馬秀珍(青海省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，青海 西寧 810000)

嘧菌酯英文名稱(chēng)：Azoxystrobin，分子式：C22H17N3O5，分子量：403.3875。是一種廣譜、高效、新型殺菌劑，具有保護(hù)、防治、鏟除三種功效，根據(jù)研究[1～5]嘧菌酯可用于莖葉噴霧、種子處理，也可進(jìn)行土壤處理，它對(duì)幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、卵菌綱和半知菌類(lèi))病害，如白粉病、銹病、穎枯瘸、網(wǎng)斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性，且與目前已有殺菌劑無(wú)交互抗性。在番茄植株噴霧嘧菌酯可顯著影響番茄的生理特性，增強(qiáng)抗逆性。嘧菌酯一般用于谷物、水稻、葡萄、馬鈴薯、蔬菜、果樹(shù)及其它作物。

嘧菌酯的過(guò)量使用會(huì)造成嚴(yán)重污染，危害人類(lèi)健康和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展，因此，本實(shí)驗(yàn)利用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜，以番茄為檢測(cè)對(duì)象，建立果蔬中嘧菌酯農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜(島津LC-30AD)-串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB4500)，高速組織搗碎機(jī)(轉(zhuǎn)速20000r/min);離心管；分析天平(感量0.01)；均質(zhì)儀；高速離心機(jī)(4000r/min)；0.22um有機(jī)系針孔濾膜過(guò)濾器；渦旋儀以及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。

1.2 試劑與材料

嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液100ug/ml(農(nóng)業(yè)部壞境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心)；乙腈(德國(guó)Merk公司，色譜純)；甲醇(德國(guó)Merk公司，色譜純)；甲酸；氯化鈉；復(fù)合型氨基固相萃取柱。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100ug/ml)用甲醇和番茄基質(zhì)分別稀釋至0.005ug/ml、0.01ug/ml、0.02ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.2樣品制備

將番茄切碎、混勻、密封，作為試樣，表明標(biāo)記，置于0～4℃冷藏保存，這符合制樣保存標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.3.3樣品提取與凈化

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品20g(精確至0.01)于50ml離心管中，加入40ml乙腈，用高速組織搗碎機(jī)(轉(zhuǎn)速15000r/min)勻漿提取2min，加入氯化鈉5～6g，繼續(xù)勻漿提取2min，在4000r/min離心機(jī)上離心5min，取上清液10ml(相當(dāng)于試樣5g)，在37℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至1ml，待凈化。采用復(fù)合型氨基柱凈化，萬(wàn)輝研究[10]固相萃取不會(huì)產(chǎn)生乳化問(wèn)題，效率高，節(jié)約試劑。將凈化柱放在下接平底燒瓶的固定架上，用乙腈+甲苯(3+1)預(yù)洗凈化柱，當(dāng)液面達(dá)到填料頂部時(shí)迅速將濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化住中，并更換平底燒瓶。再用5ml乙腈+甲苯(3+1)分次洗滌樣品瓶三次，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至凈化柱中，再用15ml乙腈+甲苯(3+1)洗脫農(nóng)藥，合并于平底燒瓶中，并在37℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，加入1ml甲醇+水(70+30)混勻，經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾后待上機(jī)測(cè)定，此提取凈化方法誤差與標(biāo)準(zhǔn)[7]結(jié)果相近。

1.3.4液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為C18 3um，150×2.1mm;流動(dòng)相為甲醇-1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，流速為0.3ml/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣梯度程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

質(zhì)譜掃描方式為ESI正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)；氣簾氣40psi；離子化電壓4500V；離子源溫度為550℃；輔助加熱氣為50psi；噴霧氣為50psi;采用的離子對(duì)為m/z：404.1～372和404～344.1，Collision Energy CE分別為20和34，Declustering Potential DP都為70，Entrace Potential EP都為10，Collision Cell Exit Political CXP都為10。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系

分別取0.005ug/ml、0.01ug/ml、0.02ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml的嘧菌酯純?nèi)軇┖突|(zhì)溶劑，上機(jī)檢驗(yàn)，以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性方程，純?nèi)軇┚€性方程為y=1.85e+003x+5.23e+0.003(r=0.9997)(純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1)；基質(zhì)線性方程為y=1.08e+003x+3.18e+003(r=0.9995)(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2)；結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，可見(jiàn)線性關(guān)系良好。

圖1 純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

2.2.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中的雜質(zhì)干擾待測(cè)物的離子化，使待測(cè)物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象，因此，為提高待測(cè)物的準(zhǔn)確度，要選擇方法消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。通過(guò)對(duì)比分析甲醇溶劑標(biāo)液色譜圖峰面積(圖譜見(jiàn)圖3)和番茄基質(zhì)標(biāo)液色譜圖峰面積(圖譜見(jiàn)圖4)，發(fā)現(xiàn)甲醇溶劑嘧菌酯峰面積大于番茄基質(zhì)嘧菌酯的峰面積，說(shuō)明番茄基質(zhì)對(duì)嘧菌酯有抑制作用，這與前人分析基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果一致[8]。為了消除這種抑制作用，選擇被測(cè)樣品的空白樣品進(jìn)行前處理，得到空白樣品基質(zhì)溶液，配置基質(zhì)標(biāo)，采取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計(jì)算分析。

圖3 甲醇溶劑圖譜

圖4 番茄基質(zhì)圖譜

2.2.2檢出限和定量限

按照檢出限和定量限評(píng)估分析方法[9]檢測(cè)一系列基質(zhì)標(biāo)液，當(dāng)信噪比S/N≥3時(shí)得到檢出限為0.006mg/kg，當(dāng)信噪比S/N≥10時(shí)得到定量限為0.01mg/kg，滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

2.2.3方法回收率和精密度

在番茄中分別添加0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg三個(gè)濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)6次，從番茄基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜以及加標(biāo)樣品圖譜中得出保留時(shí)間為6.82～6.83，峰形及分離度良好，空白基質(zhì)不干擾樣品檢測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示回收率均在75.00%以上。

表2 番茄基質(zhì)中嘧菌酯的回收率、精密度

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)番茄中嘧菌酯殘留量的方法，前處理采用復(fù)合型氨基柱凈化，相比傳統(tǒng)凈化省去濃縮換樣過(guò)程，提高了效率，同時(shí)有效除去了色素、有機(jī)酸、糖類(lèi)等干擾雜質(zhì)，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)抑制效應(yīng)，該方法的檢出限和定量限均符合我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)要求，回收率和精密度滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，可用作番茄等果蔬中嘧菌酯殘留檢測(cè)技術(shù)參考。