李學(xué)震，和法濤，馬艷蕊，劉光鵬，初 樂，鄭明珠

（1.中華供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250220；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春130118）

桑黃菌（Sanghuangporus spp.）是一類黃褐色多年生稀有真菌，通常生長在桑樹上，屬真菌界（Fungi）擔(dān)菌子門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 桑黃屬 （Sanghuangporus）[1]。粗毛纖空菌 [Inonotus hispidus(Bull.:Fr)P.Karst]，屬于銹革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 纖孔菌屬（Ionnouts），有學(xué)者認(rèn)為粗毛纖空菌是傳統(tǒng)中藥“桑黃”，與桑黃菌有相似功效[2]。在中國、韓國和日本等亞洲國家，桑黃常作為傳統(tǒng)中藥用于治療口腔潰瘍、胃腸疾病、淋巴疾病和癌癥等[3-4]。據(jù)報道，桑黃有抗炎癥、提高免疫和抑制腫瘤生長等作用[5-6]，其抗氧化能力也引起了大量學(xué)者的關(guān)注，桑黃能清除人體內(nèi)過量的自由基，并且這些自由基與炎癥、腫瘤和免疫下降的發(fā)生相偶聯(lián)[7]。如王一菲等[8]和閆景坤等[9]研究了不同桑黃抗氧化能力的相關(guān)指標(biāo)，表明不同桑黃的抗氧化作用有顯著區(qū)別。

以往關(guān)于桑黃的研究大多集中在子實體活性物質(zhì)的提取與活性評價，但野生桑黃受季節(jié)影響，生長緩慢，數(shù)量少不易獲得，而人工栽培比較困難[10]。因此，有研究人員利用液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃菌絲體，并從中提取活性成分，從而驗證了桑黃菌絲體黃酮比子實體黃酮有更強的抗氧化效果[11]。姜福春等[12]在發(fā)酵過程中添加乙酸鎂可促進菌絲體的產(chǎn)量和黃酮類物質(zhì)的積累，且增強了體外抗氧化活性。

通過研究不同桑黃菌株生長特性，旨在對不同桑黃菌株的抗氧化能力進行比較，以期全面認(rèn)識桑黃的生長特性和抗氧化特性，并為篩選適用于固體培養(yǎng)和液體發(fā)酵的桑黃提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試6個菌株，均由山東省臨清市哲碩農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供，菌株情況詳見表1。

表1 菌種信息Tab.1 Information of strains

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基，青島賓得生物技術(shù)有限公司；PDB培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司。

POD培養(yǎng)基，在PDA培養(yǎng)基中加入0.05%愈創(chuàng)木酚配置而成。

羧甲基纖維素培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g、七水硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀2 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、酵母粉2 g、磷酸二氫鉀1.5 g、七水硫酸鎂0.75 g、氯化鈣0.75 g，蒸餾水1 L。

1.2.2 其他試劑

磷酸氫二鈉，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、羧甲基纖維素鈉、三氯化鐵、愈創(chuàng)木酚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀，天津大茂化學(xué)試劑廠；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，以上試劑均為分析純。

1.3 試驗儀器

BSC-150恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-1000型紫外分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司；TDL-5A低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器；ME-104型萬分之一天平，梅特勒托利多儀器有限公司；HH-4型顯數(shù)恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；R308型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生物科技有限公司，ZWYR-2112B型恒溫調(diào)速搖床柜，上海智誠分析儀器制造有限公司，F(xiàn)D-2型真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種平板活化與制備

取分離純化后的斜面菌株，在無菌操作臺上取0.5 cm2接入PDA平板，菌株長到4 cm～6 cm時，保存在4℃冰箱備用，使用前在28℃培養(yǎng)箱中恒溫6 h。

1.4.2 菌株生長速度測定

根據(jù)曲德輝等[13]的方法進行測定。

1.4.3 發(fā)酵菌絲生物量測定

發(fā)酵種子液制備：取平板上的菌絲，用直徑5 mm的打孔器打孔，使用250 mL的瓶子，裝液量為100 mL，每瓶接種 4塊。28℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，待菌絲長滿搖瓶，用手持?jǐn)嚢杵髟跓o菌操作臺內(nèi)將菌絲打散，但不破壞細(xì)胞，放入4℃冰箱備用，使用前在搖床28℃恒溫6 h。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：將制備好的6個菌株的液體種子液接入PDB培養(yǎng)基中，接種量為10%，使用500 mL的瓶子，裝液量為200 mL，每個菌種3瓶。28℃、20 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)發(fā)酵液5 000 r·min-1離心10 min，沉淀的菌絲體用蒸餾水清洗3次～5次，凍干稱重，上清液放入4℃冰箱保存以測定抗氧化活性。

1.4.4 相對酶活性測定

漆酶相對活性根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]的方法進行測定。

羧甲基纖維素酶相對活性測定根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法進行測定。

1.4.5 發(fā)酵液抗氧化能力測定

1） 羥自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法并做一些改進，取8 mmol·L-1的FeSO4溶液和水楊酸溶液各1 mL混合，取制備好的發(fā)酵液各0.1 mL，加入混合液中震蕩搖勻。之后加入3%的H2O2溶液1 mL繼續(xù)震蕩搖勻使其充分反應(yīng)，在水浴鍋中37℃保溫30 min，510 nm測定吸光值。羥自由基清除率（E1，%）計算公式為：

式中：A1為樣品反應(yīng)體系的吸光度值；A2為去離子水代替H2O2反應(yīng)體系的吸光度值；A0為去離子水代替樣品反應(yīng)體系的吸光度值。

2）DPPH自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]的方法進行測定，準(zhǔn)確稱取DPPH試劑5 mg，溶于250 mL無水乙醇中，此時DPPH溶液濃度為0.02 mg·mL-1。取制備好的發(fā)酵液各0.1 mL加入3.9 mL的DPPH溶液中，常溫避光20 min，517 nm處測吸光度值。DPPH自由基清除率（E2，%） 計算公式為：

式中：A3樣品反應(yīng)體系的吸光度值；A4為無水乙醇代替DPPH溶液反應(yīng)的吸光度值；A0為無水乙醇代替樣品反應(yīng)體系的吸光度值。

3）相對還原力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]的方法進行測定，取0.5 mL發(fā)酵液加入0.6 mL的PBS緩沖液（0.2 mol·L-1、pH 6.6） 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀1.5 mL。混勻后50℃，保溫20 min，取出冷卻后，加入10%三氯乙酸2.5 mL。取混合液2.5 mL加2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min后于700 nm處測吸光度值。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 22、Origin 9.0和 GraphPad Prism 8進行處理和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長特性

2.1.1 不同桑黃菌株平板培養(yǎng)生長狀態(tài)

6種桑黃菌株的生長特性見表2。

表2 不同桑黃菌株平板培養(yǎng)生長狀態(tài)Tab.2 The growth state of the flat plate culture of different Sanghuang strains

如表1所示，在相同培養(yǎng)條件下，不同桑黃菌株平板生長的菌絲密度有很大差異，其中東北桑黃D、楊樹桑黃Q和粗毛纖孔菌182的菌塊厚，菌絲密集；楊樹桑黃Q和粗毛纖孔菌124菌塊略薄，但菌絲密集；韓國桑黃H菌塊最薄，且菌絲稀疏，這可能與菌絲的生長速度有關(guān)。

2.1.2 不同桑黃菌株生長速度

6個桑黃菌株的生長曲線見圖1，生長速度見圖2。

圖1 不同桑黃菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of different Sanghuang strains

圖2 不同桑黃菌生長速度Fig.2 Growth rates of different Sanghuang strains

如圖1、圖2所示，從生長曲線的斜率可以看出東北桑黃D和楊樹桑黃Q從接種后生長速度一直高于其他4個桑黃菌株。從第3天開始，東北桑黃D的生長速度有較明顯的上升，略微下降后，在第6天明顯上升，而楊樹桑黃Q生長速度一直保持平穩(wěn)。其他5個桑黃菌株在前3 d前生長速度相差較小，之后韓國桑黃H的生長速度保持平穩(wěn)，而粗毛纖孔菌182在第6天生長速度超過楊樹桑黃Q和粗毛纖孔菌124。11 d后東北桑黃D最先長滿平板，6個桑黃菌株的平均生長速度依次為東北桑黃D＞楊樹桑黃Q＞粗毛纖孔菌182＞粗毛纖孔菌124＞桑樹桑黃Y＞韓國桑黃H。

2.1.3 不同桑黃菌液發(fā)酵菌絲生物量

桑黃菌液發(fā)酵菌絲生物量統(tǒng)計見圖3。

圖3 不同桑黃菌株菌絲生物量Fig.3 Mycelium biomass of different Sanghuang strain

如圖3所示，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，粗毛纖孔菌182的菌絲生物量最高達(dá)（1.23 g）；而楊樹桑黃Q、桑樹桑黃Y和粗毛纖孔菌124的菌絲生物量相差不大，分別為1.11 g、1.13 g和1.07 g；產(chǎn)量最低的是韓國桑黃H，菌絲生物量僅有0.73 g。值得注意的是東北桑黃D菌絲生物量只超過了韓國桑黃H，與其平板培養(yǎng)的生長速度不一致，這表明東北桑黃D適用于固態(tài)發(fā)酵，而粗毛纖孔菌182適用于液體發(fā)酵。

2.2 不同桑黃菌株相對酶活性

漆酶和羧甲基纖維素酶能分解木質(zhì)素和纖維素為桑黃菌絲生長提供養(yǎng)料，同時參與氧化呼吸過程中的電子鏈傳遞，為桑黃生長提供更多能量并促使菌絲體內(nèi)物質(zhì)合成和積累[19]。以變色圈大小表示漆酶和羧甲基纖維素酶活性的高低，即變色圈越大酶活性越高，6個菌株漆酶和羧甲基纖維素酶活性試驗結(jié)果見表3。

如表3所示，6個菌株的2種酶活性差異較大，羧甲基纖維素酶活性最強的是東北桑黃D，其次是楊樹桑黃Q和桑樹桑黃Y，而粗毛纖孔菌124未檢出羧甲基纖維素酶；漆酶活性最高的是韓國桑黃H，但6個菌株漆酶活性差異并不顯著。

表3 不同桑黃菌株相對酶活性Tab.3 Relative enzyme activity of different Sanghuang strains

2.3 發(fā)酵液抗氧化能力

2.3.1 羥自由基清除率測定

6種桑黃羥自由基清除率見圖4。

圖4 不同桑黃菌株羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rates of different Sanghuang strains

如圖4所示，楊樹桑黃Q和東北桑黃D發(fā)酵液的羥自由基清除率最高，分別達(dá)到85.39%和72.28%，其次是韓國桑黃H和桑樹桑黃Y，分別達(dá)到70.96%和62.68%，清除率最低的是粗毛纖空菌182和124，分別為53.18%和51.75%。

2.3.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在517 nm處有最大吸收波長，當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)時，自由基被清除，其在517 nm處的最大吸收會減少[20]。因此可以通過檢測517 nm處的吸光度值來判斷活性物質(zhì)的DPPH自由基清除活性。6個桑黃菌株發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力結(jié)果見圖5。

圖5 不同桑黃菌株DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rate of different Sanghuang strains

如圖5所示，東北桑黃D和粗毛纖孔菌182的清除率最高，分別為91.93和86.73%。其余4個桑黃菌株的DPPH自由基清除率均不超過80%，最低的是楊樹桑黃Q，清除率僅為57.58%。

2.3.3 相對總還原力測定

還原性物質(zhì)能使鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，與反應(yīng)體系中的三氯化鐵進一步反應(yīng)生成普魯士藍(lán)Fe4[Fe(CN)6]3，在700 nm處有最大吸收值，且吸光度值越大表明還原能力越強[21]。6個桑黃菌株發(fā)酵液中還原力結(jié)果見圖6。

圖6 不同桑黃菌株相對總還原力Fig.6 Relative total reduction force of different Sanghuang strains

如圖6所示，相對總還原力最高的是東北桑黃D，其次是粗毛纖孔菌182，結(jié)果與DPPH清除能力結(jié)果相似，其余4個桑黃菌株發(fā)酵液相對還原力大小為桑樹桑黃Y＞粗毛纖孔菌124＞韓國桑黃H＞楊樹桑黃Q。

3 結(jié)論

以6個不同桑黃菌株為研究對象，利用固體培養(yǎng)和液體發(fā)酵觀察桑黃的生長狀態(tài)，考查桑黃菌的生長速度及菌絲生物量，比較不同桑黃菌株漆酶和羧甲基纖維素酶的相對活性，通過測定羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原力評價桑黃抗氧化能力。結(jié)果表明，菌絲密度與桑黃生長速度呈正相關(guān)；菌絲生物量結(jié)果表明，東北桑黃D適用于固體培養(yǎng)而粗毛纖孔菌182適用于液體發(fā)酵；羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原力測定表明，東北桑黃D和粗毛纖孔菌182均有較強抗氧化能力。試驗結(jié)論為桑黃類真菌的發(fā)酵培養(yǎng)提供了新的評價依據(jù)，也為桑黃類真菌抗氧化活性物質(zhì)的進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。