朱瑞婷，牛奎舉，張然，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

生存環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要影響[1]，其中，干旱、高鹽、低溫、高溫、重金屬等是抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物脅迫因素。干旱脅迫會(huì)限制植物生長(zhǎng)，改變植物滲透平衡[2]。重金屬會(huì)破壞植物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生有害物質(zhì)[3]。鹽脅迫會(huì)破壞質(zhì)膜的完整性從而抑制植物生長(zhǎng)[4]。高溫脅迫會(huì)影響植物的生理代謝，對(duì)植物生長(zhǎng)造成一定的損害[5]。在長(zhǎng)期演變過(guò)程中，植物自身形成了一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)來(lái)抵御不良環(huán)境的傷害，在這些防御方法中，轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到了關(guān)鍵作用[6]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類通過(guò)與脅迫相關(guān)基因的特異順式作用元件相結(jié)合從而激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白，參與植物在非生物脅迫下的響應(yīng)[7]。NAC家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有不同的生物學(xué)功能。NAC家族在N端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，大約有150個(gè)氨基酸，C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[8]。其功能涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控和脅迫響應(yīng)等重要方面[9]。目前在很多植物中已經(jīng)鑒定出大量NAC家族成員，如石榴(Punicagranatum)[10]、果梅(Prunusmume)[11]、苦蕎(Tartarybuckwheat)[12]、西瓜(Citrulluslanatus)[13]等。不同物種間家族成員的數(shù)量與功能存在重要差異，但大量的NAC轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫反應(yīng)中起到調(diào)控作用[14-17]。如玉米(Zeamays)ZmNAC84在煙草中的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)耐旱性[18]，過(guò)表達(dá)OsNAC5可以增強(qiáng)水稻(Oryzasativa)的耐鹽性[19]，低溫脅迫下番茄(Solanumlycopersicum)SINAM1的過(guò)表達(dá)減輕了番茄在遭受低溫脅迫后的氧化損傷[20]。

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾屬植物，廣泛分布于北溫帶冷濕潤(rùn)地區(qū)，是一種多年生冷季型禾草，葉形美觀，具根狀莖，是優(yōu)良的草坪草。草地早熟禾喜冷涼濕潤(rùn)的氣候，耐寒性較強(qiáng)，但抗旱性較差[21]。隨著全球性氣候、生態(tài)和環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重，尤其是全球變暖的加劇，干旱、高鹽、高溫、重金屬污染已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素[22]，提高草坪草的抗逆性是目前草坪研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。草坪草抗逆基因的鑒定對(duì)了解其響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制和抗逆新品種的選育具有重要意義。有關(guān)非生物脅迫下草坪草NAC基因表達(dá)模式分析的報(bào)道較少，草地早熟禾N(yùn)AC基因尚未被完全鑒定。本課題組前期進(jìn)行了草地早熟禾抗旱、抗寒、耐鎘轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)NAC基因家族基因參與草地早熟禾的逆境脅迫響應(yīng)。本研究以前期組裝的草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，對(duì)具有全長(zhǎng)cDNA的草地早熟禾N(yùn)AC基因進(jìn)行鑒定并分析其不同脅迫下的表達(dá)模式，為草地早熟禾N(yùn)AC基因家族的分子調(diào)控機(jī)理研究提供理論依據(jù)，有助于優(yōu)良基因資源的挖掘和新品種培育。

1 材料和方法

1.1 供試材料與生長(zhǎng)條件

試驗(yàn)材料為草地早熟禾品種巴潤(rùn)，由北京克勞沃公司提供。采用砂培法種植，將清洗干凈的沙子等量的裝入直徑為9 cm、高度為17 cm的育苗缽中，種子直接播種后于生長(zhǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：白天溫度為25℃，時(shí)間為16 h，光照強(qiáng)度為6 000 lx，夜晚溫度為20℃，時(shí)間為8 h，濕度為50%。播種20 d后，用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培育，持續(xù)培養(yǎng)4周，在此期間每隔5 d換1次營(yíng)養(yǎng)液和蒸餾水。

1.2 植物處理

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，對(duì)其進(jìn)行6組處理，每組處理4個(gè)重復(fù)，第1組為對(duì)照：正常營(yíng)養(yǎng)液栽培；第2組為鹽處理：200 mmol/L NaCl溶液栽培；第3組為干旱處理：15% PEG-6000溶液栽培；第4組為低溫處理：0℃培養(yǎng)；第5組為高溫處理：38℃培養(yǎng)；第6組為重金屬處理：3 mmol/L CdCl2溶液栽培。處理時(shí)間6、24、48 h、7 d，每次取樣4次重復(fù)，取其葉片，迅速放入液氮中冷凍后保存于-80℃。

1.3 全長(zhǎng)草地早熟禾N(yùn)AC基因的鑒定

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)NAC蛋白序列可根據(jù)文獻(xiàn)提供的登錄號(hào)在NCBI上搜索獲得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[23]。在BioEdit軟件中，將本實(shí)驗(yàn)室已有和報(bào)道的5個(gè)草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)作為本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)[24-28]，以二穗短柄草NAC蛋白序列作為請(qǐng)求序列，Program選擇：‘tblastn’，Expectation Value選擇E-20，搜索本地草地早熟禾數(shù)據(jù)庫(kù)。將所得到的序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的blastX進(jìn)行搜索比對(duì)，獲得候選序列。

1.4 序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)ExPASy在線網(wǎng)站上的Prat Param工具對(duì)草地早熟禾N(yùn)AC家族基因的理化性質(zhì)進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，包括基因的大小、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性的平均值和脂肪指數(shù)。通過(guò)MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)草地早熟禾N(yùn)AC基因的保守基序進(jìn)行分析。根據(jù)在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測(cè)草地早熟禾N(yùn)AC基因的編碼蛋白序列，采用鄰近法在MEGA 7.0軟件上對(duì)PpNACs進(jìn)行聚類分析。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)

RNA提取使用天根公司植物RNA提取試劑盒，RNA反轉(zhuǎn)錄使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒，第1步去除基因組DNA反應(yīng)，第2步為反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋20倍作為模板。使用NCBI在線網(wǎng)站Prime-BLAST( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。利用天根熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析，20 μL反應(yīng)體系如下：模板5 μL，引物2 μL，ddH2O 3 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL。熒光定量PCR的條件為：95℃預(yù)變性15 min，40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，包括95℃變性10 s和58℃退火30 s。內(nèi)參基因?yàn)锳CT，每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，基因的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCT法計(jì)算[29]。

表1 定量PCR引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)，并用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾N(yùn)AC基因家族的生物信息學(xué)分析

2.1.1 草地早熟禾N(yùn)AC轉(zhuǎn)錄因子的鑒定 根據(jù)二穗短柄草的NAC蛋白序列，在BioEdit軟件中搜索本地草地早熟禾數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)搜索比對(duì)得到15個(gè)草地早熟禾N(yùn)AC全長(zhǎng)cDNA序列，具有完整的ORF序列，根據(jù)草地早熟禾拉丁名將其命名為PpNACs(表2)。結(jié)果表明，15個(gè)草地早熟禾N(yùn)AC基因中分子量在61 184.22(PpNAC18)～163 713.04(PpNAC20)，等電點(diǎn)在4.89～5.04，都屬于酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)除了PpNAC16外都大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性系數(shù)在0.705～1.022，屬于疏水性蛋白(大于零表示疏水性蛋白，小于零表示親水性蛋白，在±0.5之間為兩性蛋白)。

表2 15個(gè)全長(zhǎng)草地早熟禾N(yùn)AC轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)分析

2.1.2 PpNACs基因的motif分析和聚類分析 采用MEME網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)草地早熟禾N(yùn)AC基因的保守結(jié)構(gòu)域，可知15個(gè)NAC家族基因一共由12種motif組成(圖1)。其中，motif 2和motif 7在所有草地早熟禾N(yùn)AC基因中都存在。草地早熟禾N(yùn)AC基因由多種motif組成，除PpNAC16、PpNAC18、PpNAC21和PpNAC23外都具有motif 1-7。Motif 1在80%的PpNACs中存在，Motif 2和motif 6在87%PpNACs中存在。

圖1 草地早熟禾N(yùn)AC基因的基序結(jié)構(gòu)和聚類分析Fig.1 Motif composition and cluster analysis of NAC genes in Poa pratensis

對(duì)15個(gè)NAC家族基因進(jìn)行聚類分析，可分為3大類，第1類包括PpNAC1、PpNAC9、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC13、PpNAC24，都含有motif 1-7；第2類包括PpNAC2、PpNAC16、PpNAC18、PpNAC19、PpNAC21、PpNAC23，都含有motif2和motif7；第3類包括PpNAC6、PpNAC17和PpNAC20，都含有motif 1-7、motif 9和motif 11。

2.2 草地早熟禾N(yùn)AC基因家族表達(dá)模式分析

2.2.1 重金屬脅迫下NAC基因的表達(dá)PpNAC9和PpNAC16隨著時(shí)間的增大，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在7 d時(shí)達(dá)到最大值，分別是對(duì)照的6.53倍和8.27倍；PpNAC1、PpNAC2在6 h時(shí)表達(dá)量顯著增大，隨后呈現(xiàn)下降又上升的趨勢(shì)；PpNAC23在48 h時(shí)表達(dá)量顯著增大，在其他時(shí)間段無(wú)顯著性變化；PpNAC10和PpNAC18在7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，分別是對(duì)照的223.33倍和99.72倍；PpNAC1、PpNAC2、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC13、PpNAC16、PpNAC17、PpNAC19、PpNAC24在4個(gè)時(shí)間段內(nèi)均有顯著性變化(圖2)。

圖2 重金屬脅迫下NAC基因的表達(dá)分析Fig.2 Relative expression level of NAC genes under heavy metal treatment注：豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2.2 鹽脅迫下NAC基因的表達(dá)PpNAC9和PpNAC13在四個(gè)時(shí)間段內(nèi)都有顯著性變化，PpNAC9、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC16、PpNAC18、PpNAC19、PpNAC20、PpNAC23在7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，PpNAC10在7 d時(shí)表達(dá)量是對(duì)照的50.88倍，PpNAC24在6 h時(shí)表達(dá)量顯著增大，在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，是對(duì)照的36.33倍。PpNAC1、PpNAC13、PpNAC17在6 h是表達(dá)量顯著性增大，隨后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，響應(yīng)短期脅迫和長(zhǎng)期脅迫(圖3)。

圖3 鹽脅迫下NAC基因的表達(dá)分析Fig.3 Relative expression level of NAC genes under salt treatment

2.2.3 干旱脅迫下NAC基因的表達(dá)PpNAC9、PpNAC11、PpNAC17在干旱脅迫48 h內(nèi)變化不大，在7 d時(shí)表達(dá)量有明顯的增大，響應(yīng)長(zhǎng)期干旱脅迫。PpNAC1和PpNAC13在0～48 h內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在48 h～7 d呈現(xiàn)上升趨勢(shì)且在7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，分別是對(duì)照的94.08倍和80.30倍。在干旱脅迫下PpNAC2和PpNAC24在6 h時(shí)表達(dá)量顯著增大，達(dá)到最大值，而其他基因在7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值(圖4)。

圖4 干旱脅迫下NAC基因的表達(dá)分析Fig.4 Relative expression level of NAC genes under drought treatment

2.2.4 低溫脅迫下NAC基因的表達(dá) 在低溫脅迫下，PpNAC2和PpNAC13在6 h表達(dá)量顯著增大，24 h持續(xù)增大達(dá)到最大值，48 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表達(dá)水平受到抑制，7 d又出現(xiàn)上升趨勢(shì)。PpNAC1和PpNAC10的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h達(dá)到峰值，分別是對(duì)照的66.38倍、98.46倍。PpNAC17的表達(dá)量隨時(shí)間的增大表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。PpNAC21的表達(dá)量與對(duì)照相比在短期處理時(shí)表現(xiàn)出顯著增大，在長(zhǎng)期處理時(shí)表現(xiàn)出顯著減小。低溫脅迫下PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13、PpNAC16、PpNAC17的表達(dá)量均高于對(duì)照(圖5)。

圖5 低溫脅迫下NAC基因的表達(dá)分析Fig.5 Relative expression level of NAC genes under low temperature treatment

2.2.5 高溫脅迫下NAC基因的表達(dá) 研究表明，該家族大部分成員在高溫7 d時(shí)的表達(dá)水平較高。在高溫脅迫下，PpNAC16的表達(dá)量均具有顯著性變化，表達(dá)水平上調(diào)。隨著高溫處理時(shí)間的增大，PpNAC17、PpNAC19和PpNAC20的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，在7 d時(shí)處于較高的表達(dá)水平，分別是對(duì)照的5.85倍、5.35倍和11.63倍(圖6)。

圖6 高溫脅迫下NAC基因的表達(dá)分析Fig.6 Relative expression level ofNAC genes under high temperature treatment

3 討論

在其他高等植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻中，NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能已被闡明，具有相似結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有相同或相似的生物學(xué)功能[30]，已有文獻(xiàn)報(bào)道，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)預(yù)測(cè)其功能的方法可應(yīng)用于其他物種[21]，因此，通過(guò)對(duì)草地早熟禾和二穗短柄草NAC基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，有助于預(yù)測(cè)同一亞族的PpNACs基因的功能。已知的NAC基因家族成員參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和不同脅迫反應(yīng)，揭示了NAC基因的序列多樣化導(dǎo)致功能的多樣化[31]，為草地早熟禾N(yùn)AC基因家族的鑒定提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。草地早熟禾可用于草坪草的種植和提高城市綠化覆蓋率，但耐寒性強(qiáng)，抗旱性較差。NAC基因家族具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，對(duì)植物的非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程具有重要的作用。本試驗(yàn)從草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出15個(gè)全長(zhǎng)cDNA 序列的NAC基因。PpNACs家族成員的等位點(diǎn)在4.89～5.04，與李偉[32]克隆所得PpNACs基因的等位點(diǎn)為5.30相一致，都屬于酸性蛋白；與二穗短柄草和水稻NAC基因家族成員數(shù)目相差較大，可能是在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了丟失，也可能是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)有限而導(dǎo)致NAC基因家族成員的不完整性。根據(jù)NAC基因的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，PpNACs家族基因在N端含有基本的NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)包括N端的DNA結(jié)合區(qū)和C端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，N端大約有150個(gè)氨基酸殘基，分為A～E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域， A、C、D結(jié)構(gòu)域?yàn)橹饕挠H水區(qū)，E結(jié)構(gòu)域?yàn)橹饕氖杷畢^(qū)，在PpNACs轉(zhuǎn)錄因子家族成員中都含有E結(jié)構(gòu)域，都屬于疏水性蛋白。

在重金屬脅迫下，PpNACs基因隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，而在此脅迫過(guò)程中PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24為高表達(dá)。研究表明，水稻中NAC基因參與銅脅迫過(guò)程[33]，在西瓜中NAC基因家族在緩解鎘脅迫中可能具有重要作用[34]，關(guān)于NAC基因家族在重金屬脅迫中的研究很少，初步推測(cè)PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24在鎘脅迫過(guò)程中起到重要作用。PpNACs基因在鹽脅迫下大部分呈現(xiàn)上升下降再上升的趨勢(shì)，而且在第7 d時(shí)都表現(xiàn)為上調(diào)，PpNAC10和PpNAC24在鹽脅迫過(guò)程中表現(xiàn)出高表達(dá)量，出現(xiàn)的峰值時(shí)間不同，分別在7 d和48 h。研究表明，過(guò)表達(dá)ONAC045可提高水稻的耐鹽性[35]，在擬南芥中過(guò)表達(dá)CiNAC3表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性[36]。因此，PpNAC10和PpNAC24基因可作為研究草地早熟禾耐鹽性的候選基因。在干旱脅迫下，所有PpNACs基因在不同的時(shí)間響應(yīng)程度不同，表達(dá)量均有不同程度的增加，在第7 d時(shí)表達(dá)量具有顯著差異性(除PpNAC24外)，均高于對(duì)照。PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13基因在7 d表現(xiàn)出高表達(dá)量，而在擬南芥中超量表達(dá)NAC基因可提高其抗旱性[37]。在干旱脅迫下水稻OsNAC095基因的表達(dá)量增加，通過(guò)減少體內(nèi)水分的喪失提高水稻的抗旱性[38]。同樣在本試驗(yàn)干旱脅迫下所有基因的表達(dá)量都有所增加，因此推測(cè)這些基因參與草地早熟禾對(duì)干旱脅迫的調(diào)控，PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13可能在抗旱性方面起到重要作用。

在低溫脅迫下，PpNACs基因具有不同的表達(dá)趨勢(shì)，有的基因在脅迫過(guò)程中表現(xiàn)為全部上調(diào)，如PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC16和PpNAC17；有的基因在脅迫過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)為先上升后下降再上升，如PpNAC2和PpNAC13；有的基因則表現(xiàn)為先上升后下降再上升又下降的趨勢(shì)，如PpNAC6、PpNAC9、PpNAC16、PpNAC21和PpNAC24。在高溫脅迫下，除PpNAC20外的其他基因表達(dá)量的變化在10倍以內(nèi)。PpNACs基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)具有多樣性，如PpNAC1、PpNAC16和PpNAC20在脅迫過(guò)程中都表現(xiàn)為上調(diào)；PpNAC16、PpNAC23和PpNAC24在脅迫過(guò)程中為上升下降上升下降趨勢(shì)。由此發(fā)現(xiàn)在高低溫脅迫下PpNAC1和PpNAC16都表現(xiàn)為上調(diào)，PpNAC24都呈現(xiàn)“M”趨勢(shì)，它們?cè)跍囟让{迫下具有相同的變化趨勢(shì)，可能是受到相同的分子調(diào)控，參與相同的調(diào)控路徑。在茶樹(shù)(Camelliasinensis)中CsNAC1和CsNAC2響應(yīng)溫度脅迫并有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[39]。本試驗(yàn)表明PpNACs基因響應(yīng)高溫和低溫脅迫，不同基因響應(yīng)高低溫脅迫程度不同，體現(xiàn)了PpNACs基因在溫度脅迫下具有復(fù)雜的調(diào)控性。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下番茄中SlNAM1基因的過(guò)表達(dá)會(huì)提高滲透物的含量，降低超氧陰離子的含量，提高植株的抗寒性[20]。PpNAC1和PpNAC10在24 h表現(xiàn)為高表達(dá)量，PpNAC18在48 h表現(xiàn)為高表達(dá)量，它們可以作為草地早熟禾對(duì)低溫脅迫下調(diào)控的候選基因。研究發(fā)現(xiàn)在番茄中抑制SlNAC1的表達(dá)影響熱激蛋白的積累，轉(zhuǎn)基因植株的抗性降低，SlNAC1在番茄耐高溫中起到正調(diào)控作用[40]，本研究中PpNAC20在高溫脅迫下為高表達(dá)，它可能在耐高溫過(guò)程中起到重要作用。

在本試驗(yàn)中同時(shí)分析了PpNACs基因在重金屬、高鹽、干旱、高溫和低溫脅迫下的表達(dá)情況，15個(gè)PpNACs基因具有不同的表達(dá)模式，這些基因參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，為確定基因功能提供了重要信息[41-42]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PpNAC10在重金屬、高鹽、干旱和低溫脅迫下為高表達(dá)，PpNAC18在重金屬、干旱和低溫脅迫下為高表達(dá)，PpNAC10和PpNAC18在多種非生物脅迫下表現(xiàn)突出，因此可將PpNAC10和PpNAC18作為候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

根據(jù)二穗短柄草的蛋白序列和草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析得到15個(gè)PpNACs基因全長(zhǎng)cDNA序列，具有完整的開(kāi)放閱讀框。15個(gè)PpNACs轉(zhuǎn)錄因子都是酸性蛋白，除了PpNAC16，其他都屬于不穩(wěn)定蛋白，疏水性蛋白。PpNACs成員通過(guò)聚類分析可分為3類，Motif分析發(fā)現(xiàn)大部分PpNACs基因家族成員具有motif 1、2、3、4、5、6、7，具有相似的結(jié)構(gòu)。通過(guò)qRT-PCR分析草地早熟禾在不同非生物脅迫下的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，15個(gè)PpNACs基因均能響應(yīng)不同的非生物脅迫，具有不同的表達(dá)模式，與重金屬脅迫相關(guān)的基因有PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24；與耐鹽性相關(guān)的基因有PpNAC10和PpNAC24；與抗旱性相關(guān)的基因有PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10和PpNAC13；與耐寒性相關(guān)的基因有PpNAC1、PpNAC10和PpNAC18；與耐高溫相關(guān)的基因有PpNAC20，綜上發(fā)現(xiàn)PpNAC10和PpNAC18在多種抗逆過(guò)程中起到重要作用，可作為后續(xù)功能驗(yàn)證試驗(yàn)的候選基因。