張云霞 楊曉俊 姚曉麓 陳發(fā)文, 彭迎霞 謝?；?/p>

1 福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院 福建省立醫(yī)院輸血科，福建省福州市 350001；2 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院輸血科； 3 福建省立金山醫(yī)院檢驗科

正確鑒定ABO血型對臨床輸血至關重要。ABO亞型是引起ABO血型鑒定正反定不符或凝集強度減弱的常見原因之一。ABO亞型個體血型極易誤判，且需要制定特殊的安全輸血策略。我們在工作中發(fā)現(xiàn)了2例正反定不符的樣本，血清學鑒定結果符合Ael亞型特征，進一步通過ABO基因檢測證實為Ael04亞型，現(xiàn)將實驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 先證者1:女，28歲，漢族，福建泉州，孕婦，無輸血史，福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院東海院區(qū)送檢；先證者2:女，47歲，漢族，福建寧德，宮頸癌患者，無輸血史。兩人術前備血時，血型鑒定困難。在遵循知情同意原則下，采集先證者及其家系成員血液及唾液標本進行進一步檢測。

1.2 試劑和儀器 單克隆抗-A、抗-B、抗-H、抗-A1植物凝集素、A1/B/O標準紅細胞(上海血液生物)、A2紅細胞(美國Immucor)、單克隆抗-AB(法國Diagast)、血型鑒定卡(西班牙戴安娜)、人源抗-A由本實驗室自制(A型新生兒溶血病患兒母親血清，含高效價IgG抗-A,不含冷凝集素和不規(guī)則抗體)，DNA提取試劑盒(北京天根)，BASO 2005-2型醫(yī)用低速離心機(珠海貝索)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 試驗操作 血型正反定型 、吸收放散試驗、唾液血型物質(zhì)測定均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》和相應試劑使用說明書進行[1]。

1.4 α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GTA)活性的測定[2](1)隨機挑選3人份O型獻血者紅細胞混合，取生理鹽水3洗后的壓積紅細胞40μl，加入400μl反應液中[pH=6.5的0.05mol/L 咪唑緩沖液、質(zhì)量濃度0.5%的牛血清白蛋白、0.025mol/L MnCl2、0.15mol/L NaCl、0.5mmol/L UDP-GalNAc 各40μl；待檢血漿200μl]；在37℃恒溫循環(huán)解凍箱中擺動水浴4h后，再用生理鹽水洗滌3次，制得5%濃度的指示紅細胞懸液待用。(2)將單克隆抗-A和抗-B進行倍比稀釋(1∶1～1∶256)后待用。(3)取50μl 5%濃度的指示紅細胞懸液，與50μl不同稀釋度的抗-A、抗-B混合后，置室溫中反應20min，110g 離心30s，通過肉眼和顯微鏡觀察凝集強度。血漿酶活性強度以發(fā)生凝集的抗體最高滴度來表示，并分別選取3人份A型(O型)獻血者的混合血漿作為陽性(陰性)對照。

1.5 ABO基因直接測序 嚴格按照試劑說明書提取血液基因組DNA，使用天津秀鵬提供的特異性引物對ABO基因第1～7外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后，由天津秀鵬進行雙向測序，采用Chromas軟件對測序結果進行分析，確定基因突變位點。

2 結果

2.1 血清學檢測結果 先證者1、先證者2及其兄長紅細胞與抗-A、抗-B、抗-A,B、抗-A1均無凝集，與抗-H強凝集(3+～4+)，正定型為O型；3人血清與A1細胞呈弱凝集(±～1+)，與B細胞呈強凝集(2+S～4+)，A、B細胞凝集強度差2+以上，同時與A2細胞無凝集，說明血清中存在抗-A1,而非抗-A。吸收放散試驗可檢出紅細胞表面弱A抗原的存在，唾液中僅檢出H物質(zhì)。推測3人均為A亞，疑似Ael表型。先證者1父親紅細胞與抗-A、抗-A1均無凝集，與抗-B均呈4+強度的凝集，正定型為B型；血清與A1c反應呈弱凝集(±～1+)，與A2細胞無凝集，說明血清中存在抗-A1。唾液中僅檢出H物質(zhì)。推測先證者1父親為A亞型B，疑似AelB表型。見表1。

表1 2名先證者的血清學檢測結果

2.2 A糖基轉(zhuǎn)移酶活性檢測結果 先證者1及其父、先證者2及其兄長和陰性對照均未檢出A酶活性，陽性對照結果為1∶64。

2.3 ABO基因直接測序結果 直接測序分析結果顯示，先證者1和2 存在261delG 、內(nèi)含子6+5G>A、467C>T的雜合突變，以A101為參考序列，其中261delG為O01等位基因的特征性突變，467C>T 為A102等位基因的特征性突變，內(nèi)含子6+5G>A為Ael04等位基因的特征性突變,綜合分析，先證者1和2的A基因在A102等位基因的基礎上發(fā)生了內(nèi)含子6+5G>A的突變，根據(jù)紅細胞血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫，將其基因型定為Ael04/O01。先證者1父親存在297A>G、526C>G、657C>G、703G>A、796C>A、803G>C和930G>A的雜合突變，此為B101等位基因的特征性突變。此外還存在467C>T 和內(nèi)含子6+5G>A的雜合突變，先證者1父親的A基因在A102等位基因的基礎上發(fā)生了內(nèi)含子6+5G>A的突變，基因型為Ael04/B101。見圖1。

圖1 ABO基因直接測序結果

3 討論

ABO血型亞型由ABO基因變異形成，其抗原分子結構與ABO血型抗原存在一定差異。A抗原是由A基因編碼產(chǎn)生的N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移到H物質(zhì)的巖藻糖花半乳糖殘基而形成。 A亞型是在等位基因上發(fā)生核苷酸序列改變，進而引起糖基轉(zhuǎn)移酶活性發(fā)生變化，從而導致紅細胞表面表達的A抗原質(zhì)量或數(shù)量發(fā)生改變，最終引起血型血清學正反定型不符。

Ael亞型是種較為罕見的 ABO 亞型，Ael 血型亞型在我國人群表達概率約為1/8萬[3]。Ael亞型的血清學特征是紅細胞與抗-A、抗-A,B無凝集，血清中常存在不規(guī)則抗-A1，但通常效價不高。分泌型者唾液中未檢出A物質(zhì)，體外試驗血漿中無法檢出A酶活性，僅可通過吸收放散試驗證實紅細胞表面A抗原的存在。Ael/O基因型個體正定型類O，反定型A1細胞弱凝集，B細胞強凝集，凝集差多在2+以上，很可能被誤判為O型。Ael/B基因型個體,正定型表現(xiàn)為B型，反定型B細胞無凝集，A1細胞弱凝集。Ael/B基因型個體血清學上與B1型個體抗-A減弱較難區(qū)分。其中B1型抗-A減弱個體，球蛋白多偏低，反定型與新鮮的A2細胞凝集。

ABO亞型的形成主要與ABO基因外顯子的突變密切相關，此外還與ABO基因內(nèi)含子、啟動子等區(qū)域的突變有關[4]。目前已知的ABO亞型中涉及內(nèi)含子突變的主要有Aw15(IVS6+4A>T)、Aw28(IVS1+2T>C)、Aw44(IVS6+4A>G)、Aw45(IVS4+1delG)、Ael04(IVS6+5G>A)、A308(IVS2+3A>G)、B303(IVS3+5G>A)、Bel08(IVS1+5G>C)。Ael04亞型第6內(nèi)含子的第5個堿基由鳥苷酸替換為腺苷酸。臺灣學者Chen 等[5]通過RT-PCR分析證實IVS6+5G>A 突變導致Ael04亞型存在至少10種異常的剪接轉(zhuǎn)錄本。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本導致了早期終止，并在翻譯過程中產(chǎn)生非功能蛋白。其中沒有外顯子5-6的轉(zhuǎn)錄本被預測可以產(chǎn)生n端缺失57個氨基酸的功能性Ael糖基轉(zhuǎn)移酶,導致紅細胞表面A抗原的弱表達。本研究通過3種不同的在線剪接位點預測工具亦得出ABO基因內(nèi)含子6+5G>A突變會對供者剪接位點造成影響。

像本研究中的Ael/O和Ael/B基因型個體，血型極易誤判為O型和B型，輸血時需制定特殊的輸血策略。當他們作為供者，將其紅細胞輸注給O型和B型受血者，由于受血者血漿中存在大量的抗-A，會與Ael亞型供者紅細胞表面的弱A抗原結合，有可能發(fā)生較嚴重的溶血反應[6]，如若作為獻血員，可以將Ael 血型定型為A型，絕不能定型為O型；Ael/B獻血員可以定型為AB型。Ael/O和Ael/B基因型個體作為受血者時，若輸注了O型和B型懸浮紅細胞，懸浮紅細胞中僅含少量的血漿(少量抗-A)，不會對患者健康造成嚴重影響。但為安全起見，緊急情況下推薦輸注O型和B型洗滌紅細胞[7]。輸血漿時，若輸注大量O型和B型血漿(如血漿置換時)，仍有發(fā)生較嚴重溶血反應的風險，故應輸注A型和AB型血漿和血小板類制品[8-9]。

隨著分子生物學的發(fā)展，在遇到ABO亞型時可通過基因檢測手段協(xié)助鑒定血型，為安全輸血提供保障。