王禛， 王上增， 余鵬， 游明燦

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院，河南鄭州 450002；3.上海市第二康復(fù)醫(yī)院，上海 201900；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450052）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head）是靜脈堵塞或股骨頭血供的損壞或中斷，最終導(dǎo)致股骨頭細(xì)胞死亡，甚至股骨頭塌陷的病理生理過程[1-2]，與髖關(guān)節(jié)局部的骨、脂肪代謝等因素密切相關(guān)，多為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head）或者是股骨頭無菌性壞死（aseptic necrosis of the femoral head），治療難度較大，發(fā)病率逐年上升，且致殘率較高。目前，股骨頭壞死病因仍未完全明確，尚缺少有效的治療方法。對于晚期股骨頭壞死患者，骨壞死區(qū)域塌陷或骨折時(shí)，需要采取髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)方式來獲得更好的療效[3]。除卻病因、疾病進(jìn)展過程復(fù)雜之外，本病也缺乏理想化的動(dòng)物模型。因此，建立合適的股骨頭壞死動(dòng)物模型，對于進(jìn)一步研究股骨頭壞死的合理治療方案具有重要意義，本研究采用髖關(guān)節(jié)脫位聯(lián)合液氮冷凍法建立兔創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級4個(gè)月齡雄性日本大耳白兔28只，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，購于河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXK（豫）2016-0002。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，室溫為20~26℃。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作方案已經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審議批準(zhǔn)[IACUC號：20161201]，實(shí)驗(yàn)過程中遵循“3R”原則。

1.2 藥物、試劑與儀器烏拉坦溶液、注射用水合氯醛、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；多聚甲醛溶液（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。5605-IECX射線機(jī)（德國西門子公司）；3.0T Singna HDxt核磁共振（MRI）（美國GE公司）；BH-2光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 兔創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型的制備

1.3.1 造模前準(zhǔn)備適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無異常即可開始實(shí)驗(yàn)。所有兔均選擇右側(cè)髖關(guān)節(jié)進(jìn)行模型制備。用蒸餾水配制20%的烏拉坦溶液對動(dòng)物進(jìn)行麻醉，正式制備模型前給所有兔稱質(zhì)量，每只兔麻醉劑量為5 mL/kg（可視具體情況增加1~2 mL），麻醉方式為耳緣靜脈麻醉。

1.3.2 模型制備麻醉成功后，將兔側(cè)臥位固定在操作臺上，備皮。確定切口，暴露股骨頭，尋找體表骨性標(biāo)志，確定股骨大轉(zhuǎn)子。沿股骨大轉(zhuǎn)子內(nèi)側(cè)緣行長約5 cm的弧形手術(shù)切口，切開皮膚后，剝離淺筋膜，剝離深筋膜，暴露臀大肌后使用彎鉗鈍性分離臀大肌，顯露并撥開臀中肌，顯露臀小肌與梨狀肌，顯露股骨大轉(zhuǎn)子。沿大轉(zhuǎn)子切斷部分梨狀肌肌肉附著，暴露髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊，“T”形切開關(guān)節(jié)囊，內(nèi)收內(nèi)旋右下肢。暴露股骨頭，切斷股骨頭圓韌帶，脫位股骨頭，并將股骨頸近端骨膜組織全部切除。

1.3.3 液氮冷凍固定股骨頭，使用一次性無菌棉簽蘸取液氮置于股骨頭負(fù)重區(qū)，大約停留8 s后撤離，冷凍后使用溫生理鹽水（約40℃）對局部復(fù)溫。如此反復(fù)操作3次后，使用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，使用可吸收縫合線依次縫合肌肉、深筋膜、淺筋膜及皮膚?？p合完畢后使用碘伏紗布消毒，消毒后無菌敷料加壓包扎。

1.3.4 造模后處理造模后當(dāng)天即開始使用20萬IU青霉素鈉肌肉注射預(yù)防術(shù)后感染，持續(xù)使用5 d。造模后定期對手術(shù)切口進(jìn)行清潔換藥，2 d/次。換藥時(shí)密切觀察切口愈合情況，直至切口愈合。最終成功造模兔25只。造模后4、8周分別處死12、13只兔。定期觀察造模后兔精神狀態(tài)、活動(dòng)、二便等一般情況。

1.4 兔股骨頭壞死模型評價(jià)指標(biāo)與方法

1.4.1 影像學(xué)觀察造模后4、8周分別對兔進(jìn)行X線攝片觀察股骨頭情況；造模后4、8周分別進(jìn)行兔雙髖關(guān)節(jié)MRI檢查觀察雙側(cè)股骨頭情況。

1.4.2 組織學(xué)觀察使用空氣栓塞法分批處死兔，無菌條件下手術(shù)取出右側(cè)股骨頭，置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定浸泡24 h后放入EDAT脫鈣液中進(jìn)行脫鈣。脫鈣成功后，用石蠟切片機(jī)對包埋后的股骨頭組織標(biāo)本進(jìn)行切片。對切片進(jìn)行脫蠟和HE染色。最后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理形態(tài)，計(jì)算空骨陷窩率，計(jì)算方法：鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，空骨陷窩率=空骨陷窩總計(jì)數(shù)/骨陷窩總計(jì)數(shù)。以術(shù)后造模側(cè)股骨頭組織學(xué)表現(xiàn)可見軟骨剝脫、鏡下觀察到空骨陷窩率增加為判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 造模動(dòng)物一般情況造模過程中因麻醉劑過量致兔死亡2只，因手術(shù)時(shí)間較長致兔死亡1只，余存活良好。無感染動(dòng)物病例。造模后2周內(nèi)，兔精神狀態(tài)較術(shù)前萎靡，日?；顒?dòng)減少，不活躍，飲食量較術(shù)前減少，體質(zhì)量減輕，二便正常。造模2周后，一般情況較前好轉(zhuǎn)，但較術(shù)前仍欠佳。觀察可得，兔在被抓取時(shí)有明顯的懼怕感。造模4周時(shí)，造模兔有不同程度的跛行，患肢力量減弱，彈跳無力。造模后8周，造模兔無法彈跳，跛行較前加重，患肢力量明顯減弱。

2.2 造模后兔股骨頭X線表現(xiàn)圖1結(jié)果顯示：造模后4周，患側(cè)股骨頭表面光整，股骨頭彌漫性骨質(zhì)疏松，骨小梁稍模糊，出現(xiàn)局限性骨密度增高，骨質(zhì)硬化，股骨頭周圍骨質(zhì)變薄。造模后8周，患側(cè)間隙未見明顯變窄，股骨頭輕度變形，股骨頭形態(tài)尚可，股骨頭密度不均勻，可見囊性破壞，股骨頸增寬，髖臼邊緣增生。

圖1 造模后兔股骨頭X線檢查表現(xiàn)Figure 1 X-ray performance of rabbit femoral head after modeling

2.3 造模后MRI情況圖2結(jié)果顯示：造模后4周，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)形態(tài)可，右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨變薄，可見稍長T1長T2信號，右側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙可見少量條片狀液體信號影。造模后8周，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)形態(tài)尚可，右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)可見表面軟骨脫落，可見稍長T1長T2信號。

圖2 造模后兔股骨頭MRI檢查情況Figure 2 MRIperformance of rabbit femoral head after modeling

2.4 股骨頭組織學(xué)觀察圖3結(jié)果顯示：造模后4周，光鏡下可見骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變細(xì)、部分破裂，呈不規(guī)則現(xiàn)象，骨陷窩空虛，骨細(xì)胞減少，造血細(xì)胞減少，骨小梁周圍骨細(xì)胞減少。造模后8周，光鏡下可見骨小梁間隙變大，骨小梁破壞嚴(yán)重，壞死區(qū)空骨陷窩明顯增多，骨小梁間骨髓組織脂肪細(xì)胞增多，可見部分壞死骨細(xì)胞，骨細(xì)胞核固縮、碎裂，骨小梁周圍成骨細(xì)胞稀少甚至消失。

圖3 造模后兔股骨頭組織學(xué)圖像（HE染色，×200）Figure 3 Histological features of rabbit femoral head after modeling（by HE staining，×200）

造模后8周組織學(xué)發(fā)現(xiàn)空骨陷窩率增加，為8%~12%，超過正常兔股骨頭軟骨下區(qū)空骨陷窩率，符合達(dá)到股骨頭壞死的標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功。具體結(jié)果見表1。

表1 造模后兔股骨頭組織空骨陷窩率Table 1 The rate of empty osseous lacunae in the femoral head after rabbit modeling （±s，%）

表1 造模后兔股骨頭組織空骨陷窩率Table 1 The rate of empty osseous lacunae in the femoral head after rabbit modeling （±s，%）

時(shí)間造模后4周造模后8周兔數(shù)（只）12 13空骨陷窩率8.09±3.04 11.85±1.49

3 討論

股骨頭壞死在臨床中是造成患者疼痛，甚至殘疾的重要病因，嚴(yán)重影響了患者的生產(chǎn)能力和活動(dòng)能力[4]。對于股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備，主要以激素型股骨頭壞死、乙醇攝入型股骨頭壞死和創(chuàng)傷性股骨頭壞死為主。目前，激素型、乙醇攝入型股骨頭壞死動(dòng)物模型制備技術(shù)都相對成熟，激素型股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備方法主要有單一激素使用、激素聯(lián)合內(nèi)毒素或動(dòng)物血清等方法。酒精性股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備方法主要為局部酒精注射方式。創(chuàng)傷性股骨頭壞死近年來在臨床也較多見，其動(dòng)物模型制備方法主要有外科手術(shù)下頭頸部血管結(jié)扎、破壞髓內(nèi)外血供、股骨頸骨折、物理誘導(dǎo)等方式。曲春濤[5]利用導(dǎo)航裝置鉆孔后對鴯鹋行液氮冷凍和射頻加熱交替的方法處理從而獲得創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型，但是，制作導(dǎo)航裝置會增加實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，加大實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān)。Vélez等[6]、Swiontkowski等[7]通過血管結(jié)扎、股骨頸骨折等方法來獲得股骨頭壞死模型，這都需要外科手術(shù)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，學(xué)習(xí)曲線較長，加大實(shí)驗(yàn)難度，且每個(gè)人手術(shù)技術(shù)有差異，重復(fù)性一般。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同周期冷凍方法直接影響股骨頭壞死造模效果。液氮冷凍股骨頭壞死具有造模周期短、動(dòng)物死亡率低的優(yōu)點(diǎn)，因而成為相對較常采用的創(chuàng)傷性股骨頭壞死造模方法。本實(shí)驗(yàn)方法通過髖關(guān)節(jié)脫位聯(lián)合液氮冷凍股骨頭的造模方法較王江泳等[9]、楊述華等[10]的實(shí)驗(yàn)方法造模成功率高，且更早出現(xiàn)股骨頭壞死；與周正麗[11]的造模方法比較，因加入了兔髖關(guān)節(jié)MRI對造模結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，評價(jià)方法更加客觀多樣，更具參考性。

本實(shí)驗(yàn)在參照Wen等[12]以及李玉龍[13]的造模方法基礎(chǔ)上，結(jié)合髖關(guān)節(jié)脫位法制備兔創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型，術(shù)中切斷了兔股骨頭圓韌帶、脫位股骨頭后，使用液氮冷凍法直接冷凍股骨頭表面，冷凍位置更加精確；再使用溫生理鹽水對其進(jìn)行復(fù)溫，可以很好地?fù)p傷股骨頭，有效縮短股骨頭壞死的疾病進(jìn)程，同時(shí)，縮短造模手術(shù)時(shí)長，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)周期。此造模方法雖不能模擬創(chuàng)傷性股骨頭壞死疾病的發(fā)病進(jìn)程，無法進(jìn)行創(chuàng)傷性股骨頭壞死病因?qū)W的研究，但對于后續(xù)臨床治療性研究以及對比不同治療方式療效，可以起到很大的作用。

術(shù)后4周X線片顯示，患側(cè)股骨頭表面光整，可見股骨頭彌漫性骨質(zhì)疏松，骨小梁稍模糊，出現(xiàn)局限性骨密度增高，骨質(zhì)硬化，股骨頭周圍可見骨質(zhì)變薄。拍攝MRI結(jié)果顯示：雙側(cè)髖關(guān)節(jié)形態(tài)可，右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨變薄，可見稍長T1長T2信號，右側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙可見少量條片狀液體信號影。組織學(xué)顯示：骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變細(xì)、部分破裂，呈不規(guī)則現(xiàn)象，骨陷窩空虛，骨細(xì)胞減少，造血細(xì)胞減少，骨小梁周圍骨細(xì)胞減少；造模術(shù)后4周造模側(cè)股骨頭骨質(zhì)輕度破壞，局部周圍組織發(fā)生水腫，但MRI檢查未顯示發(fā)生壞死。光鏡下觀察組織學(xué)特點(diǎn)，可見骨小梁變細(xì)、部分破裂，說明經(jīng)過液氮處理的股骨頭局部骨組織被破壞，但并未出現(xiàn)壞死。

術(shù)后8周X線片可見，患側(cè)間隙未見明顯變窄，股骨頭輕度變形，股骨頭形態(tài)尚可，股骨頭密度不均勻，可見囊性破壞，股骨頸增寬，髖臼邊緣增生。拍攝MRI結(jié)果顯示：右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)可見表面軟骨脫落，可見稍長T1長T2信號。組織學(xué)顯示：骨小梁間隙變大，骨小梁破壞嚴(yán)重，壞死區(qū)空骨陷窩明顯增多，骨小梁間骨髓組織脂肪細(xì)胞增多，可見部分壞死骨細(xì)胞，骨細(xì)胞核固縮、碎裂，骨小梁周圍成骨細(xì)胞稀少甚至消失。股骨頭壞死包括了骨頭內(nèi)部的病理改變，這些改變在MRI信號出現(xiàn)前就已存在，目前，MRI檢查在臨床早期發(fā)現(xiàn)診斷股骨頭壞死中較敏感[14]。本實(shí)驗(yàn)X線攝片及MRI檢查可發(fā)現(xiàn)造模側(cè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)股骨頭壞死早期表現(xiàn)，如軟骨脫落、股骨頭形態(tài)變化、局部骨組織密度變化不均等。組織學(xué)觀察則更為直觀，造模術(shù)后第8周組織學(xué)的表現(xiàn)符合股骨頭壞死診斷。通過影像學(xué)和組織學(xué)觀察后發(fā)現(xiàn)此方法對于創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型制備較為合適。

在選擇合適的動(dòng)物模型及造模方式時(shí)，所選擇的動(dòng)物應(yīng)易于喂養(yǎng)，造模方法應(yīng)難度較低，整體可重復(fù)性好。已有選擇鴯鹋作為實(shí)驗(yàn)造模動(dòng)物[15]，該雙足動(dòng)物在下肢負(fù)重、負(fù)重質(zhì)量上和人類有更高的相似度，相對來說可以更好地模擬人類雙足活動(dòng)的特點(diǎn)，但因其價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)困難，且對較大體積的動(dòng)物進(jìn)行造模操作時(shí)難度較大，故不作為實(shí)驗(yàn)造模動(dòng)物的首選。兔為四足動(dòng)物，其繁殖力強(qiáng)、易于獲得、飼養(yǎng)簡單，較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬等價(jià)格低廉[4，16]，且臨床早中期股骨頭壞死患者診斷明確之后需減少負(fù)重，兔為四足動(dòng)物，后肢負(fù)重較少，也利于研究股骨頭壞死的后續(xù)治療方法及療效[17]，是目前研究的較好選擇。但此動(dòng)物模型制備方法在模擬股骨頭壞死疾病發(fā)生發(fā)展方面還存在不足，家兔與人的股骨近端形態(tài)學(xué)、血管分布等都有一定的差異，兔股骨頭更小、股骨頸更短，頸干角較人類小，且兔股骨頭頸結(jié)合部骨小梁分布相對疏松，以及股骨頸干交界處無骨小梁分布，更有利于滋養(yǎng)動(dòng)脈穿過從而到達(dá)股骨頭，更有利于股骨頭缺血性壞死的修復(fù)等，這些與人類有較大差異。目前，我們尚未尋找到完美的模型動(dòng)物，這也就需要在以后的研究中尋找更為合適、更為接近人類解剖結(jié)構(gòu)的動(dòng)物模型進(jìn)行研究[18]。

綜上所述，本研究通過使用液氮冷凍法聯(lián)合髖關(guān)節(jié)脫位法制備兔股骨頭壞死模型，操作簡單，造價(jià)低廉，可重復(fù)性好，動(dòng)物死亡率低，對于后續(xù)臨床治療性研究以及對比不同治療方式治療創(chuàng)傷性股骨頭壞死療效可以起到支撐作用。但本實(shí)驗(yàn)中尚存在一定的不足：①未設(shè)置對照組，只研究了單種造模方法，未直接與其他造模方法進(jìn)行直觀比較；②模型評價(jià)未使用CT、骨掃描等技術(shù)進(jìn)一步豐富實(shí)驗(yàn)資料；③模型適用于早中期股骨頭壞死治療的研究，可以相應(yīng)縮短總體研究時(shí)長，但未能增加時(shí)間序列，觀察股骨頭壞死的早期修復(fù)過程。以上均有待下一步研究完善。