胡花婷 賴俊耀 李東芳

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第一位，全世界每年約有120多萬女性被診斷為乳腺癌[1,2]，我國乳腺癌發(fā)病率和病死率也呈明顯上升趨勢[3]，而其中30%～40% 的患者因發(fā)現(xiàn)晚或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥谌橄侔?。乳腺癌局部未?jīng)手術(shù)切除或術(shù)后局部復(fù)發(fā)后極易潰破，形成難愈性創(chuàng)面。而這種惡性腫瘤所致的難愈性創(chuàng)面給患者及家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力。在美國，超過600萬人遭受難愈性傷口，每年的治療費(fèi)用為250億美元[4]，在歐洲，整個(gè)衛(wèi)生經(jīng)費(fèi)的2%用于管理難愈性傷口[5]。惡性腫瘤所致的各種創(chuàng)面問題，是醫(yī)療界研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。乳腺癌發(fā)病率高，局部為皮膚淺表腫瘤，難愈性傷口發(fā)生率高，腫瘤潰破滲液、惡臭，目前臨床常規(guī)選用一些進(jìn)口敷料(抗感染、促滲液吸收作用)進(jìn)行對癥處理，療效有限且治療費(fèi)用高。有研究表明[6]傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療難愈性創(chuàng)面具有多靶點(diǎn)、多層次、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)，且劑型多樣，強(qiáng)調(diào)整體觀念，辨證論治，具有清熱解毒、活血化瘀、去腐生肌等功效，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

黃龍洗劑為全國名老中醫(yī)黎月恒教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)前期臨床觀察具有促進(jìn)腫瘤術(shù)后創(chuàng)面愈合的功效[7]，但是其僅限于臨床觀察，作用機(jī)制不清。為更好地開展黃龍洗劑的實(shí)驗(yàn)研究，我們在建立小鼠乳腺癌移植瘤的基礎(chǔ)上，采用黃龍噴劑干預(yù)小鼠乳腺癌移植瘤人工創(chuàng)面，進(jìn)一步探討其是否具有促進(jìn)乳腺癌創(chuàng)面愈合的效用，初步探討其可能的作用機(jī)制，以期尋求一種簡便效廉的治療方法來促進(jìn)惡性腫瘤所致創(chuàng)面的愈合，減輕患者癥狀和痛苦，具有十分重要的意義和臨床推廣應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康BALB/c小鼠30只，雌性，5～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2016-0002。每籠5只，SPF屏障系統(tǒng)+層流架飼養(yǎng)，環(huán)境適宜、自由進(jìn)食、飲水，飼料為湖南省腫瘤醫(yī)院提供的鼠用顆粒飼料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物黃龍噴劑(生黃芪30 g，龍葵 30 g，苦參 10 g，敗醬草 30 g，生大黃15 g，生附片15 g， 地榆 30 g，紅花 10 g，桃仁 10 g，五倍子 l5 g，白及30 g，連翹10 g)，參考《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑》[8]，標(biāo)準(zhǔn)湯劑的百分濃度=藥材重量/藥汁收得量×100%，以每克中藥加水約5 ml計(jì)算，總水體積的70%加到第一煎中，30%加到第二煎中，濾過，煎好后濾液合并濃縮至所需濃度，并調(diào)節(jié)中藥復(fù)方的pH值到7.4，分裝于150 ml的噴霧器中，4 ℃保存?zhèn)溆?，此中藥材出自中醫(yī)藥研究所且由湖南省中醫(yī)藥研究所統(tǒng)一制備。

1.1.3 主要儀器和試劑ACS電子秤(武漢精宜電子稱重儀器有限公司)；水合氯醛(上海國藥集團(tuán)生產(chǎn))；電子顯微鏡(上海無陌光學(xué)儀器有限公司)；4T1乳腺癌細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫)；H-DMEM(美國 GIBCO公司)；胎牛血清及胰蛋白酶(北京索來寶公司)；超凈臺(美國 BIOLOGICAL 公司)；恒溫水浴箱(HH-W420)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn))；CO2恒溫培養(yǎng)箱( TC-2323 型美國 SHEL-DON 公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本 SANYO 公司生產(chǎn));臺式離心機(jī)(Anke TDL-40B)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))；細(xì)胞培養(yǎng)板(北京天連器材有限公司)；外科手術(shù)刀；組織剪；無菌紗布等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將凍存的乳腺癌4T1細(xì)胞復(fù)蘇后，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化后用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸成5×107/ml細(xì)胞懸液。

1.2.2 小鼠乳腺癌移植瘤模型采用細(xì)胞懸液法，將配置好的乳腺癌4T1細(xì)胞株單細(xì)胞懸液，在裸小鼠右側(cè)近腋窩第二乳腺脂肪墊深面注射細(xì)胞懸液，形成一皮丘，內(nèi)含0.2 ml細(xì)胞懸液(1×107)個(gè)，共接種30只，待小鼠移植瘤大小約2 cm時(shí)，乳腺癌小鼠移植瘤模型建立成功。

1.2.3 小鼠移植瘤人工創(chuàng)面的建立將建模成功的小鼠采用經(jīng)典的全層皮膚切割傷模型，在無菌條件下，沿小鼠移植瘤皮膚面，用外科方法作切取全層皮膚，切取2 cm×2 cm的造模面積；建立全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面模型；創(chuàng)面加蓋兩層消毒干紗布，醫(yī)用膠布固定，造模后每只裸小鼠連續(xù)3 d后肢肌肉注射青霉素40萬U預(yù)防感染。

1.2.4 分組及給藥方法采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，隨機(jī)分為黃龍噴劑組、康復(fù)新組、空白對照組，每組10只小鼠。黃龍噴劑組予以黃龍噴劑外噴，每次5 ml，每日2次?？祻?fù)新組予以康復(fù)新溶液外噴，5 ml/次，2次/d?？瞻讓φ战M不做任何處理。黃龍噴劑組和康復(fù)新組均連續(xù)外噴藥物10 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 小鼠一般情況及創(chuàng)面情況觀察用藥后小鼠的進(jìn)食狀況，創(chuàng)面有無腫脹、滲出、壞死及出血，創(chuàng)面有無感染發(fā)紅，有無新生肉芽組織等。

1.3.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間創(chuàng)面愈合時(shí)間是評價(jià)創(chuàng)面愈合的傳統(tǒng)指標(biāo)之一，是指創(chuàng)面完全上皮化所需的時(shí)間，創(chuàng)面上皮化依靠肉眼的觀察，記錄不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面上皮化的時(shí)間。

1.3.3 創(chuàng)面愈合率記錄原始創(chuàng)面面積和未愈合創(chuàng)面面積，按下列公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率：愈合率= (原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%，面積測量方法采用數(shù)碼相機(jī)拍照行計(jì)算機(jī)image-pro-plus數(shù)碼圖像分析軟件分析創(chuàng)面面積，進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 創(chuàng)面組織病理學(xué)檢測取少量創(chuàng)面組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，觀察創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞的浸潤，新生血管及新生纖維細(xì)胞增生的情況，探討黃龍噴劑促進(jìn)創(chuàng)面愈合的初步可能機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況及創(chuàng)面情況造模后各組小鼠均出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食減少、活動(dòng)減少等情況，黃龍噴劑組小鼠于用藥后第3天恢復(fù)正常，其他2組小鼠活動(dòng)減少、食少。造模第1天各組小鼠創(chuàng)面均有水腫、滲血。用藥第2天后黃龍噴劑組及康復(fù)新組小鼠創(chuàng)面組織周圍水腫、滲血均消失，空白對照組于第3天水腫、滲血消失。用藥3 d后黃龍噴劑組及康復(fù)新組創(chuàng)面均有少量滲出，創(chuàng)面無壞死及感染，黃龍噴劑組創(chuàng)面周圍及基底部可見少許肉芽組織顆粒，可見新生上皮由四周向中心生長，空白對照組創(chuàng)面有較多滲出。用藥1周后，黃龍噴劑組創(chuàng)面較前縮小，創(chuàng)面被肉芽組織覆蓋，呈暗紅色，康復(fù)新組創(chuàng)面縮小低于黃龍噴劑組，可見少量肉芽組織覆蓋創(chuàng)面周邊，空白對照組創(chuàng)面周邊可見少量肉芽組織，長勢均不及黃龍噴劑組及康復(fù)新組。黃龍噴劑組小鼠創(chuàng)面均于10 d前已全部愈合，而康復(fù)新組及空白對照組有部分小鼠第10天才愈合，愈合緩慢。

2.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間黃龍噴劑組創(chuàng)面的平均愈合時(shí)間少于空白對照組和康復(fù)新組，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P<0.01和P<0.05)?？祻?fù)新組創(chuàng)面的平均愈合時(shí)間較空白對照組短，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間比較 (只，

2.3 創(chuàng)面愈合率在第3天開始，黃龍噴劑組和康復(fù)新組創(chuàng)面愈合率與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第5天到第10天，黃龍噴劑組創(chuàng)面愈合率與康復(fù)新組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠不同時(shí)間段創(chuàng)面愈合率比較 (只，

2.4 創(chuàng)面組織病理學(xué)檢測病理檢查提示空白對照組創(chuàng)面周邊可見較少肉芽組織，可見較多炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞較少，可見少量新生血管?？祻?fù)新組可見腫瘤邊緣片狀壞死及出血，可見較多炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞較黃龍噴劑組少，且細(xì)胞體較黃龍噴劑組偏小，毛細(xì)血管數(shù)目及大小不及黃龍噴劑組，黃龍噴劑組成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，體積較大，創(chuàng)面肉芽組織血管豐富，可見散在炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 小鼠乳腺癌創(chuàng)面HE染色

3 討論

乳腺癌所致的創(chuàng)面多為乳腺惡性腫瘤細(xì)胞浸潤皮膚穿透上皮形成或乳腺癌術(shù)后放療后所致，局部表現(xiàn)為紅腫、潰瘍、疼痛等，中醫(yī)稱乳腺癌為“乳巖”“乳石癰”，其病因病機(jī)為氣機(jī)郁滯、正氣虧虛、瘀毒互結(jié)，治療當(dāng)以清熱解毒、活血止痛、生肌斂瘡為主。黃龍噴劑具有清熱解毒、活血止痛、生肌斂瘡的功效，切中乳腺癌的病因病機(jī)，臨床使用療效顯著，前期臨床觀察表明黃龍噴劑具有促進(jìn)直腸癌Mile’s術(shù)后局部血液循環(huán)，促進(jìn)肉芽生長，加速傷口愈合的作用[7]，主要由生黃芪、龍葵、苦參、敗醬草、生大黃、生附片、地榆，紅花、桃仁、五倍子、白及、連翹組成。方中黃芪味甘，性溫，入肺、脾二經(jīng)，具有內(nèi)托已潰瘡瘍，生肌收口，外固表止汗，腠理充盈之功效，為君藥。龍葵、敗醬草、連翹、生大黃味苦，性寒涼，具有清熱解毒，消癰排膿之功效，共為臣藥。桃仁、紅花活血化瘀，散瘀止痛；白及味苦，性涼，具有收斂止血，消腫生肌之功效；地榆味苦，酸澀性寒，具有涼血止血，解毒斂瘡之功效；苦參清熱燥濕，收濕斂瘡；附片辛甘大熱，補(bǔ)命門衰敗之火，以生脾土，脾土健，則氣血生化有源，共為佐藥。五倍子澀苦微酸，具有收斂創(chuàng)口之功效，為使藥。全方寒熱相宜，燥濕相濟(jì)，溫補(bǔ)清消，諸藥合用，共奏清熱解毒、生肌斂瘡、活血化瘀之功。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長、調(diào)控表皮生長因子的合成和分泌、促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長、刺激創(chuàng)面新生血管形成、改善創(chuàng)面的血液循環(huán)、調(diào)控膠原的合成及代謝、調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)基質(zhì)形成、營養(yǎng)創(chuàng)面等作用，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[9]。但目前對于中醫(yī)藥作用于惡性腫瘤所致創(chuàng)面的研究多以臨床觀察為主，實(shí)驗(yàn)研究鮮有報(bào)道，大多限于臨床觀察，其促進(jìn)惡性腫瘤所致創(chuàng)面的機(jī)制不清。本研究采用小鼠乳腺癌移植瘤創(chuàng)面模型探討黃龍噴劑干預(yù)其創(chuàng)面的作用，結(jié)果表明黃龍噴劑相對于康復(fù)新組及空白對照組可以減少創(chuàng)面愈合的時(shí)間，提高創(chuàng)面愈合率，可能與其減輕炎癥反應(yīng)，增加膠原纖維的增生，促進(jìn)毛細(xì)血管的生長，改善創(chuàng)面血液循環(huán)有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較短，未于不同時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，不能反映創(chuàng)面愈合改變的病理變化的全過程，且未進(jìn)行免疫組化，使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不夠深入且存在一定的偏差，望在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。