高小敏，胡 彬，吳曉軍，姜 一，孔秀梅，劉杜霞，趙 勤

（1.西藏民族大學藏藥篩選實驗室，陜西 咸陽 712082；2.南昌大學第二附屬醫(yī)院急診科，江西 南昌 330027）

隨著高原地區(qū)資源不斷開發(fā)與利用，從平原地區(qū)進入高原地區(qū)的人越來越多。高海拔地區(qū)低氣壓、低氧、強紫外線的特殊環(huán)境［1］會使多數(shù)人出現(xiàn)急性高原反應(yīng)，嚴重的可導(dǎo)致急性高原病，甚至危及生命的高原肺水腫、腦水腫［2，3］。因此，高原病的預(yù)防和治療是眾多科研工作者需要攻克的難題，但其特殊的地理、氣候、條件等因素成了科研人員研究高原病的阻礙。有研究表示，通過低壓氧艙可模擬高原低壓缺氧環(huán)境，以方便研究者進行試驗研究［4］。本文使用低壓氧艙裝置模擬7 000 m海拔低壓缺氧環(huán)境，通過觀察不同缺氧時間大鼠的血常規(guī)、血清生化指標，以及心臟、肺臟、腦組織H&E染色的變化，為進一步研究急性低壓缺氧環(huán)境引起的急性高原病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠40只，雄性，體重為180~220 g，由西安交大動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（陜）2017-003，飼養(yǎng)于西藏民族大學醫(yī)學院動物房。

1.2 實驗儀器

低壓氧艙裝置（西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司）；獸用血細胞分析儀（邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號BC-2800Vet）；雪花制冰機（常熟市學科電器有限公司）；電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；Hettich高速冷凍離心機（德國Hettich科學儀器公司）；全波長酶標儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.3 藥品與試劑

中性甲醛緩沖液（天津天力化學試劑有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所（20170610）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所（20170615））；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所（20170612））。

1.4 急性低壓缺氧大鼠模型的建立

將40只清潔級SD大鼠隨機分為5組：急性低壓缺氧0、6、12、24、36 h組，每組8只。設(shè)置低壓氧艙裝置海拔為7 000 m，上升速度為30 min，下降速度為30 min。按照擬定條件，將大鼠置入低壓氧艙內(nèi)進行低氧處理。

1.5 血液常規(guī)指標和血清生化指標測定

血液學常規(guī)指標測定按設(shè)置的缺氧時間結(jié)束后立即取出大鼠，使用1%戊巴比妥按大鼠體重×0.3%進行麻醉。大鼠麻醉后，在腹主動脈處取血5 mL，立即進行血液學常規(guī)檢測。

血清試劑盒生化測定血常規(guī)檢測后，將所取的血液放在4℃條件下靜置24 h，分離血清進行生化指標檢測。將靜置血清分裝后，按照各項試劑盒方法進行生化指標SOD、MDA和LDH檢測。如果血清出現(xiàn)部分溶血，那么應(yīng)使用高速離心機（3 000 r/min）進行10 min離心，然后取上清待測。

1.6 心臟、肺臟、腦組織H&E染色

取各組大鼠的心臟、肺臟、腦組織浸泡在備好的10%甲醛中，H&E染色后做病理學檢查。

1.7 統(tǒng)計學處理

各組的結(jié)果數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計學軟件SPASS21.0進行統(tǒng)計分析處理，各組血常規(guī)和血液生化指標等數(shù)據(jù)使用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 在7 000 m海拔條件下不同缺氧時間對大鼠血液學部分指標的影響

與缺氧0 h組相比，模擬在7 000 m海拔環(huán)境下，缺氧6 h組大鼠的WBC、Lymp、Gran、RBC指標的數(shù)量均減少，HGB、HCT、PLT指標的濃度降低。隨著缺氧時間的延長，在缺氧12、24、36 h組大鼠的上述指標均增加，缺氧24 h組大鼠的RBC明顯升高（P<0.05），見表1。

表1 各組血常規(guī)指標變化（n=8，±s）Tab 1 Changes of blood routine indexes（n=8，±s）

表1 各組血常規(guī)指標變化（n=8，±s）Tab 1 Changes of blood routine indexes（n=8，±s）

組別缺氧0 h組缺氧6 h組缺氧12 h組缺氧24 h組缺氧36 h組FP WBC（109/L）6.26±2.53 5.00±3.02 9.13±3.16 7.95±3.25 8.10±4.15 2.02 0.11 Lymp（109/L）3.16±1.14 2.16±1.34 4.16±2.47 3.45±1.64 4.50±2.50 1.85 0.14 Gran（109/L）2.96±1.53 2.76±1.75 4.80±0.95 4.37±2.03 2.95±1.85 2.58 0.05 RBC（1012/L）6.83±0.92 6.33±2.16 7.03±0.58 7.70±0.38 7.56±1.30 1.65 0.18 HGB（g/L）125.00±20.07 109.33±47.22 124.66±11.50 139.00±8.76 145.50±42.41 1.70 0.17 HCT（%）38.10±5.26 34.13±13.4 37.23±3.80 41.88±2.30 43.70±10.99 1.67 0.18 PLT（109/L）854.00±125.50 725.00±216.34 891.50±10.60 762.70±112.73 855.30±185.23 1.81 0.15

2.2 在7 000 m海拔條件下不同缺氧時間對大鼠血清生化指標的影響

與缺氧0 h組相比，各缺氧時間組的大鼠血清中SOD活力均降低，其中缺氧24 h組和36 h組降低明顯，隨著缺氧時間延長，SOD活力降低越明顯，見表2。

與缺氧0 h組相比，各缺氧時間組的大鼠血清中MDA的含量呈波浪式升高，在缺氧12 h組的大鼠血清中MDA含量達最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。之后，隨著缺氧時間的延長，MDA含量逐漸降低，缺氧24 h組與缺氧0 h組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），缺氧36 h組的MDA含量與0 h組的水平（正常水平）較一致，見表2。

與缺氧0 h組相比，缺氧6 h組的大鼠血清LDH活力降低，其余各缺氧時間組的大鼠血清LDH活力均升高，在缺氧12 h時達到高峰。之后，隨缺氧時間延長，LDH逐漸下降，缺氧36 h組接近正常，見表2。

表2 大鼠SOD、MDA、LDH生化指標的影響（n=8，±s）Tab 2 Effects of SOD，MDA and LDH biochemical indexes in rats（n=8，±s）

表2 大鼠SOD、MDA、LDH生化指標的影響（n=8，±s）Tab 2 Effects of SOD，MDA and LDH biochemical indexes in rats（n=8，±s）

組別缺氧0 h組缺氧6 h組缺氧12 h組缺氧24 h組缺氧36 h組FP SOD活力（U/L）161.39±18.93 148.67±33.64 153.29±3.26 142.89±17.56 139.71±17.18 1.404 0.250 MDA含量（mmol/L）4.96±0.31 6.57±1.92 10.76±3.80 7.64±0.53 6.03±2.60 7.778 0.000 1 LDH活力（U/L）3 563.86±720.13 3 313.08±367.90 4 392.52±588.33 4 213.20±565.94 3 633.17±524.72 5.263 0.002

2.3 在7 000 m海拔條件下不同缺氧時間對大鼠心臟、肺臟、腦組織結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1對大鼠肺臟顯微結(jié)構(gòu)的影響 由圖1 H&E染色可見，與缺氧0 h組相比，在缺氧36 h內(nèi)，隨著缺氧時間的增加，肺臟出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎和血管周圍炎，可見血管周圍水腫和肺間質(zhì)增寬，病理性損傷程度隨著缺氧時間的增加越來越嚴重。

圖1 不同缺氧時間大鼠肺臟顯微結(jié)構(gòu)（放大倍數(shù)400×）Fig 1 Microstructure of lung in rats with different hypoxia time（magnification 400×）

2.3.2對大鼠心臟顯微結(jié)構(gòu)的影響 由圖2 H&E染色可見，缺氧0 h組心臟被膜完整，心室和心室肌輪廓較清晰；心肌細胞形態(tài)和肌纖維排列均正常。缺氧6 h組心室和心室肌輪廓較清晰；心肌纖維排列紊亂，纖維間隙擴張，變性的纖維細胞胞質(zhì)染色不均；其他未見明顯病理變化。缺氧12、24 h組心臟被膜完整，心室和心室肌輪廓較清晰；中膜層心肌變性，胞質(zhì)染色不均，排列紊亂，纖維間隙擴張；心肌間隙可見大量炎細胞浸潤，主要是嗜堿性較強的淋巴細胞；其他未見明顯病理變化。缺氧36 h組中膜層心肌變性，胞質(zhì)染色不均，排列紊亂，纖維間隙擴張；局部心肌間質(zhì)和瓣膜纖維溶解、壞死；心肌內(nèi)膜和心肌細胞間出現(xiàn)少量脂肪細胞。

圖2 不同缺氧時間大鼠心臟顯微結(jié)構(gòu)（放大倍數(shù)400×）Fig 2 Microstructure of heart in rats with different hypoxia time（magnification 400×）

2.3.3不同缺氧時間對大鼠腦組織顯微結(jié)構(gòu)的影響 由圖3 H&E染色可見，缺氧0 h組海馬組織結(jié)構(gòu)形狀完整，各區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)及數(shù)量正常；皮質(zhì)細胞層少量神經(jīng)元細胞嗜堿性增強，細胞體積正常，其他未見明顯病理變化。缺氧6、12、24 h組海馬組織結(jié)構(gòu)形狀完整，其中CA 1區(qū)神經(jīng)元細胞變性，少量可見橫軸結(jié)構(gòu)；其他未見明顯病理變化。缺氧36 h組海馬組織結(jié)構(gòu)形狀完整，其中CA 2、CA 3、DG區(qū)神經(jīng)元細胞變性，皮質(zhì)細胞層可見少量神經(jīng)元細胞變性，細胞固縮，嗜堿性增強，少量可見橫軸結(jié)構(gòu)；其他未見明顯病理變化。

圖3 不同缺氧時間大鼠腦組織顯微結(jié)構(gòu)（放大倍數(shù)400×）Fig 3 Microstructure of brain tissue of rats with different hypoxia time（magnification 400×）

3 討論

數(shù)據(jù)顯示，海拔3 500 m及以上會引起四分之一人群發(fā)生輕至重度高原病，而6 000 m以上的海拔會引起超過一半人群發(fā)生或輕或重的高原?。?］。隨著海拔不斷升高，大氣壓和氧分壓會越來越低［6］。因此，隨著海拔升高，大氣氧分壓和肺泡氧分壓會降低，最終使經(jīng)肺泡彌散入血液的氧隨之減少，直接或間接引起肺臟、心臟、腦等重要臟器損傷［7］。據(jù)統(tǒng)計，目前我國高原居住人數(shù)達6 000萬，而且越來越多的人因不同的需求進入高原地區(qū)，因此高原地區(qū)因其特殊的地理及環(huán)境條件引起的高原病越來越受到關(guān)注。然而，目前很難實現(xiàn)直接以具體的人為研究對象和進行實地海拔環(huán)境的研究。因此，模擬高原海拔環(huán)境的低壓氧艙為相關(guān)研究提供了可能，通過隨時設(shè)定低壓低氧的海拔和時間，為探討與建立低壓缺氧模型的理想條件提供便利。本文主要探討7 000 m海拔下的不同缺氧時間對大鼠造成的血液學、病理學等損傷。

心、腦組織是機體需氧最重要和最多的器官。當機體缺氧時，需要紅細胞攜帶更多的氧以保證心、腦有足夠的氧氣利用，因此機體缺氧時，紅細胞數(shù)量和血紅蛋白含量會升高［8］。血紅蛋白是機體內(nèi)攜氧的關(guān)鍵蛋白，當機體缺氧時會引起血紅蛋白濃度增加，進而將氧氣送至所需臟器組織［9］。但當紅細胞過多時，例如成年男性細胞計數(shù)>6.0×1012/L，血紅蛋白>170 g/L，成年女性紅細胞計數(shù)>5.5×1012/L，血紅蛋白>160 g/L時可認為是紅細胞增多癥，淤積的紅細胞會損傷心、腦、肺等臟器，從而進一步加重各臟器的損傷［10］。血液學常規(guī)結(jié)果提示，隨著缺氧時間的延長，紅細胞數(shù)量增加且血紅蛋白的濃度也隨之增加。紅細胞計數(shù)在各缺氧時間段均增加，在缺氧24 h后達到最高值，血紅蛋白在24 h也顯著升高，各類白細胞計數(shù)均有不同程度的增高。在7 000 m海拔環(huán)境下，不同缺氧時間對血液學常規(guī)的白細胞、紅細胞、血紅蛋白及血小板均有影響，除紅細胞外其余指標隨著缺氧時間的延長而增高。綜合分析，在急性缺氧24 h時可能會引起機體血常規(guī)明顯改變。

SOD是一類通過歧化反應(yīng)將超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶。它是一種重要的抗氧化劑，保護暴露于氧氣中的細胞，也是體內(nèi)清除氧自由基重要的酶之一，其活力的高低間接反映體內(nèi)自由基蓄積的多少［11］。氧自由基的蓄積會使其作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成有毒性作用的MDA，MDA積累的越多其毒性越大［12］。氧自由基一方面通過生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化而損傷細胞，另一方面還可通過過氧化物產(chǎn)生的物質(zhì)MDA引起細胞的損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，隨著缺氧時間的延長，SOD的活力在不斷下降，在36 h缺氧組達到最低，此時可能會急劇加重細胞的損傷。MDA的含量在缺氧12 h達到了峰值，之后逐漸降低，但均高于缺氧0 h組（空白組），在36 h缺氧組降至最低。缺氧會引起乳酸脫氫酶（LDH）活力升高，在缺氧12 h組達到高峰，隨后下降并至缺氧36 h組接近正常。結(jié)合SOD、MDA、LDH三者的結(jié)果分析，考慮處于低氧環(huán)境時大鼠體內(nèi)缺氧并需要更多能量來維持機體的能量平衡，當機體的葡萄糖供應(yīng)不足時無氧糖酵解途徑增加，此時會導(dǎo)致體內(nèi)的乳酸蓄積，乳酸在細胞質(zhì)內(nèi)通過無氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝枰狶DH來發(fā)揮作用。因此，高原低氧環(huán)境會間接導(dǎo)致體內(nèi)LDH活性的升高，同時可以根據(jù)LDH的高低來判斷機體損傷的程度。本實驗中，LDH的活力隨時間延長先升高后降低，在缺氧12 h和24 h之間達到了峰值，之后呈下降趨勢［14-16］。

急性高原缺氧會引起肺部血管收縮，導(dǎo)致肺部血液重新分布和肺泡-毛細血管屏障的損壞［17］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著缺氧時間的延長，肺臟逐漸出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎和血管周圍炎，可見血管周圍水腫和肺間質(zhì)增寬，且病理性損傷程度隨著缺氧時間的增加越來越嚴重。心臟臟器隨缺氧加重，中膜層心肌變性，胞質(zhì)排列紊亂，纖維間隙擴張；心肌間隙可見大量炎細胞浸潤，局部心肌間質(zhì)和瓣膜纖維溶解、壞死。腦組織在缺氧36 h組CA 2、CA 3、DG區(qū)神經(jīng)元細胞變性，皮質(zhì)細胞層可見少量神經(jīng)元細胞變性，細胞固縮，嗜堿性增強，少量可見橫軸結(jié)構(gòu)。因此，急性缺氧會引起肺臟、心臟、腦組織病理性損傷，且隨著缺氧時間的延長各臟器的損傷程度越來越嚴重。

綜上所述，在急性高原低壓缺氧環(huán)境下，不同缺氧時間均會對血液常規(guī)學、血清SOD、MDA、LDH及心、腦、肺產(chǎn)生不同的影響。機體在急性缺氧時可通過增加紅細胞數(shù)量、抗氧化反應(yīng)和無氧呼吸等措施保證重要臟器的氧含量和能量供應(yīng)。利用低壓氧艙裝置建立急性缺氧模型不僅操作簡單便利，還可以保證實驗的可行性、重復(fù)性、真實性，研究者可選取合適的缺氧時間建立不同程度的大鼠損傷模型。

作者貢獻度說明：

高小敏和胡彬負責數(shù)據(jù)分析和撰寫論文初稿，吳曉軍和劉杜霞負責實驗設(shè)計和處理動物，姜一和孔秀梅輔助數(shù)據(jù)處理作圖及動物飼養(yǎng)等，趙勤負責本文的實驗設(shè)計和論文審校。