邵伯悅，馬春麗，余鵬飛，王家栩，賈麗麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

我國高血壓患者的人數(shù)持續(xù)走高，2019年約有2.45億高血壓患者，且患者越來越年輕化[1]，由于高血壓是引起心腦血管疾病和中風(fēng)的危險(xiǎn)因素[2]，因此很多學(xué)者就高血壓問題進(jìn)行了長期且深入的研究。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)血壓的一部分，主要是由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，是系統(tǒng)的主要組成部分之一[3]；此外，緩激肽也會(huì)被ACE所降解，從而達(dá)到舒張血管的作用。因此，通過抑制ACE活性并防止血管緊張素轉(zhuǎn)化為有效形式化合物的方法，可以減輕高血壓癥狀[4]。盡管降壓藥在調(diào)節(jié)血壓中起著基本作用，但它們通常會(huì)出現(xiàn)多種副作用，因此，許多研究人員在食品中尋求諸如生物肽之類的ACE抑制物質(zhì)，以使此類肽可用于高血壓的預(yù)防和治療[5?6]。

ACE抑制肽是蛋白質(zhì)水解生成的一種小分子肽，通過抑制ACE活性，讓血管緊張素不能轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到緩解高血壓的作用[7]。有研究報(bào)道，一些乳酸菌Lb. helveticus、Lb. delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lc. lactissubsp.cremoris、Lc. lactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis在發(fā)酵過程中通過水解牛奶中的蛋白可以釋放ACE抑制肽[8?9]，且已有幾種ACE抑制肽在發(fā)酵乳[10]和干酪[11]中被鑒定出來，此外，通過模擬計(jì)算的方法還探究ACE抑制肽的作用機(jī)制[12?13]。Solanki等[14]用Lb. rhamnosusMTCC 5945制備發(fā)酵駝奶，分析其ACE抑制活性，并分離鑒定了新的ACE抑制肽。

本試驗(yàn)?zāi)康氖菑?7株乳酸菌中，篩選出一株發(fā)酵牛乳富產(chǎn)ACE抑制肽且具有益生菌潛力的菌株，為抗高血壓發(fā)酵乳的研發(fā)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室保存的27株乳酸菌 11株菌C2、C5~C13、Q6分離自干酪，13株菌M1~M13分離自生牛乳，另外3種為雙歧桿菌（Bifidobacterium）、鼠李糖乳桿菌（Lb. rhamnosus）、植物乳桿菌（Lb. plantarum）；MRS液體培養(yǎng)基 青島海博生物；脫脂乳粉 紐仕蘭新云電子商務(wù)有限公司；馬尿酰-組胺酰-亮氨酸（HHL）、ACE（來自兔肺，酶活0.1 UN） 上海源葉；胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 大連美侖生物技術(shù)公司；鄰苯二甲醛 Biotopped公司；乙酸乙酯 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；雷磁PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的初篩

1.2.1 發(fā)酵乳制備 從?80 ℃冰箱中取出保藏的27株乳酸菌，在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃活化12 h，將活化的菌株，按照2%（v/v）的接種量接種到滅菌復(fù)原脫脂乳（10%，w/v）中，37 ℃培養(yǎng)至乳凝固后，轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱，以停止進(jìn)一步酸化。取樣測(cè)定pH、滴定酸度、蛋白水解活力和ACE抑制率。

1.2.2 pH測(cè)定 將凝固的發(fā)酵乳漩渦震蕩后取5 mL進(jìn)行pH測(cè)定。

1.2.3 滴定酸度的測(cè)定 酸度值以吉爾涅爾度（°T）表示，方法參照GB 5009.239-2016。

1.2.4 蛋白水解活性測(cè)定 采用OPA法對(duì)蛋白水解度進(jìn)行測(cè)定[15]。以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品的蛋白水解活力以μg/mL亮氨酸為單位。

取2.5 g樣品，加入1 mL去離子水，5 mL 1.0%的三氯乙酸，振蕩混勻后靜置，3000×g離心5 min，取0.4 mL上清液與3 mL OPA溶液混勻后靜置2 min，在340 nm測(cè)吸光值。

1.2.5 發(fā)酵乳ACE抑制活性的測(cè)定 發(fā)酵乳清的制備：測(cè)定樣品pH，將pH調(diào)至4.6后，5000 r/min離心15 min，保留上清液，再將pH調(diào)節(jié)至8.3后，5000 r/min離心15 min，保留上清液。

方法參照Cushman等[16]、張秋紅[17]并略作修改。取5 mL離心管，加入5 mmol/L HHL底物為0.05 mol/L的硼酸鈉緩沖液200 μL，再加入100 μL待測(cè)乳清，混合，在37 ℃水浴中預(yù)熱3 min，加入20 μL ACE酶液，在37 ℃水浴中等待30 min，再加入250 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。加入1.7 mL乙酸乙酯，振蕩15 s，4000 r/min離心10 min，取上層的1 mL乙酸乙酯，加熱揮發(fā)去除有機(jī)溶劑，再加入3 mL去離子水，并振蕩搖勻，用紫外分光光度計(jì)在228 nm測(cè)定樣品吸光值。按照以下公式計(jì)算ACE抑制率：

式中，A為樣品組吸光度值；B為對(duì)照組吸光度值；C為空白組吸光度值。

1.2.6 體外模擬人工胃腸消化 人工胃液、腸液參照藥典[18]進(jìn)行配制。參照陳儀婷等[19]方法并略作修改。取樣品5 mL，測(cè)定其乳清樣品的ACE抑制率；將剩余發(fā)酵乳以10%添加到人工胃液中，然后37 ℃水浴消化3 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，取樣測(cè)定其ACE抑制率；再將其以10%添加到人工腸液中，然后37 ℃水浴消化3 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，再取樣測(cè)定其ACE抑制率。

1.3 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的復(fù)篩

1.3.1 菌株的酸耐受性試驗(yàn) 參照黃燕燕等[20]方法并略作修改。將MRS培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為3.0、4.0、5.0，pH為6.0的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照組，分裝至各試管。以2%接種量分別接種至上述MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h后取菌液，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算酸耐受性，即：

其中：Nt、N0分別為試驗(yàn)組樣品和對(duì)照組樣品中的活菌數(shù)（CFU mL?1）。

1.3.2 菌株的膽鹽耐受性試驗(yàn) 參照陳大衛(wèi)等[21]方法并略作修改。將乳酸菌以2%量接種于含有0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)3 h，以不加膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照組，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。按下列公式計(jì)算菌株的膽鹽耐受性：

其中：Nt、N0分別為試驗(yàn)組樣品和對(duì)照組樣品中的活菌數(shù)（CFU mL?1）。

1.3.3 菌株的鹽耐受性試驗(yàn) 參照孫杰等[22]方法并略作修改。將乳酸菌以2%量接種于含NaCl質(zhì)量濃度為4 g/100 mL的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后取菌液，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以不加NaCl的MRS培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算鹽耐受性，即：

其中：Nt、N0分別為試驗(yàn)組樣品和對(duì)照組樣品中的活菌數(shù)（CFU·mL?1）。

1.4 菌株16S rDNA鑒定

將篩選的菌株送至吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定，并將鑒定結(jié)果經(jīng)RDP數(shù)據(jù)庫[23?24]比對(duì)后，使用MEGA 7.0軟件[25]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用X ±SD表示，并采用方差分析，相關(guān)性比較模塊，采用Origin8.0進(jìn)行作圖，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的初篩

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的27株乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定pH、滴定酸度、蛋白水解活力及ACE抑制率，所得結(jié)果見表1。

表 1 發(fā)酵乳pH、滴定酸度、蛋白水解活力、ACE抑制活性結(jié)果Table 1 Results of fermented milk pH, titration acidity, protein hydrolysis activity, and ACE inhibition activity

結(jié)果顯示，不同菌株間的這些性能存在很大差異，由不同乳酸菌發(fā)酵酸乳的ACE抑制活性在60%以上的有6株，它們是M11、M3、M10、Bifidobacterium、M12、M6，抑制活性最高的是菌株M11，抑制率為76.84%±1.98%，其次是M3，抑制率為71.94%±1.39%。ACE抑制率小于30%的有11株乳酸菌，最低的只有3.79%±1.79%。樣品的pH在4.40~5.10之間，滴定酸度在45~85 °T之間，菌株M10、M5、M11、M2、M6、M3、C7具有相對(duì)較高的產(chǎn)酸性能。蛋白水解活性在100 μg/mL亮氨酸以上的菌株有6株，它們是C11、M10、C7、M9、M12、M13。

乳酸菌發(fā)酵脫脂乳的ACE抑制活性作為篩選菌株的直接指標(biāo)，篩選出發(fā)酵乳ACE抑制活性在60%以上的菌株6株。乳酸菌M11、M3、M10、M12和M6的蛋白水解能力都在80 μg/mL亮氨酸以上，具有相對(duì)較高的蛋白水解能力；乳酸菌M11、M3、M10和M6的滴定酸度都在70 °T以上，具有較好的產(chǎn)酸能力，因此選擇M3、M6、M10和M11進(jìn)行接下來的試驗(yàn)。

2.2 乳酸菌在模擬胃腸液中ACE抑制活性的變化

如圖1所示，不同乳酸菌的發(fā)酵乳經(jīng)人工胃液和腸液作用后，所得ACE抑制活性變化有很大差異。菌株M3在胃液和腸液作用后，ACE抑制活性先升高后降低，但仍顯著高于消化前（P<0.05），為74.96%±1.73%，且顯著高于其他菌株（P<0.05）；M6、M10、M11在胃液和腸液作用后均逐漸降低，分別為49.21%±2.20%、58.80%±3.67%、62.66%±2.68%。菌株M3先上升的原因可能是因?yàn)樵谖傅鞍酌傅淖饔孟?，一些大的氨基酸殘基被水解成小分子的多肽，使得ACE抑制肽的濃度變大，抑制活性增強(qiáng)；而在胰蛋白酶的作用下，一些小分子多肽被進(jìn)一步分解成無活性的游離氨基酸或者是氨基酸殘基，使得ACE抑制活性下降。對(duì)于另外3株乳酸菌，在胃蛋白酶及胰蛋白酶作用下ACE抑制活性逐漸下降，可能是因?yàn)樵械木哂蠥CE抑制活性的肽被分解，無活性的肽或者游離氨基酸比例增大造成的[26?27]。

圖 1 人工模擬胃液腸液對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of artificial simulated gastric and intestinal fluids on ACE inhibitory activity

2.3 菌株酸耐受性

益生菌在人體中發(fā)揮益生菌功能的前提是能夠順利通過胃酸構(gòu)成的生物屏障，穩(wěn)定粘附于腸上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)定植[28]。食物在胃中存留的時(shí)間大約為1~3 h[29]，因此選擇3 h作為耐受時(shí)間。在食用乳制品后，胃液的pH一般在3左右[30]，因此，能夠在胃腸道中發(fā)揮作用的乳酸菌必須對(duì)酸有很強(qiáng)的耐受性。試驗(yàn)菌株酸耐受性結(jié)果如圖2所示，在pH為3.0~5.0的范圍內(nèi)，隨著酸度的增加，菌株的酸耐受性在逐漸下降，在pH3時(shí)，菌株的酸耐受性降至10%~30%，菌落數(shù)大約為7 lg CFU mL?1，依然滿足益生菌的推薦攝入量大于6 lg CFU mL?1劑量[30]。因此，菌株M3、M6、M10、M11均能耐受胃酸環(huán)境且保持一定的活菌數(shù)。

圖 2 菌株的酸耐受性Fig.2 Acid tolerance of the strains

圖 3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.4 菌株膽鹽耐受性

人體小腸內(nèi)的膽鹽含量約為0.3%，食物通過一般需要1~4 h。因此，乳酸菌應(yīng)具有一定的膽鹽抗性，并在經(jīng)過小腸時(shí)仍能維持活力，發(fā)揮益生菌作用[31]。試驗(yàn)菌株的膽鹽耐受性如表2所示，菌株M3經(jīng)0.3%膽鹽作用3 h后，膽鹽的耐受性為37.50%±2.47%，顯著高于其他菌株（P<0.05），M10最低為24.09%±0.31%。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，經(jīng)0.3%膽鹽作用3 h后，4株試驗(yàn)菌株活菌數(shù)均高于益生菌推薦攝入量。因此，4株乳酸菌均具有膽鹽耐受性。

表 2 菌株的膽鹽耐受性Table 2 Bile salt tolerance of the strains

2.5 菌株鹽耐受性

乳酸菌的耐鹽性也是評(píng)價(jià)乳酸菌品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。NaCl在人體內(nèi)的質(zhì)量濃度為1~4 g/mL[32]。高鹽會(huì)導(dǎo)致高滲透壓，細(xì)胞失水造成胞質(zhì)分離[33]。表3所示為試驗(yàn)菌株的鹽耐受性結(jié)果，添加4% NaCl后，菌株的耐鹽性大約在20%~40%，其中M3的鹽耐受性是最高的，為37.32%±1.84%，說明高鹽抑制了菌株的存活率，而乳酸菌有一定的鹽耐受性，使得菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果在7 lg CFU mL?1以上，依然滿足推薦益生菌攝入的最低攝入量。因此，四株乳酸菌均具有一定的鹽耐受性，其中M3的鹽耐受性更強(qiáng)。

表 3 菌株的鹽耐受性Table 3 Salt tolerance of the strains

2.6 菌株16S rDNA鑒定

經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn)，菌株M3的ACE抑制活性為71.94%±1.39%，能耐受人工胃腸液環(huán)境，且該菌具有較好的產(chǎn)酸性能和蛋白水解活性，能耐受模擬消化環(huán)境，保持活菌數(shù)量。送樣測(cè)定M3菌株的16S rDNA序列，并經(jīng)RDP數(shù)據(jù)庫比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）后發(fā)現(xiàn)，M3菌株與Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei的同源性在99%以上，因此乳酸菌菌株M3是Lb. paracaseisubsp.paracasei。

3 結(jié)論

本研究顯示，試驗(yàn)菌株間的ACE抑制活性存在較大差異，經(jīng)初篩獲得菌株M3、M6、M10和M11有較高的ACE抑制活性，同時(shí)具有較好的產(chǎn)酸或蛋白水解性能，經(jīng)模擬胃腸消化后，菌株M3的ACE抑制活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)并保持較高活性，另外3株乳酸菌的ACE抑制活性都呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。在環(huán)境耐受性的試驗(yàn)中，4株乳酸菌都呈現(xiàn)出對(duì)酸、膽鹽、鹽的良好耐受性，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，都能滿足推薦益生菌攝入量的最低量（6 lg CFU mL?1），尤其是M3菌株，呈現(xiàn)出更高的環(huán)境耐受性。M3菌株經(jīng)16S rDNA菌株鑒定為Lb. paracaseisubsp.paracasei。此外，該菌株如何抑制ACE活性以及在體內(nèi)是否具有抗高血壓能力，還需要進(jìn)一步研究。