彭鑫玉， 張海濤， 葛穎杰， 蔡淼鑫， 辛鵬飛， 王睿，李林鵬， 賴斌， 樊粵光， 龐智暉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院全國中醫(yī)髖關(guān)節(jié)病重點(diǎn)?？?，廣東廣州 510405；3.樊粵光廣東省名中醫(yī)傳承工作室，廣東廣州 510405）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis）是一種常見的老年退行性關(guān)節(jié)病，又稱增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)病。該病好發(fā)于髖、膝、踝等下肢負(fù)重關(guān)節(jié)，病變常常累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜等組織，最終導(dǎo)致患病關(guān)節(jié)疼痛、畸形和運(yùn)動(dòng)功能障礙，大大降低了患者的生活質(zhì)量[1-2]。骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”的范疇?！稘?jì)生方》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹，皆因體虛，腠理空虛，受風(fēng)寒濕氣而痹也?！北宰C的形成內(nèi)因是正氣不足，外因是風(fēng)、寒、濕邪的侵入，內(nèi)虛外感而成痹。關(guān)節(jié)康為廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，是樊粵光教授以補(bǔ)腎活血法為組方依據(jù)，集臨床近20年的經(jīng)驗(yàn)研制而成，治療骨性關(guān)節(jié)炎療效確切[3]。關(guān)節(jié)康由熟地黃、補(bǔ)骨脂、杜仲、枸杞、丹參、川芎、紅花、木香、牛膝、木瓜等10味中藥組成，具有補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀之功效。既往研究表明，關(guān)節(jié)康通過促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成，抑制軟骨基質(zhì)的分解進(jìn)程，可達(dá)到促進(jìn)病變關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的目的[4-5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建復(fù)方-中藥有效成分-靶點(diǎn)基因-骨性關(guān)節(jié)炎疾病共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)交集基因進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步探討關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用及后期試驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 關(guān)節(jié)康活性化合物及其作用靶點(diǎn)預(yù)測在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）中，分別檢索關(guān)節(jié)康中熟地黃、杜仲、枸杞、丹參、川芎、紅花、木香、牛膝、木瓜9味中藥。再依據(jù)毒藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ADME），以生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18為限定條件，篩選9味中藥的有效成分及其作用靶點(diǎn)。因在TCMSP中未能檢索出補(bǔ)骨脂，故應(yīng)用中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm）來預(yù)測補(bǔ)骨脂的作用靶點(diǎn)，其通過“藥物相似性分?jǐn)?shù)”的原理進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，藥物相似性分?jǐn)?shù)指利用解剖-治療-化學(xué)的藥物分類系統(tǒng)（ATC）、藥物的副作用，化合物相互作用計(jì)分的相似度，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中心趨向性，功能富集相似度等計(jì)算得出各類相似分?jǐn)?shù)，并通過LODO（leave-one-drug-out）法對(duì)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確保預(yù)測更為精確。即：將關(guān)節(jié)康中藥的大寫拼音分別輸入至TCMSP或BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中，并將預(yù)測靶點(diǎn)基因的條件設(shè)置為默認(rèn)值，得出10味中藥的化合物成分及其預(yù)測的靶標(biāo)基因。

1.2 骨性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)檢索以“osteoarthritis”為檢索詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）（https://omim.org/）2個(gè)在線數(shù)據(jù)庫中檢索骨性關(guān)節(jié)炎已知相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索出的疾病靶點(diǎn)匯總?cè)ブ睾蟮玫焦切躁P(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因篩選獲取關(guān)節(jié)康相關(guān)預(yù)測作用靶點(diǎn)和骨性關(guān)節(jié)炎已知疾病靶點(diǎn)后，用R語言運(yùn)行腳本取兩者靶點(diǎn)基因重疊交集，將交集基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫（http://stringdb.org/）進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過R語言運(yùn)行腳本分析計(jì)算每個(gè)靶點(diǎn)基因的鄰接基因數(shù)目（即靶點(diǎn)基因之間相互作用的連線數(shù)目），并采用Excel作條狀圖以直觀顯示。

1.4 關(guān)節(jié)康-靶點(diǎn)-骨性關(guān)節(jié)炎疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了進(jìn)一步了解關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，將上述3步得到的“關(guān)節(jié)康-靶點(diǎn)-骨性關(guān)節(jié)炎”靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件（http://www.cytoscape.org）進(jìn)行關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎疾病可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建，其結(jié)構(gòu)關(guān)系為“關(guān)節(jié)康-10味中藥-有效化合物-靶點(diǎn)-骨性關(guān)節(jié)炎”。

1.5 基因本體論（GO）分析GO分析是一個(gè)在生物信息學(xué)領(lǐng)域中廣泛運(yùn)用的系統(tǒng)，它包括生物學(xué)的3個(gè)方面：細(xì)胞組分、分子功能、生物過程。DAVID數(shù)據(jù)庫是一個(gè)集生物功能注釋、網(wǎng)絡(luò)可視化和集成發(fā)現(xiàn)于一身的多功能生物信息數(shù)據(jù)庫。本研究應(yīng)用DAVID分析工具（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)超幾何分布定量（P值）評(píng)價(jià)存在于各GO注釋中的蛋白質(zhì)群，以P值反映蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的顯著性。將物種與背景設(shè)置為“Homo sapiens”（人類），設(shè)定P＜0.01，得到關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分結(jié)果。采用ImageGP在線作圖工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）制作GO分析結(jié)果氣泡圖。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析算法原理與GO富集分析相同。應(yīng)用DAVID工具對(duì)關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路分析（設(shè)定P<0.01），將物種與背景設(shè)置為“Homo sapiens”（人類），得到關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的主要作用通路，并對(duì)其通路進(jìn)行分析，采用ImageGP在線作圖工具制作KEGG通路氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)康有效化合物、作用靶點(diǎn)及骨性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果通過TCMSP和BATMANTCM平臺(tái)檢索總共預(yù)測到關(guān)節(jié)康的有效化合物95個(gè)，其中，熟地黃1個(gè)，木香3個(gè)，木瓜2個(gè)，紅花14個(gè)，枸杞子9個(gè)，杜仲20個(gè)，丹參52個(gè)，川芎4個(gè)，川牛膝3個(gè)，補(bǔ)骨脂4個(gè)，中藥之間存在17個(gè)共同有效化合物。隨后，獲得其作用靶點(diǎn)共257個(gè)。通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫共篩選獲得骨性關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)共2 868個(gè)。取兩者靶點(diǎn)的交集，最終獲得關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點(diǎn)共109個(gè)。見圖1。

圖1 關(guān)節(jié)康和骨性關(guān)節(jié)炎疾病的交集靶點(diǎn)基因圖Figure 1 Venny diagram of intersection targets of Guanjie Kang and osteoarthritis

2.2 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點(diǎn)基因相互作用可視化網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因篩選結(jié)果利用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了交集靶點(diǎn)基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)包含38個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，659條相互作用關(guān)系，即節(jié)點(diǎn)間的連接線。然后從STRING輸出string_interactions.tsv，并將其輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，使用“CytoNCA”插件對(duì)該蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型做關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選，以該網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)度值（Degree）大于平均值，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)基因38個(gè)。

圖2 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎交集基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Protein-protein interaction network of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.3 關(guān)節(jié)康-靶點(diǎn)-骨性關(guān)節(jié)炎疾病可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)采用Cytoscape 3.7.2軟件將關(guān)節(jié)康-靶點(diǎn)-骨性關(guān)節(jié)炎疾病繪制可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3），圖中清晰可見關(guān)節(jié)康中10味中藥與有效化合物、有效化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、關(guān)鍵靶點(diǎn)基因與骨性關(guān)節(jié)炎疾病之間分別的對(duì)應(yīng)關(guān)系。關(guān)鍵靶點(diǎn)基因所連接的有效化合物越多，表明度值越大，該靶點(diǎn)則更重要。網(wǎng)絡(luò)中，右邊V字四邊形38個(gè)節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，左邊三角形95個(gè)節(jié)點(diǎn)為有效化合物。錯(cuò)綜復(fù)雜的“邊”（連線），代表了關(guān)節(jié)康中10味中藥所含的多種有效化合物通過多條途徑作用于靶點(diǎn)基因。

圖3 關(guān)節(jié)康-靶點(diǎn)-骨性關(guān)節(jié)炎疾病可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Visual controlling network of Guanjie Kangtarget-osteoarthritis

2.4 交集基因的GO富集分析結(jié)果應(yīng)用DAVID在線分析工具對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，將P值設(shè)定為（P≤0.01）并按照P值升序排列獲得49個(gè)功能富集，其中，包括生物過程29個(gè)，分子功能10個(gè)，細(xì)胞組分10個(gè)。選取排名前10位的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分繪成氣泡圖（見圖4），圖中氣泡顏色越深，氣泡越大，則表示功能富集的基因數(shù)目越多，該功能富集更為重要。GO富集分析結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集關(guān)鍵基因的生物過程主要是RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和DNA模板、藥物反應(yīng)、一氧化氮（NO）生物合成過程的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、血管生成、基因表達(dá)的正調(diào)控、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等；分子功能為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、生長因子活性、細(xì)胞因子活性、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活活性-RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性等；細(xì)胞組分為細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、胞質(zhì)、血小板-阿爾法顆粒管腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞核、質(zhì)膜外側(cè)面、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、核漿、受體復(fù)合體等。

圖4 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集基因的GO富集分析結(jié)果Figure 4 Go enrichment analysis results of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.5 關(guān)鍵基因的KEGG富集分析結(jié)果關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集的關(guān)鍵靶基因的KEGG富集分析結(jié)果主要涉及癌癥通路、南美錐蟲病（美洲錐蟲?。?、TNF信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染、癌癥中的蛋白多糖等信號(hào)通路。見圖5。

圖5 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集的關(guān)鍵靶基因的KEGG富集分析結(jié)果Figure 5 KEGG enrichment analysis results of key Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，初步挖掘、分析關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制，并針對(duì)目前相關(guān)性較強(qiáng)且文獻(xiàn)研究較充足的通路進(jìn)行分析討論。通過GO富集分析顯示，關(guān)節(jié)康主要通過RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、NO生物合成過程的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、血管生成等作用于骨性關(guān)節(jié)炎疾病。生物過程中RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控的顯著性居于首位。目前研究發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液和組織中觀察到炎癥反應(yīng)，并且炎癥機(jī)制被認(rèn)為是促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的危險(xiǎn)因素[6]，而RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控與炎癥機(jī)制密切相關(guān)。脂多糖又稱內(nèi)毒素，通過激活Toll樣受體4，引發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB，從而啟動(dòng)一系列免疫相關(guān)基因[7-8]，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤，誘發(fā)或加重炎癥反應(yīng)[9]。故推測關(guān)節(jié)康可能通過RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)來控制炎癥進(jìn)而達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。

骨性關(guān)節(jié)炎的主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性丟失和破壞[10-11]，軟骨損傷時(shí)會(huì)分泌蛋白來修復(fù)受損的細(xì)胞外基質(zhì)，該過程可導(dǎo)致軟骨的內(nèi)環(huán)境平衡改變，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，影響凋亡通路，引起軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生[12]。受損的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生一種介導(dǎo)軟骨細(xì)胞雙重作用的多功能分子一氧化氮（NO）[13]，NO可以保護(hù)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，但NO升高可以抑制軟骨細(xì)胞中白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）的合成，而軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1RA可有效抑制軟骨的損傷與破壞，故NO升高異常是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[14]。骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管生成與炎性反應(yīng)相互影響[15]。骨性關(guān)節(jié)炎伴有滑膜炎癥，且病理特征為巨噬細(xì)胞浸潤，該細(xì)胞可分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[16]，VEGF可促進(jìn)血管生成，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)腔注射VEGF可誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎[17]。軟骨細(xì)胞肥大（軟骨細(xì)胞表型發(fā)生改變）和軟骨內(nèi)血管生成存在相互依存關(guān)系[18]，骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨內(nèi)血管生成可能誘發(fā)軟骨內(nèi)成骨，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)礦化[19]。因此，關(guān)節(jié)康可能通過作用于NO生物合成過程的正調(diào)控和血管生產(chǎn)等來調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨生產(chǎn)、凋亡、鈣化等而達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

通過KEGG富集分析，關(guān)節(jié)康主要通過癌癥通路、南美錐蟲?。乐掊F蟲病）、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染、癌癥中的蛋白多糖等作用于骨性關(guān)節(jié)炎疾病。其中腫瘤通路的顯著性最高，目前有研究顯示，在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤信號(hào)通路的高調(diào)控，說明骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織具有腫瘤樣特性，因此腫瘤通路可能為骨性關(guān)節(jié)炎治療和診斷的潛在靶點(diǎn)基因[20]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌和癌癥中的蛋白多糖與骨性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)，則是對(duì)上述觀點(diǎn)的再次驗(yàn)證。目前發(fā)現(xiàn)，TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[21]，TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿及關(guān)節(jié)液中的含量明顯高于正常人，并且TNF-α在關(guān)節(jié)內(nèi)的含量與骨性關(guān)節(jié)炎病變程度密切相關(guān)[22]。TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎中過度表達(dá)可導(dǎo)致滑膜增生肥厚，并引起關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)環(huán)境改變，加重骨性關(guān)節(jié)炎退化。因此，抑制TNF-α在滑膜中的表達(dá)，有利于降低骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率，減輕病變程度[23]。因關(guān)節(jié)軟骨中無血管，這限制了氧從滑液和軟骨下骨到軟骨細(xì)胞的擴(kuò)散[24]。HIF-1由2個(gè)不同的亞基HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α對(duì)軟骨細(xì)胞的存活具有重要作用[25]，HIF-2α是自噬通量的有效負(fù)調(diào)節(jié)因子[26]，對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎起著整體有害作用，HIF-2α介導(dǎo)軟骨破壞以及軟骨細(xì)胞死亡，均促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎病程的發(fā)展[27]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎與南美錐蟲?。乐掊F蟲?。?、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染等感染性疾病有直接聯(lián)系。因此，推測關(guān)節(jié)康可能通過調(diào)控TNF和HIF-1來達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)康可能是通過癌癥通路、TNF、HIF-1、NO生物合成過程的正調(diào)控、血管生成、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)等來治療骨性關(guān)節(jié)炎，但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎是多靶點(diǎn)、多通路、多選擇的復(fù)雜機(jī)制過程，是中醫(yī)藥防治疾病的整體觀念和辨證論治指導(dǎo)思想的有效印證，為進(jìn)一步理解關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供了重要的線索，更為中醫(yī)藥治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了新的研究思路。本研究的局限性在于僅對(duì)關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。