v）；流速：0.1 mL/min；柱溫：30 ℃；DAD檢測波長：250 nm；進(jìn)樣量：3 μL；干燥氣體流速為10 L/min；噴霧器壓力為50 psi，毛細(xì)管電壓為4.0 kV；干燥氣體溫度：300 ℃; 離子源溫度：100 ℃；正離子模式；MS/MS碰撞能量設(shè)定為20 V；質(zhì)量掃描范圍為m/z 100~2000。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A版）進(jìn)行相似度分析。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析和偏最小二乘判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LBPs部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC指紋圖譜構(gòu)建

16批枸杞多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC圖譜如圖1所示，不同產(chǎn)地樣品的圖譜相似度較高，有13個共有峰。將16批LBPs部分酸水解產(chǎn)物的色譜數(shù)據(jù)（圖1）導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A版），S7號樣品色譜圖色譜峰峰形好、分離度良好、基線平整，故以S7枸杞多糖的圖譜作為參照譜[21]，選擇中位數(shù)法生成對照指紋圖譜如圖2所示。以對照指紋圖譜計算各批次LBPs的相似度，相似度評價結(jié)果見表2。各產(chǎn)地LBPs相似度在0.911~0.997之間，表明各產(chǎn)地枸杞多糖的差異較小，所建立的指紋圖譜可用來對枸杞多糖的質(zhì)量進(jìn)行評價。

表 2 枸杞多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC色譜圖的相似度評價結(jié)果Table 2 Similarity of PMP-HPLC-DAD fingerprint of LBPs partial acid hydrolyzate

2.2 LBPs部分酸水解產(chǎn)物中單糖及寡糖的定性鑒定

2.2.1 LBPs部分酸水解產(chǎn)物中單糖的HPLC定性鑒定 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP-HPLC色譜圖如圖3所示，將LBPs部分酸水解產(chǎn)物指紋圖譜中共有峰的保留時間與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間比對，LBPs部分酸水解產(chǎn)物中共有7種單糖，5、7、9、10、11、12、13號峰分別為Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara。

圖 1 枸杞多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC色譜圖Fig.1 PMP-HPLC fingerprints of LBPs partial acid hydrolyzate

圖 2 枸杞多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC對照指紋圖譜Fig.2 PMP-HPLC control fingerprint of LBPs partial acid hydrolysate

圖 3 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP-HPLC色譜圖Fig.3 PMP- HPLC chromatogram of the mixed standards

2.2.2 LBPs部分酸水解產(chǎn)物中單糖和寡糖的UHPLCQ-TOF-MS2定性鑒定 以樣品S7為例，對枸杞多糖部分酸水解產(chǎn)物中的單糖和寡糖采用UHPLC-QTOF-MS2進(jìn)行鑒定，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.4”項下條件進(jìn)行測定，總離子流圖如圖4所示。由于實驗所使用的超高效液相色譜儀同時配備了Q-TOF質(zhì)譜儀和DAD檢測器，所以總離子流圖可以同時采用DAD圖（圖5）進(jìn)行參照，這樣有利于對部分酸水解產(chǎn)物中的單糖和寡糖進(jìn)行鑒定。正離子模式下，1~13號峰的一級質(zhì)譜顯示其準(zhǔn)分子離子[M+H]+分別為m/z 1053.2797、877.2561、701.2947、687.2448、511.2187、673.2687、495.2236、671.2581、525.1979、511.2187、511.2184、481.2067和481.2073。其中5、7、9、10、11、12、13號峰分別為Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara與兩分子PMP脫去兩分子H2O形成的衍生物，驗證了單糖組成的結(jié)果。1，2，3，4，6，8等未知峰進(jìn)一步采用二級質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如圖6所示，由準(zhǔn)分離子質(zhì)荷比以及碎片離子信息[22?23]可以推知寡糖的組成信息，如表3所示。綜上，LBPs部分酸水解產(chǎn)物的對照PMPHPLC指紋圖譜（圖2）中1~13號峰分別為聚合度（DP）2~4的半乳糖醛酸聚糖、六碳糖+GalA、Man、DP 2的六碳糖、Rha、GalA+Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara。

圖 4 LBPs部分酸水解產(chǎn)物在負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of LBPs in negative mod

圖 5 LBPs部分酸水解產(chǎn)物的PMP-UHPLC-DAD色譜圖Fig.5 PMP-HPLC-DAD fingerprints of LBPs partial acid hydrolyzate

圖 6 LBPs部分酸水解產(chǎn)物中寡糖的二級質(zhì)譜圖Fig.6 MS / MS spectrums of LBPs partial acid hydrolysate

表 3 枸杞多糖部分酸水解物中單糖和寡糖的鑒定Table 3 Identification of monosaccharides and oligosaccharides of LBPs partial acid hydrolyzate

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗 按“1.2”項下方法制備和測定6份LBPs樣品（S7）溶液，以10號峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.15%，相對峰面積的RSD值均小于2.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取S7供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.12%，相對峰面積的RSD值均小于1.98%，表明樣品溶液24 h內(nèi)有足夠的穩(wěn)定性。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取批次S7溶液25 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.14%，相對峰面積的RSD值均小于2.12%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.4 市售樣品真?zhèn)舞b別

S17~S21為5批市售LBPs樣品，市售樣品按“1.2.1”項方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項HPLC條件進(jìn)樣分析，所得色譜圖見圖7。S19、S21與LBPs部分酸水解產(chǎn)物的對照指紋圖譜的相似度分別為0.933和0.956，且圖譜信息與LBPs對照指紋圖譜相一致，說明這2份市售樣品為真品；而S17、S18和S20僅含有較高含量的Glc和微量的Man、Rha和Gal，且不含有寡糖，與對照指紋圖譜的相似度僅在0.498~0.683之間，為摻假品，推測可能在枸杞多糖摻入了大量的麥芽糊精[24]。麥芽糊精是淀粉的水解產(chǎn)物，添加了大量麥芽糊精的枸杞多糖經(jīng)三氟乙酸部分水解后，主要單糖為葡萄糖，寡糖由于含量太低沒有被檢測出來。上述結(jié)果表明建立的指紋圖譜可以很好地用于枸杞多糖產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制。

圖 7 5批市售枸杞多糖樣品部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC色譜圖Fig.7 PMP-HPLC spectrum of 5 commercially available samples partial acid hydrolysate

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析 聚類分析是按照個體的特征將其進(jìn)行分類，將數(shù)據(jù)集中的樣本聚集成一類，同一個類別中的個體間具有較高的相似度。將16批枸杞樣品部分酸水解產(chǎn)物色譜圖中各共有峰相對于參比峰（Glc）的峰面積量化后，得到16×13階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 23.0版軟件，采用瓦爾德法（Ward）作為聚類方法[25]。聚類結(jié)果如圖8所示，當(dāng)判別距離為10時，16批枸杞樣品被分為3大類：第1類包括4個產(chǎn)地的樣品，分別是河北巨鹿、青海格爾木、內(nèi)蒙古和新疆樓蘭；第2類包括8個產(chǎn)地的樣品，分別是寧夏銀川（6個）、寧夏中寧和甘肅景泰；第3類包括4個產(chǎn)地的樣品，分別是寧夏中寧（2個）、青海柴達(dá)木和云南。結(jié)果表明，樣品分類存在產(chǎn)地交叉現(xiàn)象，但與產(chǎn)地有一定的相關(guān)性，分成3 類的原因可能是各化學(xué)組成成分的相對比例具有一定的差異所致。

圖 8 LBPs的聚類分析樹狀圖Fig.8 Cluster analysis of LBPs

2.5.2 主成分分析 PCA主要體現(xiàn)了降維的思想，選取貢獻(xiàn)率較大的成分進(jìn)行分析，既簡化了分析過程，又盡可能多的展現(xiàn)了原始信息。將16批次樣品的13個共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，進(jìn)行PCA分析，主成分分析的特征值和方差貢獻(xiàn)率如表4所示。以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)[26]，前3個主成分累積貢獻(xiàn)率為79.264%（>70%），其中第一個主成分貢獻(xiàn)率為33.897%，第二個主成分貢獻(xiàn)率為23.110%，第

表 4 特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate

三個主成分貢獻(xiàn)率為22.257%。故選取前3個主成分進(jìn)行評價，它代表枸杞多糖中13個成分量的79.264%的信息量，足以評價枸杞多糖的品質(zhì)。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA統(tǒng)計軟件中，提取了3個主成分，分析結(jié)果如圖9所示。與HCA類似，PCA將16批LBPs樣品分成3類。PCA結(jié)果與HCA的結(jié)果相互得以印證。

圖 9 LBPs主成分分析圖Fig.9 PCA results of LBPs

2.5.3 偏最小二乘判別分析 PLS-DA常用于多變量體系樣本的判別分析，適用于自變量之間存在共線性或樣本數(shù)量較少的情況。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA統(tǒng)計軟件中通過PLS-DA進(jìn)行分析，該模型中，R2X（cum）=0.902，R2Y（cum）=0.763，Q2（cum）=0.556，R2Y和Q2的值以大于0.5為宜，且R2Y和Q2的值越趨近于1，說明該PLS-DA模型的預(yù)測能力越好。分析結(jié)果如圖10所示，分類結(jié)果與HCA和PCA相一致。圖11反映了該模型的 VIP值，VIP值的大小表示的是每個自變量貢獻(xiàn)的大小，以VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得出導(dǎo)致產(chǎn)地間差異的標(biāo)志性成分。從VIP值可知，色譜峰10、色譜峰13和色譜峰11的VIP值都大于1，三個色譜峰對應(yīng)的分別是Glc、Ara和Gal。上述結(jié)果說明Glc、Ara和Gal對PLS-DA模型的判別分析具有較大的貢獻(xiàn)。

圖 10 LBPs偏最小二乘判別分析圖Fig.10 PLS-DA results of LBPs

圖 11 LBPs偏最小二乘判別分析的VIP值Fig.11 VIP of PLS-DA of LBPs

3 結(jié)論

本文建立了16批不同產(chǎn)地LBPs部分酸水解產(chǎn)物的PMP-HPLC指紋圖譜，結(jié)合SA、HCA、PCA和PLS-DA對指紋圖譜進(jìn)行綜合評價。通過混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品比對和 UPLC-Q-TOF-MS2定性鑒定，確定各產(chǎn)地枸杞多糖部分酸水解產(chǎn)物中均含有7種單糖、DP 2~4的半乳糖醛酸聚糖以及3種其它類型的2糖。HCA、PCA和PLS-DA均將不同產(chǎn)地的枸杞多糖分為三類，分類結(jié)果與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性。PLS-DA進(jìn)一步篩選出3個影響產(chǎn)地間差異的標(biāo)志性成分，分別為葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖（Ara）和半乳糖（Gal）。根據(jù)建立的指紋圖譜對5份市售LBPs進(jìn)行真?zhèn)舞b別，其中2份市售樣品與對照圖譜的相似度為0.933~0.956，說明其為真品；另外3份市售樣品與對照圖譜的相似度僅為0.498~0.683，為摻假品，推測添加了大量的麥芽糊精。本研究建立的指紋圖譜與枸杞多糖的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)特征相關(guān)，因此在枸杞多糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制方面具有較大的實用價值。