王 巍， 張 強(qiáng)， 杜春潔， 鞠成國(guó)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性腸道炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為黏液膿血便、腹瀉、腹痛及里急后重等，與中醫(yī)“腸澼”相對(duì)應(yīng)。其病因至今尚不完全清楚，目前認(rèn)為主要與飲食和生活方式不規(guī)律以致腸道菌群失調(diào)、黏液和上皮屏障功能缺陷有關(guān)[1]?，F(xiàn)代臨床治療多以水楊酸類(lèi)、糖皮質(zhì)激素以及免疫抑制劑等藥物聯(lián)用，但存在療效不穩(wěn)定、肝腎毒性、藥物依賴(lài)性等問(wèn)題[2]，因此尋找安全有效的中醫(yī)藥療法成為當(dāng)務(wù)之急。中醫(yī)理論認(rèn)為本病病位在大腸，病在血分，氣血凝滯，病久及肺[3]，因此目前從肺腸合治法論治潰瘍性結(jié)腸炎研究較多[4]。訶子收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部，為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.及絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)，其味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功效[5]。由于訶子主歸肺與大腸經(jīng)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)常用其治療“腸澼”，本課題組前期對(duì)其治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥效學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果表明訶子水提物可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎模型動(dòng)物癥狀。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，建立訶子水提物HPLC指紋圖譜，以偏最小二乘(partial least squares，PLS)回歸法分析其“肺腸同治”的譜效關(guān)系，為訶子對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎“肺腸同治”藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材 10批訶子經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定，均為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實(shí)，具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(遼)2015-0001，體質(zhì)量(20±2)g。

1.3 試劑與藥物 小鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)(批號(hào)20171014GP)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)(批號(hào)20171014HS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號(hào)20171014JA)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)(批號(hào)20170328CT)試劑盒均購(gòu)自上海朗頓生物科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS)(批號(hào)9011-18-1)，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；沒(méi)食子酸(批號(hào)MUST-13040103，純度≥98%)、鞣花酸(批號(hào)MUST-14031010，純度≥98%)對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；訶黎勒酸(批號(hào)PRF8112302，純度≥98%)、訶子酸(批號(hào)PRF8071201，純度≥98%)對(duì)照品均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。甲醇為色譜純，磷酸為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.4 儀器 安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó) Agilent公司)；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(常州市國(guó)旺儀器制造有限公司)；Multiskan Mk 3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Fresco臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；FA1004B分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥效實(shí)驗(yàn)

2.1.1 訶子水提液制備 取各批藥材，砸取果肉，粉碎，稱(chēng)取適量，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱回流提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，預(yù)留適量濾液，供HPLC指紋圖譜用；剩余濾液分別濃縮成質(zhì)量濃度為0.13 g/mL的溶液，作為給藥溶液(以2020年版《中國(guó)藥典》所載訶子最大服用量按小鼠體表系數(shù)換算方法折算)備用[6]。

2.1.2 動(dòng)物分組、造模及給藥 按隨機(jī)對(duì)照原則將小鼠分為空白組、模型組及訶子給藥組(2.6 g/kg，S1～S10)，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠每日自由飲用2.5% DSS水溶液，空白組自由飲用純凈水，連續(xù)4 d，以小鼠毛色晦暗、腹瀉及聚堆現(xiàn)象明顯、糞便隱血測(cè)試陽(yáng)性為造模成功[7]。實(shí)驗(yàn)第5天，各組小鼠均自由飲用純凈水，然后訶子組每天按0.4 mL/20 g劑量灌胃給藥溶液，空白組、模型組小鼠灌胃同等劑量純凈水，連續(xù)7 d。

2.1.3 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水24 h，脫頸處死，剖開(kāi)腹腔及胸腔，剝離結(jié)腸和肺，生理鹽水沖洗血污，吸水紙上吸掉生理鹽水，稱(chēng)定質(zhì)量，加10倍量生理鹽水充分勻漿，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用ELISA法對(duì)組織勻漿中IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平進(jìn)行測(cè)定[6-7]。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 供試品溶液制備 取“2.1.1”項(xiàng)下預(yù)留訶子水提液30 mL回收溶劑，70%甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶，定容，再精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，吸取適量，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、鞣花酸對(duì)照品適量，甲醇制成分別含四者0.022 4、0.157 0、0.119 0、0.035 1 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～8 min，95.0%～90.0%B；8～15 min，90.0%～75.0%B；15～25 min，75.0% B；25～30 min，75.0%～70.0% B；30～50 min，70.0%～55.0%B；50～55 min，55.0%B)；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般體征 造模后，小鼠毛色晦暗，伴有炸毛、聚堆現(xiàn)象，腹瀉明顯，體質(zhì)量下降，糞便隱血檢測(cè)呈陽(yáng)性，訶子干預(yù)后上述現(xiàn)象均好轉(zhuǎn)。

3.2 訶子對(duì)小鼠肺腸組織中細(xì)胞因子的影響 模型組小鼠肺與結(jié)腸IL-10水平低于空白組，IL-1β、TNF-α、MPO水平均高于空白組；與模型組比較，訶子組IL-10水平升高，IL-1β、TNF-α、MPO水平降低，見(jiàn)表2。

表2 訶子對(duì)小鼠結(jié)腸與肺IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平的影響

3.3 HPLC指紋圖譜建立

3.3.1 圖譜生成 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A版)進(jìn)行共有峰匹配，得到指紋圖譜(圖1)，對(duì)各色譜峰進(jìn)行平滑、去噪、峰對(duì)齊后，生成對(duì)照指紋圖譜(圖2)，共標(biāo)記32個(gè)共有峰。取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，與指紋圖譜對(duì)比，確定3號(hào)峰為沒(méi)食子酸，27號(hào)峰為訶黎勒酸，31號(hào)峰為訶子酸，32號(hào)峰為鞣花酸(圖3)，相似度見(jiàn)表3，共有峰峰面積見(jiàn)表4。

圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜

圖2 10批樣品對(duì)照?qǐng)D譜

圖3 對(duì)照品色譜圖

表3 10批樣品指紋圖譜相似度

表4 10批樣品共有峰峰面積

3.3.2 方法學(xué)考察 取供試品溶液(S1)，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.8%，共有峰峰面積RSD<1.4%，色譜圖相似度>0.99，表明儀器精密度良好；取供試品溶液(S1)，于0、2、4、8、12、16 h在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.8%，共有峰面積RSD<1.2%，色譜圖相似度>0.99，表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；取藥材粉末(S1)6份，每份0.1 g，按“2.1.1”及“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.8%，共有峰面積RSD<1.2%，色譜圖相似度>0.98，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.3 譜效關(guān)系分析 以HPLC指紋圖譜中32個(gè)共有峰的峰面積為自變量(X)，編號(hào)為X1～X32，IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平為因變量(Y)，將相關(guān)數(shù)據(jù)代入MINITAB 19 軟件，建立偏最小二乘回歸方程，得到肺與結(jié)腸組織中4種細(xì)胞因子與共有峰之間的回歸系數(shù)值，見(jiàn)表5。由于藥效的產(chǎn)生是對(duì)IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平綜合調(diào)節(jié)作用的結(jié)果[8-10]，故進(jìn)一步以四者回歸系數(shù)的平均值來(lái)評(píng)價(jià)各色譜峰與潰瘍性結(jié)腸炎治療效果的相關(guān)度，結(jié)果見(jiàn)表5、圖4，可知與肺和結(jié)腸均呈正相關(guān)的色譜峰有8個(gè)，為峰1、8、9、10、19、20、27、32；均呈較大負(fù)相關(guān)的峰有5個(gè)，為峰3、12、13、15、26。

表5 各指標(biāo)回歸系數(shù)值

圖4 結(jié)腸與肺的平均回歸系數(shù)

4 討論

將供試品溶液在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在220、270 nm處呈現(xiàn)最大吸收，其中270 nm處訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸均呈較大吸收，并且為酚酸類(lèi)成分測(cè)定所常用，因此本實(shí)驗(yàn)采用270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其藥效的發(fā)揮是多種成分相互之間共同作用的結(jié)果。實(shí)踐證明，某些化學(xué)成分在中藥中含量較低，但其生物學(xué)活性卻很強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)在建立指紋圖譜的過(guò)程中，將檢測(cè)到的所有色譜峰進(jìn)行共有峰匹配，共得到32個(gè)共有峰。進(jìn)一步地，將32個(gè)共有峰與藥效結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以確保最大程度地反應(yīng)成分與藥效之間的關(guān)系。

潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀主要為腹瀉、便血，本實(shí)驗(yàn)采用DSS誘導(dǎo)制備小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，動(dòng)物體質(zhì)量下降、聚堆明顯且便血嚴(yán)重，與臨床癥狀相符。潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠肺與結(jié)腸組織中促炎因子和抑炎因子失調(diào)，腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，炎癥加重[11]；IL-1β、TNF-α為常見(jiàn)的促炎因子，IL-10為抑炎因子，MPO 為評(píng)價(jià)炎癥程度的重要指標(biāo)[12]。經(jīng)訶子治療后，所選取的4項(xiàng)指標(biāo)治療組與模型組均具有顯著性差異，表明訶子改善潰瘍性結(jié)腸炎癥狀的作用與下調(diào)IL-1β、TNF-α，促進(jìn)IL-10產(chǎn)生及抑制MPO活性有關(guān)。

中醫(yī)理論認(rèn)為“肺與大腸相表里”，肺與腸相互絡(luò)屬，病理上相互影響，腸病日久，必會(huì)累及于肺[13]?！胺螝馓?，大腸亦虛，而不能禁固，時(shí)時(shí)欲去，后重不已……”其指出肺氣虛弱，會(huì)累及大腸固攝作用，導(dǎo)致里急后重[14]，因此治療當(dāng)以升肺固腸共進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)所造潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠肺組織的各項(xiàng)炎癥因子水平測(cè)定結(jié)果表明結(jié)腸病變確實(shí)影響了肺，經(jīng)過(guò)訶子的治療，既減輕了腸道炎癥及腹瀉癥狀，又修復(fù)了肺部的損傷，達(dá)到了“肺腸同治”的作用。本實(shí)驗(yàn)共得到4組炎癥有關(guān)的藥效指標(biāo)數(shù)值，每組數(shù)值與共有峰面積計(jì)算回歸系數(shù)，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)色譜峰與不同指標(biāo)具有不同的回歸系數(shù)，說(shuō)明某一成分對(duì)不同指標(biāo)調(diào)控作用是不同的[15]，而藥效的產(chǎn)生是化學(xué)成分對(duì)4種細(xì)胞因子綜合調(diào)控的結(jié)果，因此應(yīng)綜合考慮某一成分對(duì)4種因子的整體調(diào)控作用，故最終選擇四組回歸系數(shù)的平均值來(lái)確定關(guān)聯(lián)度。結(jié)果表明，色譜峰1、8、9、10、19、20、27、32與結(jié)腸和肺均呈正相關(guān)，色譜峰2與結(jié)腸呈較大正相關(guān)，色譜峰7、14、30與肺呈較大正相關(guān)，提示這12種成分應(yīng)為“肺腸同治”的主要藥效成分，其中27為訶黎勒酸，32為鞣花酸；色譜峰3、12、13、15、26與結(jié)腸和肺均呈較大的負(fù)相關(guān)，說(shuō)明此5種成分不利于訶子對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的發(fā)揮。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)偏最小二乘回歸分析法建立訶子水提物指紋圖譜與潰瘍性結(jié)腸炎模型動(dòng)物肺與結(jié)腸組織中4種細(xì)胞因子之間的譜效關(guān)系，初步得到12種化學(xué)成分可能為訶子對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起治療作用的主要成分，為后續(xù)訶子治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。