雷 益，李紹軍，胥錢平，馮 成，杜麗英

胃癌是常見惡性腫瘤，為與腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因，2018年估計有783 000例胃癌患者死亡[1]?；?、放療和胃切除術(shù)是治療胃癌的主要方法，盡管近年這些治療方法的實施取得了長足進步，但胃癌晚期患者總體5年生存率仍不到30%[2]。目前，晚期轉(zhuǎn)移和化療耐藥仍是胃癌患者治療的主要障礙[3]。因此，胃癌分子機制研究是探討胃癌新治療策略的重要途徑。miRNA是非編碼RNA之一，雖然不具備編碼功能，但是其在腫瘤等疾病中的作用逐漸被挖掘[4]。miR-100-5p是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一，可發(fā)揮抑癌作用和促癌作用。有研究顯示，miR-100-5p在前列腺癌、肝細胞肝癌和非小細胞肺癌等腫瘤中表達異常，不僅與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，還可調(diào)控腫瘤細胞耐藥[5-7]。Chen等[8]報道m(xù)iR-100-5p通過抑制mTOR信號通路參與長鏈非編碼RNA HAGLROS促進胃癌惡性進展，但是miR-100-5p在胃癌中的表達及發(fā)揮的具體生物學功能現(xiàn)仍未知。因此，本研究探討miR-100-5p對胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的作用及機制，旨在獲得miR-100-5p抗胃癌治療的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月—2019年6月于四川大學華西醫(yī)院眉山醫(yī)院行根治性手術(shù)的胃癌患者標本，收集經(jīng)病理檢查證實的胃癌組織和癌旁組織(距離腫瘤5 cm的非胃癌組織)，患者術(shù)前未接受過任何形式治療并簽署相關(guān)知情同意書，共納入70例。70例中男37例，女33例；年齡≤60歲28例，>60歲42例；腫瘤直徑：<5 cm 50例，≥5 cm 20例；分化程度：高分化12例，中分化15例，低分化43例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有39例，無31例；Duke分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期20例，Ⅲ期24例，Ⅳ期8例?；颊咝g(shù)后進行以鉑類為主的一線化療，化療方案為奧沙利鉑第1天和第7天100 mg/m2靜脈滴注2 h，7 d為1個療程，共化療5個療程。隨訪追蹤患者治療后效果，主要包括復發(fā)和疾病進展，70例中化療有效37例，無效33例。

1.2試劑和材料 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，miR-100-5p和內(nèi)參U6引物由上海生工試劑公司合成，胰蛋白酶、細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司，胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1購自中國科學院細胞庫，miR-100-5p mimic購自廣州瑞博生物試劑有限公司，MTS試劑和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，RIPA裂解液購自上海貝博生物科技公司，PVDF膜購自美國Bio-Rad，ERK1/2、pERK1/2和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司。

1.3qRT-PCR 在胃癌組織和癌旁組織中加入Trizol裂解液于研缽中研磨裂解，采用RNA提取試劑盒提取組織中總的RNA。采用UltraRT One-step RT-PCR試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，其體系為10X One Step RT-PCR Buffer 1 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 0.2 μg、RNase mimic 0.1 μl、AMV RT 0.1 μl、Taq DNA polymerase和無RNA酶的雙蒸水補足10 μl。反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄45 ℃20 min、94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 30個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。miR-100-5p引物F：5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3'，R：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6引物F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照2-ΔΔCt公式以U6為內(nèi)參計算miR-100-5p的相對表達量。

1.4細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染 采用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1，并放置在37 ℃含有5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。采用胰酶消化進行細胞傳代。細胞長滿時收集細胞，提取細胞總RNA。采用qRT-PCR檢測各細胞中miR-100-5p的表達。選取miR-100-5p表達最低的細胞系進行細胞接種，以每孔2×105個細胞接種至6孔板中，分為NC組和miR-100-5p mimic組，細胞貼壁12 h后進行細胞轉(zhuǎn)染，NC組轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體2000與對照mimic混合液，miR-100-5p mimic組轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體2000與miR-100-5p mimic混合液，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后采用qRT-PCR檢測細胞中miR-100-5p的表達。

1.5MTS實驗檢測細胞增殖能力 NC組和miR-100-5p mimic組細胞以每孔2000個接種至96孔板中，每組設(shè)置6個重復孔，分別在貼壁0、24、48和72 h時，每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用全波長掃描儀檢測細胞在490 nm處的OD值。

NC組和miR-100-5p mimic組細胞以每孔2000個接種至96孔板中，每組設(shè)置6個重復孔，細胞貼壁后分別加入不同劑量的奧沙利鉑(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)處理細胞48 h。每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用全波長掃描儀檢測細胞在490 nm處的OD值。細胞增殖率=miR-100-5p mimic組平均OD值/NC組平均OD值×100%。

1.6Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力 NC組和miR-100-5p mimic組細胞胰酶消化后，無血清培養(yǎng)基洗3次，以每孔1×105個接種至24孔板Transwell小室膜中，24孔板Transwell下室中加入含有500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個重復孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，細胞可穿過Transwell小室膜貼在膜下室面，終止細胞培養(yǎng)。膜下室面細胞經(jīng)PBS洗3次、甲醇固定及吉姆薩染色后在顯微鏡下計數(shù)細胞穿膜數(shù)目。

1.7流式細胞凋亡實驗檢測細胞凋亡率 NC組和miR-100-5p mimic組細胞經(jīng)無EDTA的胰酶消化后，PBS洗3次，以每管5×105個收集到流式細胞管中，按照凋亡染色試劑盒說明書，加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI細胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

NC組和miR-100-5p mimic組細胞經(jīng)奧沙利鉑不同濃度處理48 h后，經(jīng)無EDTA的胰酶消化后，PBS洗3次，以每管5×105個收集到流式細胞管中，按照凋亡染色試劑盒說明書，加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI細胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

1.8Western blotting檢測ERK1/2和pERK1/2蛋白表達 NC組和miR-100-5p mimic組細胞收集后加入RIPA裂解液，于冰上裂解細胞30 min，14 000 r/min 4 ℃離心30 min后，獲得細胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸變性。蛋白80 V凝膠電泳2 h、350 mA濕轉(zhuǎn)2 h、5%封閉液室溫封閉1 h，與ERK1/2和pERK1/2一抗(稀釋度均為1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學發(fā)光試劑盒進行蛋白條帶曝光。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-100-5p在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為1.05±0.36和1.69±0.72，miR-100-5p的相對表達量胃癌組織低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p相對表達量

2.2miR-100-5p表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 miR-100-5p表達與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑和分化程度無關(guān)(P>0.05)；與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和化療效果相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 miR-100-5p表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系

2.3胃癌細胞系及人正常胃黏膜上皮細胞系中miR-100-5p表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-100-5p在胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1中的相對表達量分別為1.31±0.14、1.34±0.15、0.39±0.07和2.94±0.29。miR-100-5p相對表達量胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；miR-100-5p相對表達量胃癌細胞系GES-1、MKN1和MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測胃癌細胞系及人正常胃黏膜上皮細胞系中miR-100-5p相對表達量

2.4miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染效果 miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN45，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，NC組和miR-100-5p mimic組細胞中miR-100-5p相對表達量分別為1.00±0.06和5.42±0.27。細胞中miR-100-5p相對表達量miR-100-5p mimic組高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 qRT-PCR檢測miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染效果

2.5miR-100-5p對MKN45細胞增殖能力影響 MTS實驗檢測結(jié)果顯示，MKN45細胞增殖能力miR-100-5p mimic組低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 MTS實驗檢測miR-100-5p對MKN45細胞增殖能力影響

2.6miR-100-5p對MKN45細胞轉(zhuǎn)移能力影響 Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，MKN45細胞穿膜細胞數(shù)NC組和miR-100-5p mimic組分別為(49.33±7.35)個和(21.67±5.84)個，MKN45細胞穿膜細胞數(shù)miR-100-5p mimic組少于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測miR-100-5p對MKN45細胞轉(zhuǎn)移能力影響(吉姆薩染色×100)

2.7miR-100-5p對MKN45細胞奧沙利鉑化療敏感性影響 NC組和miR-100-5p mimic組MKN45細胞經(jīng)不同濃度奧沙利鉑處理，培養(yǎng)48 h后MTS實驗檢測結(jié)果顯示在同一奧沙利鉑濃度處理下，細胞增殖率miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞凋亡實驗檢測結(jié)果顯示，NC組細胞凋亡率為(2.14±0.15)%，miR-100-5p mimic組細胞凋亡率為(7.06±0.27)%。MKN45細胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 miR-100-5p對MKN45細胞奧沙利鉑化療敏感性影響

2.8miR-100-5p對MKN45細胞ERK1/2信號通路影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，NC組和miR-100-5p mimic組細胞中ERK1/2蛋白比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；細胞中pERK1/2蛋白表達miR-100-5p mimic組低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-100-5p對MKN45細胞ERK1/2信號通路影響

3 討論

胃癌是一種侵襲性疾病，性質(zhì)具有多樣性[1]。在過去的幾十年中，胃癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率有所下降，但在我國人群中卻在上升，我國胃癌的發(fā)病率和病死率位居所有腫瘤第2位[9]。因此，尋求胃癌有效治療方法至關(guān)重要。手術(shù)切除是早期無遠處轉(zhuǎn)移或局部區(qū)域轉(zhuǎn)移胃癌患者最有效治療方法。然而，對于晚期胃癌患者，即使完全切除腫瘤并進行輔助化療，但由于轉(zhuǎn)移和化療耐藥導致預后也很差[2]。目前,幽門螺桿菌感染、高鹽攝入和吸煙被認為是胃癌發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素[10]，但是胃癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)分子機制現(xiàn)尚未完全明確。因此，闡明胃癌轉(zhuǎn)移和化療耐藥等腫瘤惡性進展的分子機制非常迫切。

miRNA是一類長度為17～25 nt的非編碼RNA，可通過靶基因與3' -UTR互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA，參與各種生理和病理過程。高度保守的miRNA在調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等腫瘤進程中發(fā)揮重要作用[4]。越來越多的研究表明，miRNA失調(diào)在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義[11]。miR-100-5p是miRNA家族的重要成員，位于11q24.1號染色體上，具有高度保守性。有研究報道m(xù)iR-100-5p高表達是口腔鱗狀細胞癌預后不良的分子標志物[12]。在腎細胞癌中miR-100-5p表達上調(diào)，并促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細胞的凋亡[13]。然而，有學者報道m(xù)iR-100-5p在肝細胞癌中表達下調(diào)與患者預后較差有關(guān)[6]。上述研究表明miR-100-5p具有腫瘤異質(zhì)性，在不同腫瘤中具有不同功能。miR-100-5p在胃癌中的表達情況以往文獻未見報道，本文采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-100-5p相對表達量胃癌組織低于癌旁組織，胃癌細胞系GES-1、MKN1、MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1；并且miR-100-5p表達與胃癌細胞患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和化療效果相關(guān)。提示miR-100-5p表達與胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，MKN45細胞增殖能力及MKN45細胞穿膜細胞數(shù)miR-100-5p mimic組低于或少于NC組，差異有統(tǒng)計學意義。表明miR-100-5p在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。

化療抵抗是腫瘤治療受阻的重要原因之一[3]。有研究報道m(xù)iR-100-5p在腫瘤細胞化療耐藥過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-100-5p在非小細胞肺癌中促進腫瘤耐藥細胞對克唑替尼和洛拉替尼耐藥，為耐藥性的治療靶標[14]。然而，另一項研究表明，miR-100-5p可促進肺癌細胞對順鉑的敏感性[7]。奧沙利鉑是鉑類化合物中的一種，比順鉑具有更顯著的抗腫瘤作用，被廣泛應(yīng)用于胃腸道腫瘤的治療，但對其耐藥性極大影響了患者預后[15]。本文對miR-100-5p是否在胃癌細胞對奧沙利鉑耐藥過程發(fā)揮重要作用進行了研究，結(jié)果顯示MKN45細胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加，差異有統(tǒng)計學意義。說明過表達miR-100-5p的胃癌細胞對奧沙利鉑的敏感性增加。本研究發(fā)現(xiàn)miR-100-5p抑制胃癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥，但是其具體作用機制仍需進一步探討。ERK1/2信號通路對包括胃癌在內(nèi)的腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥生物過程具有重要調(diào)控作用，pERK1/2促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥[16]。本研究Western blotting檢測結(jié)果顯示，NC組和miR-100-5p mimic組細胞中ERK1/2蛋白比較差異無統(tǒng)計學意義；細胞中pERK1/2蛋白表達miR-100-5p mimic組低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義。表明miR-100-5p可能通過下調(diào)ERK1/2信號通路抑制胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧沙利鉑耐藥。

綜上所述，miR-100-5p在胃癌細胞中低表達，并與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及化療效果相關(guān)。miR-100-5p可能通過調(diào)控ERK1/2信號通路抑制胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧沙利鉑化療耐藥，是治療胃癌的潛在靶標。