倪偉海 （寧波市鎮(zhèn)海中學(xué) 浙江寧波 315299）

在高中生物學(xué)教學(xué)中，“檢測(cè)生物組織中的糖類”是一個(gè)經(jīng)典且重要的實(shí)驗(yàn)。在2019 版人教版教材中，該實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)試劑為斐林試劑。在2019 版浙科版教材中則使用本尼迪特試劑（也稱為班氏試劑）。斐林試劑是由0.1 g/mL NaOH 和0.05 g/mL CuSO4配制而成。其中0.1 g/mL NaOH 溶液稱為斐林試劑甲液，0.05 g/mL CuSO4稱為斐林試劑乙液。本尼迪特試劑的配制方法為：將4.3 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解在50 mL 水中，加熱使之溶解，冷卻后加水至40 mL；另將43 g 檸檬酸鈉和25 g 無(wú)水碳酸鈉溶解于150 mL 水中，加熱使之溶解。冷卻后將上述2 份溶液混合，用水稀釋至250 mL，當(dāng)溶液不澄清時(shí)可過(guò)濾。本尼迪特試劑常被認(rèn)為是斐林試劑的改良試劑，避免了斐林試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用的缺點(diǎn)，可長(zhǎng)期保存。斐林試劑在儲(chǔ)存上具有缺點(diǎn)，而人教版仍選擇其作為檢測(cè)試劑是否存在其他原因？斐林試劑在其他方面，例如，檢測(cè)速度和靈敏度等是否具有優(yōu)勢(shì)？

1 研究背景

斐林試劑和本尼迪特試劑反應(yīng)原理具有一定共性：都是利用Cu（OH）2與還原性糖的醛基在加熱條件下反應(yīng)，生成磚紅色的Cu2O 沉淀以檢測(cè)還原性糖的存在。但二者產(chǎn)生Cu（OH）2的方式存在差別。斐林試劑的甲液與乙液直接反應(yīng)產(chǎn)生Cu（OH）2，Cu（OH）2再與還原性糖反應(yīng)產(chǎn)生磚紅色沉淀。而本尼迪特試劑中Cu（OH）2的產(chǎn)生過(guò)程是：檸檬酸鈉和碳酸鈉均是強(qiáng)堿弱酸鹽，在水中水解產(chǎn)生OH-，與CuSO4溶液混合時(shí)，生成的Cu（OH）2與還原性糖反應(yīng)生成磚紅色沉淀。從原理分析，斐林試劑甲液與乙液強(qiáng)烈反應(yīng)產(chǎn)生Cu（OH）2，Cu（OH）2很容易沉淀，濃度相對(duì)較高。因此，可推測(cè)其檢測(cè)還原性糖的靈敏度較高。而本尼迪特試劑利用檸檬酸鈉和碳酸鈉水解產(chǎn)生OH-，與CuSO4混合后產(chǎn)生的Cu（OH）2。因?yàn)樗猱a(chǎn)生的OH-數(shù)量較少，產(chǎn)生的Cu（OH）2濃度也相對(duì)較低。雖可長(zhǎng)期保存，但據(jù)此可推測(cè)本尼迪特試劑檢測(cè)還原性糖的靈敏度較低。

斐林試劑和本尼迪特試劑與葡萄糖反應(yīng)時(shí)，?？梢?jiàn)顏色從藍(lán)色到磚紅色的變化過(guò)程。當(dāng)反應(yīng)體系擴(kuò)大至400 mL 時(shí)，可清楚地觀察到整個(gè)顏色變化過(guò)程：藍(lán)色、藍(lán)綠色、綠色、淺綠色、黃綠色、黃色、橙黃色、橙色、橙紅色、磚紅色、棕黑色[1]。綠色是黃色和藍(lán)色等量混合，橙色是黃色和紅色等量混合，因而該反應(yīng)會(huì)發(fā)生這種顏色依次變化的過(guò)程。因此，可通過(guò)觀察不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的顏色變化檢測(cè)試劑靈敏度[2]。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 斐林試劑甲液：0.1 g/mL NaOH、斐林試劑乙液：0.05 g/mL CuSO4、本尼迪特試劑、不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（分別為0 g/L、1 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L、13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、電子天平、燒杯、試管、試管架、恒溫水浴鍋、一次性手套、移液器。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 取20 支試管，均分為2 組（斐林試劑組和本尼迪特試劑組），各組每支分別依次編號(hào)為1～10。依次向每支試管注入3 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（分別為0 g/L、1 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L、13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）。斐林試劑組每支試管分別注入3 mL 斐林試劑（甲液和乙液等量混合均勻后再注入），本尼迪特試劑組每支試管分別注入3 mL 本尼迪特試劑。將20 支試管置于盛有60℃的恒溫水浴鍋中加熱1 min、5 min 和20 min。觀察試管中出現(xiàn)的顏色變化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 斐林試劑與本尼迪特試劑中Cu（OH）2含量比較 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液分別加入斐林試劑和本尼迪特試劑時(shí)顏色如圖1。觀察圖1 發(fā)現(xiàn)，斐林試劑組的藍(lán)色顯著比本尼迪特試劑組的要深。仔細(xì)觀察，斐林試劑組內(nèi)存在藍(lán)色絮狀沉淀（圖2），本尼迪特試劑組均澄清。這表明斐林試劑產(chǎn)生的Cu（OH）2濃度相對(duì)較高，析出沉淀，而本尼迪特組的Cu（OH）2濃度相對(duì)較低。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液分別加入斐林試劑和本尼迪特試劑顏色變化

圖2 斐林試劑

3.2 斐林試劑與本尼迪特試劑對(duì)葡萄糖檢測(cè)速度比較 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液60 ℃熱水浴1 min 和5 min 時(shí)顏色變化見(jiàn)圖3 和圖4。從圖3 中可知，熱水浴加熱1 min 后，斐林試劑組的30 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液呈現(xiàn)黃綠色，25 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而本尼迪特試劑組均未發(fā)生明顯顏色變化。從圖4 中可知，熱水浴加熱5 min 后，本尼迪特試劑組30 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液上層呈現(xiàn)輕微黃綠色時(shí)，斐林試劑組的30 g/L、25 g/L、20 g/L、16 g/L、13 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液均出現(xiàn)了磚紅色沉淀。這表明斐林試劑與相同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生磚紅色沉淀的速度更快，現(xiàn)象更明顯。

圖3 熱水浴1 min 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液顏色變化

圖4 熱水浴5 min 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液顏色變化

3.3 斐林試劑和本尼迪特試劑對(duì)葡萄糖檢測(cè)靈敏度比較 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液60 ℃熱水浴1 min 和5 min 時(shí)顏色變化見(jiàn)圖3 和圖4。仔細(xì)觀察5 min后各支試管的顏色變化，發(fā)現(xiàn)從20 min 開(kāi)始，各支試管的顏色均不再發(fā)生可見(jiàn)的變化（圖5）。因此，可近似的認(rèn)為Cu（OH）2與葡萄糖的醛基反應(yīng)完全。分析圖5 可知，本尼迪特試劑組的13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L 組出現(xiàn)明顯的磚紅色沉淀，而斐林試劑組的5 g/L、8 g/L、10 g/L、13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L 組均出現(xiàn)明顯的磚紅色沉淀。分析可知，相較于本尼迪特試劑，斐林試劑可檢測(cè)含低濃度葡萄糖的溶液。

圖5 熱水浴20 min 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液顏色變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：斐林試劑檢測(cè)還原性糖時(shí)，其產(chǎn)生磚紅色沉淀的速度快于本尼迪特試劑，檢測(cè)還原性糖的靈敏度也高于本尼迪特試劑。就檢測(cè)還原性糖的效果，斐林試劑要好于本尼迪特試劑。這是因?yàn)殪沉衷噭┲械腃u（OH）2濃度相對(duì)本尼迪特試劑較高，因此，能更快更多地與還原必須現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)際生活中通常用于研究或針對(duì)個(gè)別病人的檢驗(yàn)。而本尼迪特試劑可長(zhǎng)期保存，在實(shí)際中通常用于生產(chǎn)和大多數(shù)病人的檢驗(yàn)。