黃海巖，劉新宇，蔡葵蒸

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

禽流感（Avian Influenza，AI）是一種由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的易感染禽類（雞、鴨、鵝）以及哺乳動(dòng)物和人的人畜共患病。該病主要以呼吸道飛沫傳播為主，因而傳播速度快，嚴(yán)重危害著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。人的感染主要是接觸患病的禽類及其排泄物，糞口傳播亦能引起感染，雖未見人和人的傳播，但對公共衛(wèi)生及人類健康造成的威脅不可小覷。國際獸疫局將禽流感定為A類傳染病，我國也將其列為一類動(dòng)物傳染病。禽流感病毒在分類上屬于正黏病毒科，根據(jù)病毒的核蛋白和膜蛋白等特性的差異，又分為A、B、C三型[1]，A型最易引起傳染，宿主多樣，能夠感染禽、豬、馬和人類，每次流行時(shí)感染范圍大，常導(dǎo)致世界性的大流行[2]。

流感病毒有2種表面抗原，分別為血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA），依次將該病毒分為若干亞型。根據(jù)報(bào)道，已知有H亞型16個(gè)（H1～H16），N亞型10個(gè)（N1～N10）[3]。據(jù)研究，世界各地的海鳥和水禽都是流感的天然貯存宿主[4,5]。

由于流感病毒的變異，人感染流感是由于禽類貯存宿主流感病毒的遺傳物質(zhì)重現(xiàn)所引起[6]。AIV最早感染人的亞型是H7N7，是從人的眼分泌物中分離得到，1997年我國香港發(fā)生H5N1型AIV感染人并導(dǎo)致死亡的病例，突破了只有H1、H2、H3亞型AIV感染人及哺乳動(dòng)物的界限[7]。本研究中涉及H7N9亞型AIV，曾經(jīng)有一段時(shí)間認(rèn)為并不感染人，但自從2013年首次發(fā)現(xiàn)人類感染以來，病例不斷增多且有蔓延趨勢，至2017年累計(jì)感染人1 344例，其中511人死亡，致死率高達(dá)38%[8]，應(yīng)引起公共衛(wèi)生界的高度關(guān)注。

AIV基因組是由8條單股的RNA片段構(gòu)成，這些片段編碼10種病毒蛋白，其中2個(gè)較小的RNA片段編碼了2種非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural proteins，NS）[9]，分別為NS1和NS2，它們由2個(gè)讀碼框翻譯，NS1蛋白分子量為22～28 KD，是一個(gè)易活性的轉(zhuǎn)錄活性劑[10]。NS2的閱讀框不連續(xù)分子量為12 KD。NS1蛋白是唯一的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子，具有N端RNA結(jié)合R和C端效應(yīng)區(qū)兩個(gè)功能域[11]。NS1蛋白是一個(gè)參與禽流感病毒致病力的主要蛋白質(zhì)，在感染早期與宿主蛋白發(fā)生相互作用后就大量表達(dá)，主要聚集于宿主細(xì)胞核內(nèi)，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生早期感染的抗體。據(jù)此可以區(qū)分野毒感染和人工免疫抗體，作為禽流感早期診斷指標(biāo)[12]，NS1還可抑制宿主蛋白的表達(dá)與轉(zhuǎn)運(yùn)[13]，可能扮演著損害被病毒感染宿主細(xì)胞的重要角色，在病毒致病性中發(fā)揮著重要作用。因此，NS1在禽流感免疫學(xué)研究及病毒早期診斷中有較大的應(yīng)用價(jià)值。

王晶鈺等[14]對H9N2亞型禽流感病毒NS1基因進(jìn)行了原核表達(dá)和真核表達(dá)研究。本研究的目的是擴(kuò)增H7N9亞型禽流感病毒分離株NS1基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，同時(shí)利用293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，為日后進(jìn)一步研究NS1蛋白的功能及H7N9亞型禽流感的診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 H7N9亞型禽流感病毒株系中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供和保存。病毒接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，無菌收集死亡后雞胚的尿囊液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細(xì)胞系和菌株 DH5a感受態(tài)細(xì)胞及293T細(xì)胞，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所畜禽疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要試劑設(shè)備 本研究中主要試劑及儀器見黃海巖等[15]關(guān)于A型禽流感病毒H7N9株M1基因的克隆和表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5.0）設(shè)計(jì)特異性引物，其序列如下：5’-GATGTCG ACCATGGATTCCAATACTGTGTC-3’為上游引物，5’-CTGGCGGCCGCCTACTTTGTAGAGAG TGG-3’為下游引物，引物由華大基因公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物大小預(yù)期為654 bp。

1.2.2 總RNA提取和PCR擴(kuò)增 按照試劑盒的操作說明書，直接從雞胚尿囊液中抽提所需試驗(yàn)病毒株的基因組RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的接種說明書合成cDNA。擴(kuò)增目的基因的PCR體系為50 μl；模板cDNA 0.05 μl（50 mg），NS1上下引物各2.5 μl，5*PCR buffer 10 μl，dNTP 1 μl，DNA聚合酶1 μl，補(bǔ)去離子水至50 μl，按照黃海巖等[15]報(bào)道的方法設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后于4℃保存。

1.2.3 NS1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 參照王晶鈺等[14]的方法，將上述PCR產(chǎn)物與真核表達(dá)載體PRK-FLAG雙酶切后，在T4連接酶的作用下鏈接，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒PRK-FLAG-NS1，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，再經(jīng)Sa1 I和Not I內(nèi)切酶，PCR鑒定，菌液送華大基因公司測序鑒定。

1.2.4 重組NS1基因在293T細(xì)胞中的表達(dá) 取培養(yǎng)在10%胎牛血清中的傳三代293T細(xì)胞，參照杜江龍等和王晶鈺等的方法，重組NS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞，在37℃、5% CO2條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析 參照王晶鈺等[14]的方法收集培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，用0.5%胰酶消化細(xì)胞，離心等處理后作為蛋白電泳的樣品。部分樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色；部分樣品置于轉(zhuǎn)膜中進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 NS1基因RT-PCR擴(kuò)增

以A型流感病毒H7N9株的總RNA為模板完成RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得大小約650 bp左右條帶（見圖1）。查閱相關(guān)資料，與預(yù)期和NS1基因?qū)嶋H大小相符合。

圖1 A型流感病毒H7N9株NS1基因RTPCR產(chǎn)物凝膠結(jié)果

2.2 NS1基因的酶切鑒定

經(jīng)雙酶切獲得NS1基因條帶，NS1基因大小為654 bp（見圖2），證明NS1基因真核重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。由圖2可知，左側(cè)和右側(cè)分別為15 000 bp、2 000 bp 的marker，NS1基因的條帶位于500～750 bp。

圖2 A型流感病毒H7N9株NS1基因的重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 Western Blot蛋白鑒定

轉(zhuǎn)染pRK-FLAG-NS1后的293T細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白可以被FLAG抗體識(shí)別，且重組蛋白實(shí)際大小與預(yù)期大小相同，空載體沒有陽性結(jié)果，說明NS1基因在293T細(xì)胞中成功表達(dá)（見圖3）。此外，蛋白印記表明，H7N9-NS1的蛋白大小為23.9 KD，與基因大小相符。

圖3 A型流感病毒H7N9株FLAG-NS1的蛋白印記表達(dá)

3 討論

本研究利用RT-PCR克隆出禽流感H7N9亞型分離株NS1基因，基因大小與引物設(shè)計(jì)片段一致，經(jīng)陰性克隆、酶切鑒定，構(gòu)建了NS1基因真核重現(xiàn)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞裂解后進(jìn)行Western Blot分析，獲及的蛋白大小為23.9 KD，與預(yù)期結(jié)果相符，從而在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中成功表達(dá)了NS1蛋白。

目前世界上高度重視有關(guān)禽流感的研究。流感病毒的傳統(tǒng)檢測方法包括血清學(xué)試驗(yàn)和免疫熒光技術(shù)等，雞卵培養(yǎng)多是診斷流感不同亞型的確切依據(jù)，但病毒培養(yǎng)由于耗時(shí)費(fèi)力、工作量大，難以在實(shí)際生產(chǎn)中實(shí)施。分子生物學(xué)診斷技術(shù)發(fā)展迅猛，如RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）、RRT-PCR（實(shí)時(shí)RT-PCR）、RT-LAMP（逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）和基因芯片技術(shù)，這些技術(shù)檢測禽流感需要的樣品量少，具有特異性好、敏感性強(qiáng)、最為有效等特點(diǎn)。

研究表明，NS1蛋白作為ELISA檢測抗體，能成功區(qū)分野毒感染馬和人工免疫馬[16]。Tumpey等研究證明[17]，NS1蛋白作為檢測抗體可以區(qū)分野毒感染雞群和滅活疫苗接種雞群[18]，顯示出其未來在疫苗免疫和野毒感染的鑒別診斷方向有著廣闊的應(yīng)用前景。