張穎，嚴藝偉，鄧明新，黃金智，李寧，張慶余

524001廣東 湛江，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科(張穎、嚴藝偉、鄧明新、黃金智、張慶余)，血液研究室(李寧)

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于宮頸癌，致死率居婦科腫瘤首位[1]。尋找新的生物標(biāo)志物或治療靶點有助于診斷并治療卵巢癌患者，提高患者生存率。環(huán)狀RNA是新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，通過參與基因表達調(diào)控進而影響癌癥進展[2]，然而環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能,尤其是其在腫瘤中的作用及機理，目前仍不清楚。

環(huán)狀 RNA 是一類特殊的非編碼環(huán)狀RNA分子，與線性RNA相比環(huán)狀 RNA不易受 RNA 外切酶影響，表達更穩(wěn)定[3]。研究表明環(huán)狀 RNA的產(chǎn)生與pre-mRNA的選擇性剪接有關(guān)，pre-mRNA 的上游剪接受體與下游剪接供體通過外顯子跳讀和內(nèi)含子互補的方式縮小空間距離，以“反向剪接”的方式連接。環(huán)狀 RNA在多種腫瘤中異常表達，如肺癌過表達circ-0013958[4]、胃癌過表達circ-001569[5]、膀胱癌過表達 circ-0068871[6]和circ-BCRC4[7]、甲狀腺癌過表達 circ-NUP214[8]、卵巢癌過表達circ-001567[9]等。環(huán)狀 RNA 可以充當(dāng) miRNA 的海綿調(diào)控基因表達，參與調(diào)控NF-κB[10]、PI3K/AKT[11]、TGF-β[12]、JAK-STAT[13]等信號通路，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明卵巢癌中circ-61140 通過吸附miR-370從而抑制 miR-370負向調(diào)控其下游基因[14]；卵巢癌表達的circ-ITCH同樣可以通過海綿效應(yīng)抑制 miR-145參與卵巢癌進展[15]。因此，環(huán)狀 RNA與卵巢癌關(guān)系密切，有必要深入研究環(huán)狀RNA在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

本課題組前期采用RNA-seq篩選發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中和正常對照卵巢組織中差異表達環(huán)狀 RNA 分子，發(fā)現(xiàn)一個新環(huán)狀RNA hsa-circ-0006361在卵巢癌組相比于對照組表達明顯升高。為確證hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究利用小鼠移植瘤實驗觀察hsa-circ-0006361 對上皮性卵巢癌移植瘤生長的影響，揭示環(huán)狀RNA在卵巢癌中進展中的作用，為基于環(huán)狀RNA卵巢癌的診斷與治療提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究院申請獲得，由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室凍存。細胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液使用含有10%胎牛血清的MEN ALPHA 1×培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒 環(huán)狀RNA hsa-circ-0006361過表達質(zhì)粒、circ-vector298過表達質(zhì)粒對照購自于上海吉凱基因科技有限公司。

1.1.3 實驗動物 本實驗使用SPF級BALB/cJGpt-Foxn1nu/Gpt 4周齡雌性裸鼠，共26只，由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供。動物實驗方案已經(jīng)通過廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理審批，動物飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房內(nèi)，裸鼠飼料、水均經(jīng)高壓滅菌處理由動物自由取食。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR Trizol法提取RNA樣本后加入20～50 μL DEPC水溶解，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR方法檢測hsa-circ-0006361的表達水平。用2-ΔΔCt值相對定量方法進行數(shù)據(jù)分析，計算公式：對照組ΔCt=對照組目標(biāo)基因Ct-對照組內(nèi)參Ct；實驗組ΔCt=實驗組目標(biāo)基因Ct-實驗組內(nèi)參Ct；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。內(nèi)參GAPDH和hsa-circ-0006361引物序列分別為GAPDH F:5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,R:5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’；hsa-circ-0006361 F:5’-GATGATGTCTGGAAGCAGAGGA-3’,R:5’-GAAAAACCAGC TCTGACCATGTAA-3’。

1.2.2 亞細胞組分分離 使用細胞質(zhì)和細胞核RNA提取試劑盒2100購自武漢艾美捷科技有限公司，具體步驟如下：1)細胞組分的制備：吸出培養(yǎng)基磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌細胞一次，吸出PBS加入200 μL冰冷的Lysis Buffer，同時將細胞培養(yǎng)板置于冰上裂解細胞。收集裂解物15 000 rpm離心10分鐘將包含細胞質(zhì)RNA的上清液轉(zhuǎn)移至一個新離心管,保留含有細胞核RNA的沉淀。分別向細胞質(zhì)RNA，細胞核RNA加入200 μL Buffer SK。渦旋混合10 s，向混合物中加入200 μL 96%～100%乙醇渦旋混合10 s。將混合物加入結(jié)合柱上，6 000 rpm離心1分鐘。丟棄流通液。重新組裝結(jié)合柱及其收集管。將400 μL Wash Solution A加入結(jié)合柱并且離心1分鐘，丟棄流通液。重復(fù)上一個步驟兩次后離心2 min，徹底干燥樹脂。將離心柱放入試劑盒中提供的新的1.7 mL的洗脫管中加50 μL Elution Buffer E到離心柱中，2 000 rpm離心2分鐘后以14 000 rpm離心1 min，得到RNA洗脫液。RNA反轉(zhuǎn)錄后進行定量PCR,以GAPDH作為細胞質(zhì)內(nèi)參，以U6 RNA作為細胞核內(nèi)參，用2-ΔΔCt相對定量方法進行數(shù)據(jù)分析目的基因細胞質(zhì)與細胞核中的相對豐度。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立與鑒定 在預(yù)鋪SKOV3細胞的24孔板中，每孔分別轉(zhuǎn)染750 ng hsa-circ-0006361或circ-vector298。轉(zhuǎn)染24小時后G418(800 μg/mL)篩選2周，通過熒光顯微鏡觀察熒光的方法來判斷轉(zhuǎn)染及篩選效果。用0.25%胰酶消化細胞制備細胞懸液，進行細胞計數(shù)，并配成10個細胞/mL的細胞懸液。用上述懸液，以每孔100 μL鋪板至96孔板。熒光顯微鏡觀察熒光判斷該單克隆細胞質(zhì)粒表達情況。

1.2.4 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗 將SKOV3/hsa-circ-0006361穩(wěn)定表達細胞株與SKOV3/circ-vector298對照細胞株分別接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，共使用26只裸鼠，其中13只為hsa-circ-0006361實驗組，另外13只為circ-vector298對照組，作為無靶點環(huán)狀RNA表達載體對照觀察移植瘤生長情況。每日觀察裸鼠的瘤體大小，以及活動、精神狀況、攝食量及睡眠狀況等情況。待皮下腫瘤長出，每3日測量腫瘤大小，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑a、最短徑b和高c，按照公式V(mm3)=πabc/6計算瘤體積，并繪制生長曲線。種植后的第30天，處死裸鼠分離移植瘤并測量移植瘤的體積(mm3)與質(zhì)量(g)，計算促瘤率(%)=(基因過表達組平均瘤重-空白對照組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重×100%；計算腫瘤體積促進率(%)=基因過表達組平均瘤體體積-空白對照組平均瘤體體積)/空白對照組平均瘤體體積×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Hsa-circ-0006361是主要定位于胞漿的環(huán)狀RNA

為確定hsa-circ-0006361的亞細胞定位，首先在上皮性卵巢癌SKOV3細胞株瞬轉(zhuǎn)hsa-circ-0006361后，RT-qPCR檢測該環(huán)狀RNA的表達量，結(jié)果表明hsa-circ-0006361組表達量明顯高于對照組(圖1A，P<0.01),說明目的片段成功表達。分離上皮性卵巢癌SKOV3細胞中的胞核和胞漿RNA，進行RT-qPCR分析，結(jié)果顯示73.48%的GAPDH位于細胞質(zhì)，62.39%的U6位于細胞核，符合RNA分離要求。而hsa-circ-0006361在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，32.90%的hsa-circ-0006361位于細胞核，67.10%的hsa-circ-0006361位于細胞質(zhì)接近GAPDH的分布，提示hsa-circ-0006361主要位于細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中發(fā)揮功能，可能參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程(圖1B)。為驗證hsa-circ-0006361是否為環(huán)狀RNA，提取hsa-circ-0006361組RNA后，取RNA設(shè)置兩組，一組用RNase-R處理，一組不用RNase-R處理，以GAPDH及hsa-circ-0006361親本基因March7為參照，各組PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1C)。結(jié)果表明只有經(jīng)過RNase-R處理的樣本hsa-circ-0006361條帶依然存在，說明hsa-circ-0006361是環(huán)狀RNA。

2.2 篩選hsa-circ-0006361 SKOV3穩(wěn)定表達細胞株

為構(gòu)建穩(wěn)定表達hsa-circ-0006361的卵巢癌細胞株，用SKOV3細胞分別轉(zhuǎn)染circ-vector298與hsa-circ-0006361，轉(zhuǎn)染成功后G418篩選獲得單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞(圖2A)。RT-qPCR實驗檢測單克隆D1號(SKOV3/hsa-circ-0006361細胞株)、單克隆H1號(SKOV3/circ-vector298對照細胞株)hsa-circ-0006361表達情況結(jié)果，結(jié)果提示單克隆群D1號比單克隆群H1號hsa-circ-0006361表達高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。表明成功構(gòu)建hsa-circ-0006361穩(wěn)定表達細胞株及對照細胞株。

2.3 Hsa-circ-0006361促進卵巢癌在裸鼠體內(nèi)發(fā)展

為建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，將單克隆群D1號與單克隆群H1號細胞分別接種于裸鼠皮下。注射后第12天時所有裸鼠皮下長出腫瘤，肉眼可見，成瘤率100%，裸鼠活動、精神狀況、攝食量及睡眠狀況等情況無明顯變化，但是體質(zhì)量開始下降。隨著移植瘤的增大，注射后第21天時，部分裸鼠因瘤體過大而活動受限，明顯消瘦，精神狀況、攝食量及睡眠狀況等情況變差，體質(zhì)量逐漸減輕，以hsa-circ-0006361組裸鼠尤為明顯。hsa-circ-0006361組裸鼠體質(zhì)量在第9天起與circ-vector298組裸鼠相比均明顯減輕(P<0.05，其中第12、15 d的P<0.01)；hsa-circ-0006361組裸鼠移植瘤在12、15、18、21、24、27、30 d腫瘤體積與circ-vector298組裸鼠相比均明顯增加(P<0.05)。第30天測量裸鼠體重，處死裸鼠分離腫瘤結(jié)節(jié)并測量移植瘤的體積與質(zhì)量，計算促瘤率(%)和腫瘤體積促進率(表1、圖3)。

圖1 Hsa-circ-0006361是主要定位于胞漿的環(huán)狀RNA

圖2 篩選單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKOV3/Hsa-circ-0006361細胞株

表1 裸鼠各項腫瘤相關(guān)指標(biāo)的比較

圖3 Hsa-circ-0006361促進卵巢癌在裸鼠體內(nèi)發(fā)展

2.4 Hsa-circ-0006361縮短荷瘤裸鼠生存時間

為觀察Hsa-circ-0006361對荷瘤裸鼠生存時間的影響，將兩組細胞分別接種于裸鼠腹腔，在第12天兩組裸鼠腹腔內(nèi)有均出現(xiàn)腹水。Hsa-circ-0006361組裸鼠在第14天開始腹腔體積增長比circ-Vector298組裸鼠明顯，活躍度低于circ-vector 298組裸鼠，生存時間明顯短于circ-vector298組裸鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。裸鼠死后解剖觀察腹腔情況，發(fā)現(xiàn)兩組裸鼠均出現(xiàn)腫瘤腹腔內(nèi)種植并有大量腹水形成。

圖4 荷瘤裸鼠生存曲線

3 討 論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，早期診斷困難、預(yù)后較差嚴重威脅女性的生命健康[16]。環(huán)狀RNA廣泛存在，由于其內(nèi)富含miRNA結(jié)合位點，通過內(nèi)源性競爭結(jié)合miRNA，調(diào)控mRNA剪切或轉(zhuǎn)錄及親本基因的表達，影響其生物學(xué)特征。環(huán)狀RNA與miRNA相互作用在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。環(huán)狀RNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，差異表達環(huán)狀RNA通過調(diào)控癌基因和抑癌基因的翻譯從而參與多種腫瘤發(fā)生過程，并且與腫瘤的分類、化療耐藥及預(yù)后相關(guān)[17]。

通過非編碼RNA測序?qū)Ρ嚷殉舶┙M織與正常卵巢組織中環(huán)狀RNA發(fā)現(xiàn)hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌組織中高表達。RNA測序通量高但往往不能保證準(zhǔn)確性，為確證測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，首先應(yīng)實驗證實hsa-circ-0006361是環(huán)狀RNA并且在卵巢癌細胞中表達。用RNase-R處理細胞線性RNA并對剩余的RNA進行反轉(zhuǎn)錄PCR分析，結(jié)果表明盡管用RNase-R處理之后針對hsa-circ-0006361引物仍然能擴增出目的片段，表明hsa-circ-0006361是對RNase-R不敏感的環(huán)狀RNA。環(huán)狀RNA與線性RNA相比存在環(huán)化過程，因此載體選擇有別，證明hsa-circ-0006361是環(huán)狀RNA是選擇載體類型過表達hsa-circ-0006361的依據(jù)，此外環(huán)狀RNA是比普通線性RNA更穩(wěn)定的分子，且在組織、細胞、體液中廣泛存在，因此環(huán)狀RNA作為疾病診斷與預(yù)后標(biāo)志物具有先天優(yōu)勢[18-19]。近來研究表明環(huán)狀RNA普遍參與基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，不同細胞區(qū)域分布的環(huán)狀RNA發(fā)揮功能不盡相同，比如分布于細胞核的環(huán)狀RNA可以編碼蛋白也可能參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而細胞質(zhì)分布的環(huán)狀RNA往往作為miRNA的海綿起到吸附miRNA調(diào)控其靶基因的作用[20-21]。實驗發(fā)現(xiàn)hsa-circ-0006361主要分布在細胞質(zhì)，提示該環(huán)狀RNA可能是在胞質(zhì)通過調(diào)控mRNA穩(wěn)定性及蛋白表達而發(fā)揮作用，后續(xù)實驗可以重點探討其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的具體對象與分子機制。小鼠移植瘤實驗表明它可以促進裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤的生長，并縮短裸鼠的生存時間。提示hsa-circ-0006361促卵巢癌進展影響卵巢癌的結(jié)局，可能是調(diào)控卵巢癌進展的重要環(huán)狀RNA之一，闡明其作用機理對于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后判斷具有重要意義。后續(xù)實驗，我們將對hsa-circ-0006361的作用靶點進行研究，并在分子、細胞、卵巢癌組織和動物水平研究hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制。一方面探究hsa-circ-0006361的海綿吸附作用，特別與一些重要的癌癥相關(guān)miRNA例如miR-214、let-7a、miR-30c、miR-150、miR-509、miR-510等microRNA與hsa-circ-0006361的聯(lián)系，以及這些microRNA的下游作用靶點，例如探究hsa-circ-0006361-miR-214-PTEN軸的關(guān)系。Hsa-circ-0006361位于2號染色體，來自親本基因膜相關(guān)環(huán)指蛋白7(membrane-associated ring-CH-type finger 7，MARCH7)的第3、4個外顯子區(qū)。MARCH7屬于膜結(jié)合E3泛素化連接酶，參與膜轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)降解，調(diào)節(jié)T細胞增殖和神經(jīng)元發(fā)育。MARCH7也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，尤其是婦科腫瘤，如卵巢癌[22]、子宮內(nèi)膜癌[23]及宮頸癌[24]。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)MARCH7在上皮性卵巢癌組織中高表達且與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，并證明MARCH7表達能夠增強SKOV3卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力。因此可以進一步研究hsa-circ-0006361與親本基因MARCH7的表達量的之間的關(guān)系及參與其中的miRNA。通過上述研究闡明hsa-circ-0006361促進上皮性卵巢癌的作用機制，將為理解上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展提供新的角度。

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