汪一帆， 陳觀平， 李穎， 應栩華

[1.浙江省立同德醫(yī)院（浙江省中醫(yī)藥研究院）中西醫(yī)結合腫瘤研究所，浙江杭州 310012；2.浙江省立同德醫(yī)院藥劑科，浙江杭州 310012]

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤，其中小細胞肺癌的5年生存率僅為7%，而非小細胞肺癌為21%，嚴重危害人類生命健康[1-2]。由于肺癌出現(xiàn)癥狀比較晚、早期不易被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，已發(fā)生局部或廣泛的轉移。轉移成為導致肺癌患者死亡的主要原因。中藥抑肺飲是浙江省立同德醫(yī)院治療肺癌的驗方，療效確切，前期研究證實抑肺飲可抑制肺癌細胞的生長，并可下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、核轉錄因子kappaB（NF-κB）、靶基因B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）表達水平[3]。VEGF是作用最強的促血管生長因子之一，可特異性促進內(nèi)皮細胞分裂與增殖，誘導細胞外基質降解以利于新生血管的生長，促進癌細胞進入血循環(huán)而形成轉移[4]。有研究顯示VEGF促進腫瘤侵襲轉移的機制與上皮間質轉化（EMT）密切相關[5-6]。NF-κB可以通過調(diào)控轉錄因子JunB的表達激活VEGF的轉錄[7]。因此，我們推測抑肺飲可能是通過腫瘤壞死因子α（TNF-α）-NF-κB信號通路調(diào)控VEGF，進而調(diào)節(jié)細胞EMT，抑制肺癌轉移。本研究中我們以TNF-α-NF-κB信號通路為靶點，從調(diào)控EMT的角度對抑肺飲干預肺癌的作用進行探討，以期為臨床上能有效運用抑肺飲治療肺癌提供基礎支持。現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器E-鈣黏蛋白（E-cadherin）單克隆抗體（美國BD Biosciences公司）；波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（美國Thermo Scientific公司）；磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；TNF-α（美國Pepro Tech公司）；胎牛血清（美國Gemini公司）；細胞培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（德國Sigma公司）；雙熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司）；第一鏈cDNA合成試劑盒、轉染試劑（瑞士Roche公司）。i3x多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；LightCycler 480 II熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；DM3000B正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 藥物及制備抑肺飲由黃芪、黨參、麥冬、半夏、野蕎麥根、川芎、蜈蚣等組成，其中藥材均購自杭州華東中藥飲片有限公司。稱取各味藥材，加水浸泡過夜，次日加入至10倍藥量的水，分2次煎煮，收集、合并2次濾液，最終濃縮成6.5 g/mL的藥液，分裝滅菌后保存于4℃冰箱備用。順鉑（DDP）（0.02 g/瓶，由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號：1WA2A1604021B）。

1.3 體外研究

1.3.1 細胞來源與培養(yǎng)人肺癌細胞A549購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，以含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃恒溫、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 含藥血清的制備40只雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購自浙江省實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK（浙）2014-0001。將SD大鼠隨機分為抑肺飲高、中、低劑量組和陰性對照組4組，每組各10只。抑肺飲高、中、低劑量組根據(jù)成人的臨床用藥劑量換算成相應大鼠高、中、低劑量（抑肺飲濃縮湯劑1.135 mL分別調(diào)整為3、6、12 mL）灌胃抑肺飲，陰性對照組按照3 mL/200 g體質量給予灌胃生理鹽水，每日2次，灌胃3 d。第3天在首次給藥2 h后，再次給藥。末次給藥1 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，于室溫靜置3 h，以2 500 r/min（最大半徑168 mm）、4℃離心25 min，取上清，滅活后微孔濾膜過濾除菌，分裝凍存。

1.3.3 MTT法檢測A549細胞的增殖情況消化、收集處于對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)整密度為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后分別加入5%、10%和20%的抑肺飲低、中、高劑量含藥血清及空白血清，設置4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后吸棄培養(yǎng)液，加入5 mg/mLMTT溶液，每孔10μL，孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 75μL終止反應。應用酶標儀于490 nm波長處測量吸光度值。調(diào)零孔設置：培養(yǎng)基、MTT、DMSO；對照孔設置：細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、DMSO。細胞抑制率（%）=（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.3.4 TNF-α誘導A549細胞EMT模型的建立將A549細胞按5×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，使用10 ng/mL濃度的TNF-α處理細胞7 d。觀察細胞形態(tài)的變化，并通過檢測細胞EMT標志物的表達情況，判定是否成功建立細胞EMT模型。

1.3.5 熒光定量PCR法檢測細胞EMT標志物E-cadherin和Vimentin的mRNA表達水平用10 ng/mL濃度的TNF-α處理細胞7 d后檢測細胞中E-cadherin和Vimentin的mRNA表達水平，判定是否成功誘導細胞EMT模型。另外，為了觀察抑肺飲對細胞EMT的作用，在10 ng/mL濃度的TNF-α刺激5 d后，分別加入5%空白血清和5%抑肺飲高劑量含藥血清處理48 h。PCR實驗步驟：首先根據(jù)NCBI搜索獲取的目標基因mRNA序列信息設計引物，引物序列見表1。應用TRIzol法提取細胞總RNA，進行反轉錄。進行PCR反應，擴增條件：95℃10 min預變性，95℃10 s、60℃10 s、72℃10 s，45個循環(huán)。結果分析：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt用藥組-ΔCt對照組，2-ΔΔCt為用藥組目的基因表達相對于對照組的變化倍數(shù)。

表1 熒光定量PCR擴增基因引物序列Table 1 Amplified gene primer sequence of fluorescence quantitative PCR

1.3.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測E-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65的蛋白表達水平用10 ng/mL濃度的TNF-α處理細胞7 d后檢測細胞中E-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平，判定是否成功誘導細胞EMT模型。為了觀察抑肺飲對細胞EMT和NF-κBp65磷酸化的作用，設置TNF-α+空白血清組和TNF-α+抑肺飲含藥血清組，在10 ng/mL濃度的TNF-α刺激5 d后，分別加入5%空白血清和5%抑肺飲高劑量含藥血清干預細胞48 h。Western Blot實驗步驟：用蛋白裂解液處理收集的細胞，離心后取上清，采用Bradford法進行蛋白定量。所得樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，再經(jīng)50 g/L脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，次日二抗孵育1 h，電化學發(fā)光（ECL）顯色等過程，最后應用ImageJ軟件分析電泳條帶的灰度值，以Actin為內(nèi)參，計算各組蛋白相對表達含量。

1.3.7 熒光素酶報告基因檢測細胞NF-κB信號通路活性將293T細胞（購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，該細胞適用于轉染實驗）以1.2×104個/孔的濃度接種于24孔板。待細胞生長到50%匯合度時，每孔細胞以100 ng NF-κB啟動子報告基因載體（由實驗室自行構建，將NF-κB response element克隆至pGL3-Basic載體構建而成）和10 ng海腎螢光素酶質粒pRL-TK（購自美國Promega公司）混合質粒進行共轉染。24 h后用10 ng/mL濃度的TNF-α、TNF-α+5%抑肺飲含藥血清、TNF-α+5%空白血清分別對細胞進行干預，48 h后以裂解液100μL/孔裂解細胞，使用雙熒光素酶檢測試劑盒對各組細胞的熒光素酶活性進行測定。

1.3.8 Transwell法觀察肺癌細胞侵襲能力細胞侵襲實驗在用Matrigel包被的Transwell裝置中進行。取24孔板，預先每孔加入500μL培養(yǎng)基（含EGF，實驗組含抑肺飲含藥血清，對照組含空白血清），置入Transwell，在內(nèi)室加入經(jīng)TNF-α誘導的A549細胞（150μL含0.5%血清的培養(yǎng)基），置于37℃培養(yǎng)箱。24 h后取出，用棉簽擦去膜靠近內(nèi)室那一面的細胞，再將Transwell置于甲醇中，室溫下固定15 min，結晶紫染色20 min，觀察穿孔細胞并進行拍照、計數(shù)。

1.3.9 劃痕實驗觀察肺癌細胞遷移能力先用記號筆在6孔板背面標記便于拍照時定位。細胞消化后接種到6孔板，待細胞鋪滿培養(yǎng)板后，用槍頭在培養(yǎng)板底部制造細胞劃痕，盡可能保持劃痕的寬度一致，洗去劃痕時產(chǎn)生的細胞碎片，拍照記錄。實驗組加入抑肺飲含藥血清，對照組加入空白血清，培養(yǎng)48 h后再次拍照。

1.4 體內(nèi)研究

1.4.1 小鼠肺癌移植瘤模型的建立60只雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體質量18~22 g，購自上海斯萊克下屬靈暢生物科技有限公司，動物質量合格證號：SCXK（滬）2013-0018。小鼠肺癌細胞LL/2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，以含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃恒溫、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的小鼠肺癌細胞LL/2，調(diào)整細胞密度至1×107個/mL，將細胞接種至小鼠右側后肢皮下，每只小鼠注射0.2 mL，建立肺癌移植瘤模型。

1.4.2 瘤體生長和肺轉移情況將成功構建模型的小鼠隨機分為6組，即模型組、順鉑組、抑肺飲聯(lián)合順鉑組及抑肺飲高、中、低劑量組，每組10只。次日開始給藥，根據(jù)成人的臨床用藥劑量換算出相應小鼠的用藥劑量，抑肺飲高、中、低劑量分別相當于成人等效劑量的20、10、5倍給藥。給藥方案：模型組（生理鹽水，0.5 mL/只）、順鉑組（3 mg/kg）、抑肺飲聯(lián)合順鉑組（抑肺飲10 g/kg+順鉑3 mg/kg）、抑肺飲高劑量組（20 g/kg）、抑肺飲中劑量組（10 g/kg）和抑肺飲低劑量組（5 g/kg）。腹腔注射順鉑，隔日1次，共4次；其余灌胃給藥，每日1次。每日記錄體質量及一般情況。末次給藥后24 h處死小鼠，解剖取瘤，稱體質量，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質量-治療組平均瘤質量）/模型組平均瘤質量×100%。取肺及腫瘤組織進行固定，取部分腫瘤組織提取RNA。蘇木素-伊紅（HE）染色后觀察肺部轉移灶。

1.4.3 免疫組織化學法檢測瘤組織p-NF-κB p65的表達將小鼠皮下移植瘤組織用10%福爾馬林溶液固定12 h后，進行常規(guī)石蠟包埋切片。脫蠟，水化，熱修復抗原，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化酶，封閉，一抗p-NF-κBp65（1∶100稀釋）37℃孵育，HRP標記的二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明和封片，鏡檢。

1.4.4 熒光定量PCR法檢測瘤組織B細胞淋巴瘤-xL（Bcl-xL）和細胞周期蛋白D1（CyclinD1）mRNA表達水平設置模型組、順鉑組、順鉑+抑肺飲組、抑肺飲高劑量組。PCR操作方法同“1.3.5”項。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素分析，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抑肺飲含藥血清對肺癌A549細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示：5%和10%濃度的抑肺飲高劑量含藥血清組細胞抑制率在用藥48 h后最高；在用藥24、48 h后，各組中基本都是5%濃度含藥血清的細胞抑制率最高。具體結果見表2。因5%高劑量抑肺飲含藥血清處理48 h抑制效果最佳，故作為后續(xù)實驗含藥血清的用藥劑量。

表2 抑肺飲含藥血清對A549細胞增殖的影響Table 2 Effect of Yifei Yin-containing serum on proliferation of A549 cells （±s）

表2 抑肺飲含藥血清對A549細胞增殖的影響Table 2 Effect of Yifei Yin-containing serum on proliferation of A549 cells （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與陰性對照組比較

組別陰性對照組抑肺飲低劑量組抑肺飲中劑量組抑肺飲高劑量組陰性對照組抑肺飲低劑量組抑肺飲中劑量組抑肺飲高劑量組陰性對照組抑肺飲低劑量組抑肺飲中劑量組抑肺飲高劑量組濃度（%）抑制率（%）0 1.63 2.29 4.87 0 6.20 5.92 5.41 0 6.12 7.78 9.20 5555 10 10 10 10 20 20 20 20 24 h吸光度值0.51±0.02 0.47±0.01①0.45±0.02②0.44±0.02②0.50±0.02 0.49±0.01 0.47±0.01 0.48±0.04 0.43±0.01 0.43±0.06 0.42±0.05 0.42±0.06抑制率（%）0 7.01 11.80 12.84 0 1.97 5.75 3.33 0 1.15 3.00 3.00 48 h吸光度值0.65±0.03 0.64±0.03 0.61±0.04 0.46±0.02②0.68±0.01 0.68±0.04 0.68±0.05 0.64±0.03 0.58±0.10 0.57±0.11 0.53±0.08 0.54±0.12抑制率（%）0 2.82 6.19 30.23 0 0.84 1.17 6.26 0 0.73 7.99 5.92 72 h吸光度值0.77±0.03 0.75±0.03 0.75±0.01 0.73±0.03 0.79±0.10 0.74±0.05 0.74±0.10 0.74±0.04 0.92±0.02 0.86±0.12 0.85±0.09 0.83±0.06

2.2 肺癌細胞EMT模型的建立A549細胞用TNF-α連續(xù)刺激7 d后形態(tài)發(fā)生較為明顯變化，細胞由團聚生長狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài)。收集細胞，應用Western Blot法發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導后下游信號分子NF-κB p65的磷酸化水平增強，TNF-α-NF-κB信號通路被活化。具體結果見圖1。進一步應用熒光定量PCR和Western Blot法檢測細胞EMT標志物的表達水平，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后上皮表型標志物E-cadherin mRNA和蛋白表達水平明顯下降，間質表型標志物Vimentin mRNA和蛋白表達水平明顯升高。具體結果見表3、圖1。結果證實成功誘導了細胞EMT模型。

圖1 TNF-α誘導對A549細胞EMT標志物蛋白及NF-κB p65的磷酸化表達水平的影響Figure 1 Effect of TNF-αinduction on levels of protein expression of EMT markers and phosphorylation of NF-κB p65 in A549 cells

表3 TNF-α誘導對A549細胞EMT標志物mRNA表達水平的影響Table 3 Effect of TNF-αinduction on mRNA expression levels of EMT markers in lung cancer A549 cells （±s）

表3 TNF-α誘導對A549細胞EMT標志物mRNA表達水平的影響Table 3 Effect of TNF-αinduction on mRNA expression levels of EMT markers in lung cancer A549 cells （±s）

①P＜0.01，與對照組比較

組別對照組TNF-α組Vimentin mRNA（fold change）1.00 1.62±0.03①E-cadherin mRNA（%）100.00 33.39±1.42①

2.3 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞NF-κB信號通路活性的影響通過熒光素酶報告基因檢測實驗觀察抑肺飲對NF-κB信號通路活性的影響。結果顯示，TNF-α能提高A549細胞NF-κB p65活性，而加入抑肺飲含藥血清后，NF-κBp65相對活性明顯低于正常血清組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），具體結果見表4。結果表明，抑肺飲對TNF-α誘導的肺癌細胞NF-κB信號通路活化有明顯的抑制作用。

表4 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞NF-κB信號通路活性的影響Table 4 Effectof YifeiYin on activity of NF-κBsignaling pathway in TNF-α-induced A549 cells （±s）

表4 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞NF-κB信號通路活性的影響Table 4 Effectof YifeiYin on activity of NF-κBsignaling pathway in TNF-α-induced A549 cells （±s）

①P＜0.01，與對照組比較；②P＜0.01，與TNF-α+空白血清組比較

相對活性（FL/RL）（螢火蟲熒光素酶Firefly Luciferase/海腎熒光素酶Renilla Luciferase）1.00 152.60±23.13①115.35±23.39 41.37±14.49②組別對照組TNF-α組TNF-α+空白血清組TNF-α+抑肺飲含藥血清組

2.4 抑肺飲對TNF-α誘導的肺癌A549細胞EMT標志物及NF-κBp65磷酸化表達水平的影響在A549細胞EMT模型建立的基礎上，用抑肺飲含藥血清進行干預，采用熒光定量PCR法觀察抑肺飲含藥血清是否能夠調(diào)控NF-κBp65磷酸化和細胞EMT。結果顯示，TNF-α+抑肺飲含藥血清組的NF-κB p65磷酸化水平與TNF-α+空白血清組比較，呈下降趨勢，具體結果見圖2。檢測EMT標志物發(fā)現(xiàn)，TNF-α+抑肺飲含藥血清組E-cadherin的表達水平要明顯高于TNF-α+空白血清組。相反，Vimentin的mRNA表達水平在TNF-α+空白血清組中要顯著高于TNF-α+抑肺飲含藥血清組（P<0.01），具體結果見表5。采用Western Blot法檢測2組細胞中EMT標志物的蛋白表達水平，檢測結果與mRNA的變化趨勢一致，具體結果見圖2。上述研究結果表明，抑肺飲可能通過抑制TNF-α-NF-κB信號通路的激活來調(diào)節(jié)肺癌細胞EMT。

圖2 抑肺飲對A549細胞EMT標志物蛋白及NF-κB p65的磷酸化表達水平的影響Figure 2 Effects of Yifei Yin on the levels of protein expression of EMT markers and phosphorylation of NF-κB p65 in A549 cells

表5 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞EMT標志物mRNA表達水平的影響Table 5 Effect of Yifei Yin on the mRNA expression levels of EMT markers in TNF-α-induced A549 cells （±s）

表5 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞EMT標志物mRNA表達水平的影響Table 5 Effect of Yifei Yin on the mRNA expression levels of EMT markers in TNF-α-induced A549 cells （±s）

①P＜0.01，與TNF-α+空白血清組比較

組別TNF-α+空白血清組TNF-α+抑肺飲含藥血清組Vimentin mRNA（%）100 58.04±0.57①E-cadherin mRNA（fold change）1.00 2.25±0.10①

2.5 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞侵襲和遷移能力的影響為觀察抑肺飲對肺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，在建立TNF-α誘導A549細胞EMT模型的基礎上用抑肺飲含藥血清進行干預。侵襲實驗結果可見，細胞培養(yǎng)48 h后，抑肺飲含藥血清組穿過Transwell的細胞數(shù)顯著少于空白血清組（P<0.05）。具體結果見表6，圖3-A。表明抑肺飲具有抑制肺癌細胞侵襲能力的作用。遷移實驗結果發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)48 h后，空白血清組的細胞劃痕間隙與抑肺飲含藥血清組相比，明顯變窄。具體結果見表6，圖3-B。結果表明，抑肺飲具有抑制肺癌細胞遷移能力的作用。

圖3 A549細胞的侵襲實驗（A）（×100）和遷移實驗（B）（×100）結果Figure 3 Results of A549 cell invasion assay（A）（×100）and migration assay（B）（×100）

表6 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞侵襲和遷移能力的影響Table 6 Effects of Yifei Yin on invasion and migration of TNF-α-induced A549 cells （±s）

表6 抑肺飲對TNF-α誘導的A549細胞侵襲和遷移能力的影響Table 6 Effects of Yifei Yin on invasion and migration of TNF-α-induced A549 cells （±s）

①P＜0.01，與TNF-α+空白血清組比較

組別TNF-α+空白血清組TNF-α+抑肺飲含藥血清組遷移距離（%）100 36.31±2.55①侵襲細胞數(shù)（%）100 87.22±1.34①

2.6 動物模型的建立取60只C57BL/6小鼠，均成功建立Lewis肺癌移植瘤模型。從第7天起，各組小鼠右側后肢處開始陸續(xù)出現(xiàn)皮下結節(jié)。第9天起，結節(jié)生長速度明顯加快，以模型組最為明顯。抑肺飲聯(lián)合順鉑組移植瘤生長速度最慢，順鉑組僅次于抑肺飲聯(lián)合順鉑組。除順鉑及聯(lián)合用藥組外，其他各組小鼠體質量基本逐漸增加，具體結果見圖4。表明各劑量抑肺飲對小鼠無明顯的毒副作用，順鉑對小鼠的毒副作用較為明顯。

圖4 各組小鼠體質量變化趨勢Figure 4 Variation trend of body mass in mice

2.7 抑肺飲對Lewis肺癌移植瘤小鼠瘤體生長和肺轉移的影響各組小鼠瘤質量的測量結果顯示，與模型組相比，抑肺飲高劑量組、順鉑組和聯(lián)合用藥組的瘤質量均下降，且具有顯著性差異（P＜0.01）；抑肺飲低、中劑量組的瘤質量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。抑肺飲聯(lián)合順鉑組的抑瘤率明顯高于順鉑組及單用抑肺飲各組。具體結果見表7。表明抑肺飲對順鉑具有較好的增效作用。

模型組觀察到較多明顯的腫瘤轉移灶，出血明顯；抑肺飲用藥組和順鉑組觀察到零星轉移灶，肺泡結構不完整，其中抑肺飲高劑量組和順鉑組情況優(yōu)于抑肺飲中、低劑量組；抑肺飲聯(lián)合順鉑組未觀察到轉移灶，肺泡未見收縮，肺泡結構清晰。具體結果見表7、圖5。表明抑肺飲對肺癌移植瘤小鼠肺部組織的病理損傷具有緩解作用，能夠抑制肺轉移灶的形成，并在聯(lián)合順鉑使用時效果更佳。

圖5 各組小鼠肺組織病理表現(xiàn)比較（HE染色法，×100）Figure 5 Comparison of pathological manifestations of mouse lung tissue in various groups（by HE staining method，×100）

表7 各組Lewis肺癌移植瘤小鼠瘤質量、抑瘤率和轉移率比較Table 7 Comparison of tumor mass，tumor-inhibiting rate and metastasis rate in various groups of mice bearing Lewis lung cancer xenografts （±s）

表7 各組Lewis肺癌移植瘤小鼠瘤質量、抑瘤率和轉移率比較Table 7 Comparison of tumor mass，tumor-inhibiting rate and metastasis rate in various groups of mice bearing Lewis lung cancer xenografts （±s）

①P＜0.01，與模型組比較

組別模型組順鉑組順鉑+抑肺飲組抑肺飲低劑量組抑肺飲中劑量組抑肺飲高劑量組轉移率（%）77.8 55.6 0 66.7 57.1 50.0鼠數(shù)（只）999978平均瘤質量（g）2.64±0.74 1.80±0.64①1.65±0.68①2.61±0.71 2.06±0.37 1.80±0.53①抑瘤率（%）—31.79 37.58 1.25 21.81 31.71

2.8 抑肺飲對Lewis肺癌移植瘤小鼠瘤組織磷酸化NF-κB p65表達水平的影響上述研究結果顯示，高劑量的抑肺飲或是抑肺飲聯(lián)合順鉑使用對于小鼠肺癌生長和轉移的抑制效果要明顯優(yōu)于中、低劑量抑肺飲的使用效果?；诖?，我們進一步檢測模型組、順鉑組、抑肺飲高劑量組以及順鉑+抑肺飲組腫瘤組織中磷酸化NF-κBp65的表達水平，研究抑肺飲的體內(nèi)作用機制。免疫組織化學結果顯示，模型組p-NF-κB p65有大量表達在細胞核中，抑肺飲高劑量組其表達明顯被抑制，而在抑肺飲聯(lián)合順鉑組中p-NF-κB p65的表達進一步降低。具體結果見圖6。表明抑肺飲對肺癌細胞p-NF-κB p65的表達具有抑制作用，尤其是在聯(lián)合順鉑使用時效果明顯。

圖6 抑肺飲對腫瘤組織中p-NF-κB p65表達的影響（免疫組織化學法，×400）Figure 6 Effect of Yifei Yin on the expression of p-NF-κB p65 in tumor tissue（by immunohistochemistry，×400）

2.9 抑肺飲對Lewis肺癌移植瘤小鼠瘤組織Bcl-xL和CyclinD1 mRNA表達的影響為了進一步明確NF-κB信號通路在抑肺飲調(diào)控干預肺癌進展中的作用，本研究對模型組、順鉑組、抑肺飲高劑量組以及順鉑+抑肺飲組小鼠的腫瘤組織中NF-κB的靶基因Bcl-xL和CyclinD1的mRNA表達水平進行檢測，結果顯示，與模型組相比，抑肺飲高劑量組Bcl-xL和CyclinD1的mRNA表達水平顯著下降（P<0.01）。具體結果見表8。說明抑肺飲對移植瘤組織Bcl-xL和CyclinD1的表達具有一定抑制作用。此外，抑肺飲與順鉑聯(lián)合使用時Bcl-xL和CyclinD1的表達水平進一步降低。Bcl-xL和CyclinD1分別為凋亡抑制基因和細胞周期調(diào)控基因，其表達的下調(diào)表明抑肺飲可以通過抑制NF-κB信號通路的激活，抑制肺癌細胞周期進展，促進肺癌細胞凋亡，從而干預肺癌進展。

表8 抑肺飲對腫瘤組織Bcl-xL和CyclinD1 mRNA表達的影響Table 8 Effect of Yifei Yin on mRNA expression of Bcl-xL and CyclinD1 in tumor tissue （±s）

表8 抑肺飲對腫瘤組織Bcl-xL和CyclinD1 mRNA表達的影響Table 8 Effect of Yifei Yin on mRNA expression of Bcl-xL and CyclinD1 in tumor tissue （±s）

①P＜0.01，與模型組比較

組別模型組順鉑組順鉑+抑肺飲組抑肺飲高劑量組CyclinD1相對表達量（%）100.00 55.23±1.17①52.24±0.21①74.23±1.03①鼠數(shù)（只）3333 Bcl-xL相對表達量（%）100.00 71.32±6.88①42.31±2.02①79.35±4.42①

3 討論

肺癌屬于中醫(yī)學“肺積”的范疇。中醫(yī)認為，肺癌的發(fā)生、發(fā)展主要是由于正氣虛損、陰陽失衡、臟腑功能失調(diào)，致使氣滯血瘀、痰凝毒聚，蘊結為癌瘤，癌瘤的生長又會反過來耗損正氣，如此反復便成了癌。中藥抑肺飲是我院根據(jù)肺癌的病因病機，結合臨床經(jīng)驗，著眼于扶正、祛邪兩方面擬定的，由黃芪、黨參、麥冬、半夏、野蕎麥根、川芎、蜈蚣等組成，其中，黃芪、黨參補脾肺之氣，麥冬養(yǎng)陰生津，半夏、野蕎麥根豁痰解毒，川芎、蜈蚣祛瘀散結，全方攻補兼施，祛邪不傷正，補虛不留邪。

轉移是惡性腫瘤特有的生物學特性，有效控制腫瘤轉移是惡性腫瘤治療的關鍵因素。腫瘤的轉移是一個多因素參與、多步驟的復雜過程，其中EMT是腫瘤轉移起始步驟中最重要的機制[8]。通過EMT上皮細胞獲得成纖維細胞樣特性，細胞間粘附下降，細胞活動性增強，使腫瘤細胞具有向周圍組織或遠處器官侵襲及轉移的能力。該過程伴隨著E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等標志物的變化。已有報道，E-cadherin的缺失與腫瘤惡性程度密切相關，Vimentin的表達與肺腺癌的病理分級以及TNM分期呈正相關[9-10]。

EMT是一種細胞去分化程序，使腫瘤細胞具有可塑性和適應性，在多種癌癥的浸潤轉移中起關鍵作用[11]。處于侵犯前沿的腫瘤細胞被成纖維細胞、巨噬細胞、血細胞、中性細胞等所包圍，促炎癥細胞產(chǎn)生諸多促炎癥因子，誘導EMT和腫瘤轉移[12]。在聯(lián)系炎癥與EMT的大量分子信號通路中，NF-κB是參與炎癥誘導轉移的核心分子[13]。TNF-α在低濃度、長時間作用下可以促進腫瘤的發(fā)展，該效應主要通過激活NF-κB發(fā)揮作用。TNF-α可通過其受體將炎癥信號傳入細胞內(nèi)，經(jīng)過腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域（TRADD）、腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）等激活NF-κB抑制因子激酶（IKK），IKK再將NF-κB抑制蛋白（I-κB）磷酸化，使其被泛素化、降解，并釋放p65入核，從而激活NF-κB通路[14]。p65/RelA的磷酸化促進其與DNA中特定序列結合，觸發(fā)NF-κB調(diào)控基因的轉錄激活，包括VEGF、抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL、細胞周期調(diào)節(jié)基因CyclinD1等[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在TNF-α誘導的A549細胞EMT模型中，抑肺飲具有抑制A549細胞侵襲和遷移的作用。采用熒光定量PCR和Western Blot實驗分別對EMT標志物的mRNA和蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)抑肺飲作用后E-cadherin表達上調(diào)，Vimentin表達下調(diào)，這提示抑肺飲可能通過調(diào)控EMT抑制肺癌細胞侵襲和遷移。進一步通過Western Blot實驗和熒光素酶報告基因檢測實驗探討抑肺飲調(diào)控肺癌細胞EMT的機制，結果顯示，抑肺飲干預后NF-κB p65磷酸化水平和NF-κB啟動子活性被抑制，提示抑肺飲抗肺癌作用的機制可能是通過干預TNF-α-NF-κB信號通路調(diào)節(jié)了細胞EMT。體內(nèi)研究結果顯示，抑肺飲對小鼠Lewis肺癌移植瘤具有不同程度的抑制作用，其中，抑肺飲聯(lián)合順鉑組的抑瘤率最高，順鉑組、抑肺飲高劑量組次之。此外，抑肺飲具有抑制肺癌轉移的作用，尤其是在聯(lián)合順鉑時抑制轉移的效果最為顯著，并且能夠下調(diào)瘤組織中NF-κB p65的磷酸化水平以及靶基因Bcl-xL、CyclinD1的mRNA表達水平，表明抑肺飲在體內(nèi)可能通過干預NF-κB信號通路發(fā)揮抗肺癌作用。

綜上所述，抑肺飲具有抑制肺癌細胞生長和轉移的作用，其抑制可能與干預TNF-α-NF-κB信號通路從而調(diào)節(jié)EMT相關。