楊秀東，白子凡，徐永濤，梁 倍，周鴻立

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

托盤（Rubus crataegifoliusBunge.）是薔薇科懸鉤子屬植物，別名山楂葉懸鉤子、牛迭肚，廣泛分布于我國東北、華東和中南部地區(qū)[1]。托盤根和果實(shí)均為傳統(tǒng)中藥材，果實(shí)酸甜，可生食，也可制作果醬、果羹或釀酒，果實(shí)也可入藥，具有補(bǔ)肝養(yǎng)腎、固精縮尿的功效。其根在民間多用治療痛風(fēng)及肝炎等病癥[2?3]。托盤根包含大量酚酸類、芪類、黃酮類、鞣質(zhì)、萜類、皂苷類和多糖類成分[4?6]。其中三萜類成分在懸鉤子屬植物中有著含量高、結(jié)構(gòu)豐富的特點(diǎn)[7]，從而成為了研究熱點(diǎn)。Jung等[8]在托盤根中分離得到一種新的三萜皂苷，命名為crataegioside。魏忠寶等[2]在山楂葉懸鉤子的根部中分離獲得薔薇酸、吐曼酸、2α-羥基齊墩果酸和烏蘇酸等多種皂苷。李秋葉[9]從山楂葉懸鉤子根部的有機(jī)溶劑提取物中分離鑒定了10個(gè)烏蘇烷型皂苷。趙偉等[4]通過有機(jī)溶劑萃取和硅膠柱色譜等方法，從托盤根中鑒定得到多個(gè)皂苷類化合物，其中有齊墩果酸、熊果酸和蛇莓苷B。

皂苷又名皂苷素，廣泛存在于高等植物和一部分海洋生物，是一類較復(fù)雜的苷類化合物[10]。皂苷類化合物有多種較強(qiáng)的藥理活性，如抗氧化[11]、抗肥胖[12]、抗菌[13]、抗腫瘤[14?15]、肝保護(hù)[16]、抗炎[17]、免疫和降血糖等，具有一定的藥理價(jià)值。較為常見提取皂苷化合物的方法有浸漬法、滲漉法、回流法、酶解法、超聲和微波輔助提取法等[18]。其中熱回流法有經(jīng)濟(jì)、簡單、容易操作等優(yōu)點(diǎn)[19]。同時(shí)，RSM被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分提取技術(shù)的研究，是較為常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法之一[20]。目前，還沒有關(guān)于托盤根皂苷類化合物提取工藝的相關(guān)報(bào)道，本研究基于單因素的考察，利用Box-Behnken RSM對(duì)托盤根總皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定托盤根提取物的體外抗氧化活性，為提高托盤根總皂苷的得率和進(jìn)一步開發(fā)為天然抗氧化劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

托盤根 采自吉林市外郊，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李勇教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物托盤（Rubus crataegifoliusBunge.）的干燥根；香草醛、冰醋酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸、甲醇、無水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠；齊墩果酸、2,2’-聯(lián)氨-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨鹽（ABTS） 美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 阿拉丁生化試劑。

FA1004N電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；UV-2000紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器廠；Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；DK-98-ll旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 天津天泰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 托盤根總皂苷的提取 取適量的托盤根洗凈后置于60 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，干燥后的托盤根粉碎，過60目篩，稱取粉末3 g，加入250 mL圓底燒瓶中，再加入乙醇，熱水回流提取2次。抽濾后合并濾液。濾液濃縮、凍干，制得托盤根總皂苷提取物。

1.2.2 總皂苷含量測定方法 參照文獻(xiàn)[21]的試驗(yàn)方法，并稍加改動(dòng)，標(biāo)準(zhǔn)品為齊墩果酸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=26.163c?0.006，R2=0.9998，式中：A為吸光度，c為皂苷質(zhì)量濃度，mg/mL。

含量測定：將制備所得的總皂苷提取物溶于甲醇中，定容至50 mL，配得待測溶液。吸取0.1 mL待測溶液加入10 mL容量瓶，平行3組，按上文方法測定其吸光度，計(jì)算托盤根總皂苷得率。

式中，W為托盤根總皂苷得率（%）；c為測定皂苷的濃度（mg/mL）；V為供試液的體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；M為托盤根生藥材質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過研究不同液料比（10:1、15:1、20:1、30:1、40:1 mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）、提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）對(duì)得率的影響，在研究單因素影響時(shí)，選取其余因素中間值為固定提取條件，選擇對(duì)得率影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為參考，選擇液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)要素為自變量，以托盤根總皂苷的得率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心組實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化熱回流提取工藝，用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和分析，試驗(yàn)要素與水平如表1所示。

表 1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.5 抗氧化實(shí)驗(yàn) 抗氧化活性測定參照文獻(xiàn)[22]的方法并稍加改動(dòng)。托盤根總皂苷提取物按照上述最佳工藝制得，并溶于80%乙醇溶液中。

DPPH自由基清除能力測定：配制1 mg/mL的樣品溶液50 mL，再依次稀釋為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL。配制0.1 mg/mL的陽性對(duì)照VC溶液50 mL，再依次稀釋為0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.0025 mg/mL。取100 μL樣品溶液加入100 μL的0.16 mmol/L DPPH溶液中，常溫避光孵育30 min后在波長517 nm處測定吸光度A1，用甲醇代替樣品溶液，測定吸光度A2，實(shí)驗(yàn)平行三次，計(jì)算DPPH·清除率。ABTS+自由基清除能力測定：將88 μL140 mmol/L的過硫酸鉀和5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液混合，常溫避光孵育16 h，將得到的ABTS用水稀釋至在734 nm波長下測得吸光度為0.70±0.02。配制1 mg/mL的樣品溶液50 mL，再依次稀釋為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL。配制0.16 mg/mL的陽性對(duì)照VC溶液50 mL，再依次稀釋為0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.0025 mg/mL。取10 μL樣品溶液加入190 μL的ABTS工作液中，常溫避光孵育6 min后在波長734 nm處測定吸光度A1，用甲醇代替樣品溶液，測定吸光度A2，計(jì)算ABTS+·清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)處理采用Excel2016和SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行結(jié)果和方差分析，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)托盤根總皂苷得率的影響 如圖1所示，液料比在10:1~30:1 mL/g范圍內(nèi)，總皂苷得率緩慢升高，且在液料比30:1 mL/g時(shí)有最大得率2.868%，但隨著液料比的繼續(xù)增加，總皂苷的得率卻開始下降。原因可能是提高液料比可以明顯提升生藥材與溶液的接觸面積，讓有效成分的擴(kuò)散速率得到提升。當(dāng)液料比為30:1 mL/g時(shí)，有效成分析出完全，如果液料比繼續(xù)增加，則會(huì)不斷溶出更多非皂苷成分，干擾總皂苷得率，增加成本[23?24]。因此選用液料比30:1 mL/g為最佳工藝提取條件。

圖 1 液料比對(duì)總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on total saponin yield

圖 2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentrations on total saponin yield

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)托盤根總皂苷得率的影響如圖2所示，乙醇濃度在50%~70%范圍內(nèi)，總皂苷得率明顯提高，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)有最大得率3.115%，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，總皂苷的得率開始下降?？赡苁且?yàn)椴煌愋驮碥疹惢衔锶芙舛炔煌斜P根中的皂苷類化合物在70%的乙醇中溶解度較好，且部分皂苷在較高溫度下會(huì)分解[25?27]。因此選用乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為最佳工藝提取條件。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)托盤根總皂苷得率的影響 由圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間在1~2 h范圍內(nèi)時(shí)，托盤根總皂苷得率隨之升高，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，總皂苷的得率最高，為2.874%，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加，總皂苷得率開始下降。原因可能是由于提取時(shí)間過長，細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)溶出阻礙了皂苷溶出通道，導(dǎo)致得率降低[28?29]。因此選用提取時(shí)間2 h為最佳工藝提取條件。

圖 3 提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on total saponin yield

2.1.4 提取溫度對(duì)托盤根總皂苷得率的影響 如圖4所示，當(dāng)提取溫度在75~95 ℃范圍內(nèi)時(shí)，托盤根總皂苷得率總體呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)提取溫度在80、85和95 ℃時(shí)，總皂苷得率分別為2.854%、2.929%和2.972%，其原理可能是提取溫度的不同能夠影響皂苷分子項(xiàng)提取溶劑擴(kuò)散的速度，但較高的溫度并不會(huì)進(jìn)一步提升皂苷得率，同時(shí)考慮成本、資源等多重因素[30?31]，采用85 ℃作為最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

使用Design-Expert 8.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)得到三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表 2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

本試驗(yàn)中，1、5、14、15、16 為五組中心試驗(yàn)，其他均為析因試驗(yàn)，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中包括析因點(diǎn)和零點(diǎn)，自變量A、B、C對(duì)應(yīng)的三維頂點(diǎn)為析因點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，估算試驗(yàn)誤差。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，可得到托盤根總皂苷得率與主要因素間的關(guān)系方程為：Y（%）=3.49?0.12A+0.052B?4.250E?0.003C+0.030AB+0.028AC?0.056BC?0.28A2?0.32B2?0.29C2。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，一次項(xiàng)的偏回歸系數(shù)絕對(duì)值A(chǔ)>B>C，表明對(duì)總皂苷得率的影響最大的是液料比，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間?？傇碥盏寐驶貧w模型方差分析結(jié)果見表3。

表 3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression model analysis of variance results

從表3可以看出，對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃突貧w系數(shù)的方差分析結(jié)果顯示P=0.0011<0.05，表明該回歸模型水平顯著；一次項(xiàng)A具有顯著影響（P<0.05）；在二階因子中，A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P<0.01）；失擬項(xiàng)P值>0.05，表明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合性良好，根據(jù)模型確決定系數(shù)R2=0.9474，表明測量值和預(yù)測值之間吻合度較高，校正RAdj2=0.8797，表明托盤根總皂苷得率有87.97%的程度受這三個(gè)因素影響，實(shí)驗(yàn)誤差小，準(zhǔn)確率高。變異系數(shù)（CV）反映模型的可信度，本實(shí)驗(yàn)的CV值為3.42，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較好。因此，該模型適用于托盤根總皂苷提取結(jié)果的分析預(yù)測。

所構(gòu)建模型的響應(yīng)面及等高線關(guān)系由圖5所示，托盤根總皂苷的得率隨著各因素水平變化而變化，等高線圖的維度可反映相互作用的強(qiáng)弱，在圖5中可直觀地看出AC、AB、BC即液料比和提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有一定影響，驗(yàn)證了方差分析表中的結(jié)果。

圖 5 各因素交互作用對(duì)托盤根總皂苷得率的影響Fig.5 Effects of interaction of various factors on yield of total saponins from Rubus crataegifolius

根據(jù)所得到的模型，預(yù)測托盤根總皂苷的最佳提取工藝為：提取時(shí)間1.99 h，乙醇濃度70.74%，液料比27.96:1 mL/g。于此條件，托盤根總皂苷的得率理論上可達(dá)3.49%。根據(jù)實(shí)際工作條件，將其調(diào)整為：提取時(shí)間2 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，液料比28:1 mL/g。于此條件，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝驗(yàn)證，實(shí)際所得到的托盤根總皂苷得率為3.37%。

賀紅軍等[32]采用正交試驗(yàn)法對(duì)茅莓總皂苷提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，在乙醇濃度80%，提取時(shí)間3 h，液料比20:1 mL/g，提取溫度80 ℃的條件下，茅莓總皂苷的得率為1.994%，較托盤根總皂苷的得率稍低。通過比較，證明托盤根中含有較為豐富的皂苷類化合物，在同屬植物中皂苷得率較高。

2.3 體外抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 DPPH·清除試驗(yàn)結(jié)果 從圖6可以看出，質(zhì)量濃度在0.025~1 mg/mL之間托盤根提取物的DPPH·清除率（13.82%~91.24%）小于質(zhì)量濃度在0.0025~0.1 mg/mL之間VC的清除率（14.85%~92.24%）。托盤根提取物DPPH·清除率的IC50值為0.0782 mg/mL，VC清除率的IC50值為0.0051 mg/mL，清除效果均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.00625~0.025 mg/mL之間時(shí)，DPPH·清除效果明顯提高，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.025 mg/mL時(shí)，DPPH·清除效果略有提高。韋一飛[33]比較了山莓根總多酚和VC的抗氧化活性，山莓根的DPPH·清除能力稍大于VC。結(jié)果表明，托盤根皂苷提取物對(duì)DPPH·的清除能力低于VC，且低于同屬植物的多酚類化合物。

圖 6 DPPH·清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability

2.3.2 ABTS+·清除試驗(yàn)結(jié)果 從圖7可以看出，質(zhì)量濃度在0.025~1 mg/mL之間托盤根提取物的ABTS+·清除率（19.48%~84.38%）小于質(zhì)量濃度在0.0025~0.16 mg/mL之間VC的清除率（25.83%~94.89%）。托盤根提取物ABTS+·清除率的IC50值為0.2770 mg/mL，VC清除率的IC50值為0.0053 mg/mL。托盤根提取物清除自由基的能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。汪禮洋[34]比較了樹莓中的兩種花色苷的ABTS+·清除作用，花色苷RA1和花色苷A2的ABTS+·的清除率均大于VC。說明托盤根提取物對(duì)ABTS+·的清除活性低于VC，低于同屬其他植物。2.3.3自由基清除試驗(yàn)結(jié)果 從圖8可以看出，質(zhì)量濃度0.025~1.6 mg/mL之間托盤根提取物的清除率（5.88%~70.58%）略低于質(zhì)量濃度在0.0025~0.16mg/mL之間VC的清除率（3.65%~73.17%）。托盤根提取物對(duì)的清除率的IC50值為0.9954mg/mL，VC清除率的IC50值為0.0972 mg/mL。蔡成林等[35]比較了紅莓葉和黑莓葉總黃酮提取物的抗氧化活性，紅莓葉和黑莓葉提取物的的清除率均大于VC。說明托盤根提取物對(duì)的清除能力低于VC，在同屬植物中處于較低水平。

圖 7 ABTS+·清除能力Fig.7 ABTS+· scavenging ability

圖 8 清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging ability

3 結(jié)論

以托盤干燥根為原料，通過乙醇回流法提取總皂苷，在液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最佳提取條件為：提取時(shí)間2 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，液料比28:1 mL/g，此條件下托盤根總皂苷得率為3.37%，與預(yù)測值相近。體外抗氧化試驗(yàn)表明，托盤根提取物對(duì)DPPH·、ABTS+·清除力都較高，但其清除力較VC低；對(duì)的清除力稍弱，其IC50值分別為0.0782、0.2770、0.9954 mg/mL。因此，托盤根提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。本研究為托盤根的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。