王春林,武 蕓,蘆婭妮,韓明虎,王麗朋,胡浩斌
(1.隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,甘肅慶陽(yáng) 745000;2.隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,甘肅慶陽(yáng) 745000)
黑果枸杞具有抗炎[1]、增強(qiáng)腸道屏障功能[2]、抗氧化[3?6]、抗疲勞[7?8]、防痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[10]、防治心腦血管疾病[11]等功效,富含花青素、多糖、多酚、黃酮等多種天然有效成分,主產(chǎn)于我國(guó)新疆、甘肅、青海、寧夏等地[12]。黃酮類(lèi)化合物(Flavonoids)是一類(lèi)植物次生代謝產(chǎn)物,其抗氧化性是化學(xué)合成抗氧化劑的3~5倍,天然無(wú)毒,極具開(kāi)發(fā)前景[13]。李淑珍[14]以新疆產(chǎn)黑果枸杞葉為原料,測(cè)定了其總黃酮含量并優(yōu)化了提取工藝,使總黃酮提取率達(dá)到了0.23%。段亞云等[15]、韓愛(ài)芝等[16]分別采用響應(yīng)面技術(shù)優(yōu)化了超聲波-微波協(xié)同提取、超聲輔助提取黑果枸杞葉總黃酮的工藝條件,提取率分別達(dá)到了0.997%和1.62%。古麗巴哈爾·卡吾力等[17]以新疆塔里木盆地產(chǎn)黑果枸杞為原料,采用水提法,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法優(yōu)化了黑果枸杞黃酮提取工藝,總黃酮提取量達(dá)到了69.02 μg/mL。同時(shí),相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黑果枸杞黃酮具有明顯的體外抗氧化性[17?18]、降血脂功效[19?20]、抑制Hep G-2肝癌細(xì)胞增殖作用[21?22]。綜上所述,關(guān)于黑果枸杞總黃酮提取及生物活性研究,多見(jiàn)于新疆產(chǎn)黑果枸杞葉中的黃酮類(lèi)化合物,其它主產(chǎn)區(qū)數(shù)據(jù)尚缺,從黑果枸杞果實(shí)中提取黃酮化合物的報(bào)道也較為少見(jiàn)。
植物有效成分提取中需考慮到多個(gè)影響因素,通常的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)導(dǎo)致工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且優(yōu)化工藝具有盲目性、缺乏精準(zhǔn)性。Plackett-Burman(PB)是一種近飽和的兩水平篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,能用最少的試驗(yàn)次數(shù)快速有效地篩選出顯著性影響因子[23],最陡爬坡實(shí)驗(yàn)可依據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定爬坡方向,快速聚焦響應(yīng)面中心區(qū)域,Box-Behnken(BB)響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用多元線(xiàn)性和二次項(xiàng)模型擬合,可較好地體現(xiàn)依賴(lài)變量與非依賴(lài)變量之間的關(guān)系,對(duì)回歸方程分析尋求最佳工藝參數(shù)[24]。
本研究以甘肅產(chǎn)黑果枸杞干果為原料,采用超聲輔助提取其總黃酮,通過(guò)PB、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及BB聯(lián)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行了評(píng)價(jià),一方面可為黑果枸杞研究填補(bǔ)數(shù)據(jù)空白,有利于黑果枸杞資源開(kāi)發(fā)利用,另一方面為植物有效成分提取工藝研究提供可供參考的思路和方法。
黑果枸杞 2018年6月至8月產(chǎn)自甘肅省民勤縣;抗壞血酸(批號(hào)Lot.No 1018P032)、DPPH(批號(hào)Lot.No 102D021)、ABTS(批號(hào)Lot.No 109A021)
北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過(guò)硫酸鉀 均為分析純。
FZ102微型植物試樣粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;7230G可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。
1.2.1 黑果枸杞黃酮提取方法 黑果枸杞原料經(jīng)30 ℃鼓風(fēng)干燥48 h、粉碎,取100目標(biāo)準(zhǔn)篩篩下物,干燥器中?5 ℃保存。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g,置于裝有15 mL 51%乙醇的錐形瓶中,62 ℃下提取42 min,超聲功率240 W,冷卻至室溫后離心分離,取上層清液于25 mL容量瓶中,蒸餾水定容。
1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以黑果枸杞總黃酮提取率(Total flavonoids content,TFC)為評(píng)價(jià)指標(biāo),各因素考察參數(shù)及固定水平如表1所示。
表 1 單因素實(shí)驗(yàn)各因素考察參數(shù)及固定水平Table 1 Parameters and fixed level of each factor in single factor experiments
1.2.3 PB實(shí)驗(yàn)-最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別對(duì)每個(gè)影響因子取高低兩水平通過(guò)Minitab 17.1.0軟件進(jìn)行PB篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì),選取的因素及水平見(jiàn)表2。其次,在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,分析實(shí)驗(yàn)所得一次多項(xiàng)式及各因素的正負(fù)效應(yīng),確定爬坡方向和步長(zhǎng),進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
表 2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素及水平Table 2 Factors and levels tested in PB design
1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,聚焦響應(yīng)面中心區(qū)域,選取顯著性因素及水平,非顯著性影響因素保持單因素實(shí)驗(yàn)中最高提取率對(duì)應(yīng)值,液料比30:1 mL/g,超聲功率240 W,見(jiàn)表3,采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析。
表 3 響應(yīng)面因素及水平Table 3 Factors and levels in response surface design
1.2.5 總黃酮提取率測(cè)定 將提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)作為測(cè)試液。參照課題組前期研究成果中的方法測(cè)定總黃酮濃度,并根據(jù)式(1)計(jì)算黃酮提取率,提取率以mg/g(原料)表示,后面簡(jiǎn)寫(xiě)為mg/g[25]。
式中:ρ:總黃酮提取率,mg/g;C:測(cè)試液總黃酮濃度,μg/mL;DF:稀釋倍數(shù),50;m:原料質(zhì)量,g;V:提取液體積,25 mL;1000:?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)。
1.2.6 黑果枸杞黃酮抗氧化性測(cè)定 參考Pavli?等[26]與Sarikurkcy等[27]的方法并根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)稍作修改。抗壞血酸與黃酮保持相同濃度和方法做平行對(duì)比。
1.2.6.1 FRAP實(shí)驗(yàn) 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL的樣品測(cè)試液。2.5 mL磷酸緩沖液(pH=6.6)及1%鐵氰化鉀溶液加入1 mL測(cè)試液中,混合、50 ℃水浴中保持20 min后,常溫下加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,離心分離、取上層清液2.5 mL,與2.5 mL蒸餾水與0.1%氯化鐵溶液混合,靜置,測(cè)定700 nm的吸光度。
1.2.6.2 ABTS實(shí)驗(yàn) 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的樣品測(cè)試液。將7 mmol ABTS與140 mmol過(guò)硫酸鉀按5 mL:88 μL混合,室溫下暗處放置12~16 h,形成ABTS自由基儲(chǔ)備液,避光保存,使用時(shí)稀釋為A734 nm在0.695~0.705范圍即可。測(cè)定時(shí),取300 μL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液與3.7 mL ABTS自由基稀釋液,混合、靜置,測(cè)定734 nm的吸光度。
1.2.6.3 DPPH實(shí)驗(yàn) 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的樣品測(cè)試液。取0.5 mL測(cè)試液及4.0 mL DPPH無(wú)水乙醇溶液(0.15 mmol/L)于帶刻度具塞試管中,用無(wú)水乙醇稀釋至6 mL,混勻、避光放置一定時(shí)間,測(cè)定517 nm的吸光度。采用相同的方法分別測(cè)定用無(wú)水乙醇代替DPPH溶液和4.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無(wú)水乙醇的混合液在517 nm的吸光度。同法評(píng)價(jià)抗壞血酸DPPH自由基清除能力。
ABTS與DPPH自由基清除率均采用式(2)計(jì)算。
式中:S為清除率;Ai為測(cè)試液吸光度;Aj為樣品溶液吸光度;A0為未加樣品對(duì)照液吸光度。
采用Origin 8.0軟件作圖、Mintab 17.1.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)差異比較、Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析與統(tǒng)計(jì)差異比較,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖1可以看出,50%乙醇溶液對(duì)黑果枸杞黃酮的提取率最高,推測(cè)其與黑果枸杞黃酮極性最相似;提取時(shí)間40 min時(shí),黃酮提取率不再增加,繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間提取率變化不大;提取溫度太低不利于傳質(zhì),太高則會(huì)破壞黃酮結(jié)構(gòu)、降低其生物活性,70 ℃較佳;當(dāng)液料比達(dá)到30:1(mL/g)時(shí),黑果枸杞黃酮溶出量最大,再增大溶劑用量,會(huì)導(dǎo)致溶出雜質(zhì)增多,降低總黃酮在溶出物中的比例而使其純度下降;超聲功率240 W時(shí)提取效果較佳。因此,較佳的提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間40 min、提取溫度70 ℃、液料比30:1 mL/g、超聲功率240 W,以其為參考值進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
圖 1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiment
2.1.2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 按前述方法進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),各組實(shí)驗(yàn)提取率如表4所示。
表 4 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 PB experimental design and results
采用Minitab 17.1.0軟件對(duì)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與模型擬合,結(jié)果見(jiàn)表5。
由表5可知,模型的“P<0.001”、F=41.53,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)擬合模型達(dá)到了0.1%顯著水平;從相關(guān)系數(shù)來(lái)看,R2=0.9719,R2(predicted)=0.8877,R2(adjusted)=0.9485均與1接近,說(shuō)明擬合得到的一次多項(xiàng)式Y(jié)=31.519?1.548A?2.711B+2.619C+0.531D+0.301E與實(shí)驗(yàn)基本相符,可用來(lái)判別各種影響因素的顯著性。表6為各因素的正負(fù)效應(yīng)系數(shù)、顯著性數(shù)值及影響排名。
2.1.3 最陡爬坡試驗(yàn) 由表7可知,第5組提取率最高,所以以第5組實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的顯著性影響參數(shù)為響應(yīng)面中心進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。
表 5 PB實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis results of PB design
2.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Design expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)式TFC=40.98+0.17A?0.29B+0.20C+0.40AB+0.28AC?0.95BC?1.57A2?1.03B2?1.38C2,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表8和表9。
由表9可知,模型F=50.50,P<0.0001,說(shuō)明模型達(dá)到了0.1%顯著水平,并且R2=0.9848,R2adj=0.9653,R2pred=0.9040、失擬項(xiàng)P=0.6199>0.05,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好且失擬程度不顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外,各項(xiàng)顯著性因素統(tǒng)計(jì)分析表明,其顯著性大小順序?yàn)椋築>C>A,這與Plackett-Burnman試驗(yàn)分析結(jié)果一致,結(jié)論相互佐證,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程誤差小,并且B,AB達(dá)到了5%顯著性水平,BC,A2,B2,C2等二次項(xiàng)達(dá)到了0.1%顯著性水平。
表 6 各因素的正負(fù)效應(yīng)及顯著性Table 6 Positive and negative effects and significance of each factor
表 7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental design and result in steepest ascent method
表 8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Experimental design and results in Box-Behnken
表 9 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 ANOVA results of Box-Behnken design
依據(jù)數(shù)據(jù)模擬結(jié)果,繪制3D響應(yīng)面圖,見(jiàn)圖2。由圖2可知,所形成的響應(yīng)曲面均中心凸起四周下降,說(shuō)明通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)選取的響應(yīng)面中心準(zhǔn)確,實(shí)驗(yàn)中選取各因素水平范圍覆蓋了最高提取率的工藝條件,通過(guò)模型預(yù)測(cè)的最佳提取工藝是科學(xué)合理的。
圖 2 響應(yīng)面3D圖Fig.2 Response surface 3D graph
2.1.5 最優(yōu)條件及驗(yàn)證 解析所得二次多項(xiàng)式,并根據(jù)儀器實(shí)際操作精確度做近似處理,得到超聲輔助提取黑果枸杞黃酮的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)51%,提取溫度62 ℃,提取時(shí)間42 min,液料比30:1,超聲功率240 W,并進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平均提取率為42.0974 mg/g,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%,說(shuō)明該擬合模型可靠、最佳工藝條件準(zhǔn)確。
2.2.1 FRAP還原力 由圖3可知,隨著黑果枸杞黃酮樣品與抗壞血酸濃度增大,吸光度逐漸增大,說(shuō)明其還原力增強(qiáng),并且黑果枸杞黃酮的還原力強(qiáng)于抗壞血酸,與李進(jìn)等[18]報(bào)道的黑果枸杞葉黃酮還原力實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,但吸光度整體偏小,可能由于黑果枸杞黃酮來(lái)自不同地域的植物和植物不同部位而表現(xiàn)出差異,同時(shí)推測(cè)黑果枸杞黃酮是良好的電子供應(yīng)者。
圖 3 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的還原力Fig.3 Reducing power of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid
2.2.2 ABTS總抗氧化力 由圖4可知,黑果枸杞總黃酮與抗壞血酸對(duì)ABTS+自由基的清除率均隨自身濃度增大而增大,在0.05 mg/mL時(shí),黑果枸杞黃酮與抗壞血酸的清除率分別達(dá)到96.68%和93.63%,說(shuō)明黑果枸杞黃酮與抗壞血酸均具有很強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力,IC50分別為0.0252 、0.0279 mg/mL,說(shuō)明黑果枸杞黃酮的ABTS+自由基清除力略強(qiáng)于抗壞血酸。原因可能是黃酮類(lèi)化合物具有多羥基,黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中的3-OH,5-OH,2、3位雙鍵,B環(huán)中的4'-OH,3',4'鄰位雙羥基是抗氧化的有效基團(tuán),能與自由基反應(yīng),形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基,共振半醌式自由基的穩(wěn)定性越大,黃酮類(lèi)化合物的抗氧活性越強(qiáng)[28]。
圖 4 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging force of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid
2.2.3 DPPH自由基清除能力 穩(wěn)定自由基DPPH的乙醇溶液呈紫色,在517 nm處有最大吸收,抗氧化劑具有遞電子或遞質(zhì)子的能力,對(duì)DPPH自由基的清除作用是抗氧化劑將電子或質(zhì)子傳遞給DPPH自由基,從而生成穩(wěn)定的分子態(tài)的結(jié)果[29]。由圖5可知,黑果枸杞黃酮與抗壞血酸清除DPPH自由基作用均較強(qiáng),IC50分別為0.0272、0.0287 mg/mL。濃度0.01~0.06 mg/mL時(shí),兩者對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度增大急劇上升,達(dá)到0.06 mg/mL時(shí),兩者的清除率都大于90%并趨于穩(wěn)定,此后清除作用增加不明顯,整個(gè)過(guò)程二者對(duì)DPPH自由基的清除率無(wú)明顯差異,本實(shí)驗(yàn)中的黃酮樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力低于古麗巴哈爾·卡吾力等[17]報(bào)道的新疆黑果枸杞黃酮,與李兆君等[30]報(bào)道的寧夏黑果枸杞黃酮清除能力基本一致。
圖 5 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH· scavenging force of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid
本研究以甘肅產(chǎn)黑果枸杞為原料,采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)合最陡爬坡實(shí)驗(yàn)與BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行黃酮提取工藝優(yōu)化,最佳提取工藝條件為:以51%乙醇(體積分?jǐn)?shù))為提取劑,加入與原料比30:1(mL/g)的量,62 ℃、240 W提取42 min,提取率可達(dá)42.0974 mg/g。
同時(shí),以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照,較全面地評(píng)價(jià)了黑果枸杞黃酮的抗氧化性,得出黑果枸杞黃酮具有較強(qiáng)的還原力,對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基的清除作用表明,其IC50分別為0.0252、0.0272 mg/mL均略強(qiáng)于抗壞血酸的0.0279、0.0287 mg/mL,抗氧化能力與濃度正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗氧化性考察的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有限,本課題組會(huì)在后續(xù)研究中繼續(xù)探索黑果枸杞黃酮對(duì)其它自由基的清除作用,采用HPLC或MS對(duì)提取物黃酮單體化合物進(jìn)行定性定量研究。
綜上所述,黑果枸杞黃酮可作為一種安全的天然抗氧化物,具有較高的應(yīng)用價(jià)值和潛在經(jīng)濟(jì)效益,本文研究成果可為黑果枸杞開(kāi)發(fā)應(yīng)用、深加工、精加工提供一定的理論依據(jù)。