張周美，謝純良，顏少慰，周映君，朱作華，龔文兵，嚴(yán) 理，胡鎮(zhèn)修，彭源德**

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南御家化妝品有限公司，湖南 長沙 410000）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst）為層菌綱（Hymenomycetes） 多孔菌目（Polyporales） 多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma） 真菌，又名還陽草、瑞芝等，含有多糖、氨基酸和靈芝酸等多種生物活性物質(zhì)，《本草綱目》中記載其具有清除自由基、抗炎、抗過敏、保濕、延緩皮膚衰老、祛斑、美白、改善角質(zhì)層等功效[1-2]。因此，靈芝提取物廣泛應(yīng)用于各類化妝品中。

目前在化妝品市場上應(yīng)用的主要原料是靈芝子實體水提物和醇提物，如靈芝三萜等[3]。然而野生靈芝物種逐漸減少，人工培養(yǎng)子實體周期長，且占地面積大，易受季節(jié)和原料等諸多因素影響。因此，來源于子實體的靈芝化妝品原料成本普遍較高[4-5]，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，需要探索一種低成本生產(chǎn)靈芝化妝品原料的方法[6-7]。

目前，在抗生素的生產(chǎn)上已經(jīng)廣泛使用真菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)具有許多優(yōu)點，生產(chǎn)量大，發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基組成和時間等發(fā)酵條件更容易控制，成本較低[8-9]。將靈芝的菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中，以一定轉(zhuǎn)速和溫度進行培養(yǎng)，菌絲體在培養(yǎng)基中獲得合成代謝產(chǎn)物或生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式稱為靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)。目前，該發(fā)酵技術(shù)主要運用于生產(chǎn)靈芝菌絲體多糖和三萜，有研究表明，液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的靈芝多糖與子實體多糖具有大致相同的功能[10-11]。但是，基于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的靈芝發(fā)酵液是否能成為化妝品原料的相關(guān)研究較少。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)我國靈芝有103種，占世界靈芝種類的88%，其中具有護膚價值的僅有10種[12]。由于不同菌株遺傳背景不同，其護膚活性也有顯著差異[13]。已有研究表明，不同靈芝菌株通過液體深層發(fā)酵后發(fā)酵液中的多糖和三萜含量具有顯著差異，但是對不同菌株的發(fā)酵液抗氧化和美白活性比較分析相關(guān)研究較少[14]。黑色素生物合成中最重要的酶是酪氨酸酶，因此檢測酪氨酸酶活性的抑制率即可體現(xiàn)發(fā)酵液的美白活性[15]。

本研究利用液體深層發(fā)酵技術(shù)對靈芝進行培養(yǎng)，對不同來源靈芝菌株發(fā)酵液中DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶活性以及多糖、三萜含量進行測定，以期篩選出抗氧化和美白活性更好的靈芝菌株。降低靈芝類化妝品原料成本，以期擴大靈芝發(fā)酵液在護膚品行業(yè)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸、Tris，賽國生物科技有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉、苯酚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；香蘭素、無水乙醇，湖南匯虹試劑有限公司；焦性沒食子酸、冰醋酸、磷酸氫二鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；七水合硫酸亞鐵，廣東省臺山市化工廠；Polypheno10 Oxidase，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胰蛋白胨、酵母膏，賽默飛世爾科技公司；麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基），青島日水生物技術(shù)有限公司；發(fā)酵專用豆粕粉，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌株

本試驗中使用的4個靈芝菌株分別來自中國普通微生物菌株保藏中心（菌株編號CGMCC 5.1817）、中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心（菌株編號CICC 14022）和中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心（菌株編號ACCC 51718和ACCC 51726）。各菌株在恒溫培養(yǎng)箱28℃條件下分別于MEA瓊脂培養(yǎng)基（麥芽提取物1.2%、瓊脂2%、葡萄糖1%）中培養(yǎng)7 d。

1.2.2 靈芝液體深層發(fā)酵條件的優(yōu)化

將4片不同菌株來源的靈芝菌絲體（每片約40 mm2），接種到麥芽浸粉培養(yǎng)基中（MEA培養(yǎng)基，配方為麥芽提取物20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、酵母提取物 1 g·L-1、大豆蛋白胨 2.5 g·L-1、蛋白胨 1 g·L-1，pH 5.5） 或完全培養(yǎng)基（CYM培養(yǎng)基，配方為葡萄糖 20 g·L-1、酵母提取物 2 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、蛋白胨2 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、K2HPO40.46 g·L-1）中。30℃、180 r·min-1培養(yǎng)3 d～7 d。培養(yǎng)完成后，離心25 min（5 000 r·min-1），收集上清液，通過0.22 μm濾膜過濾后保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 不同靈芝菌株發(fā)酵液的抗氧化活性檢測

取1 mL樣品，加入1 mL的DPPH溶液（0.2 mmol·L-1），混合后室溫靜置30 min，于517 nm測其吸光度，每個樣品測3次平行。DPPH自由基清除率（Q，%） 計算公式為[16]：

式中：As為1 mL的DPPH乙醇溶液加1 mL樣品的吸光度；Ax為1 mL溶劑加1 mL樣品的吸光度；A0為1 mL的DPPH乙醇溶液加1 mL溶劑的吸光度。

在10 mL試管中加入5.7 mL的Tris-HCl緩沖液（50 mmol·L-1，pH 8.2）[17]，加入 0.2 mL 樣品混合后放置于25℃水浴鍋中，10 min后取出，再加0.1 mL（10 mmol·L-1）鄰苯三酚溶液（已預(yù)熱）[18]。超氧陰根離子自由基清除率（W，%）計算公式為：

式中：Aj為0.2 mL樣品加5.7 mL的Tris-HCl緩沖液與0.1 mL鄰苯三酚溶液快速混勻后1 min內(nèi)吸光度的增加值；Ai為0.2 mL純水加5.7 mL的Tris-HCl緩沖液與0.1 mL鄰苯三酚溶液快速混勻后1 min內(nèi)吸光度的增加值。

1.2.4 不同靈芝菌株發(fā)酵液酪氨酸酶活性抑制檢測

使用酪氨酸酶活性抑制試驗方法，以L-酪氨酸作為底物進行測定[19]。試驗體系組成見表1。

表1 酪氨酸酶活性抑制率試驗體系Tab.1 Experimental system of inhibition rate of tyrosinase activity

將PBS、酪氨酸酶、樣液按表1體積分別添加至4組試管中，混勻，37℃水浴鍋中恒溫加熱10 min，后加入1 mL的L-酪氨酸，繼續(xù)在37℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)10 min，最后在冰水中迅速冷卻，使用多功能酶標(biāo)儀測定475 nm處4組試管吸光度[20]。酪氨酸酶活性抑制率（K，%）以下公式進行計算：

式中：A1為3 mL的PBS加1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度；A2為1 mL酪氨酸酶加2 mL的PBS、1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度；A3為2 mL的PBS加1 mL樣品、1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度；A4為1 mL酪氨酸酶加1 mL的PBS、1 mL樣品、1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度。

1.2.5 不同靈芝菌株發(fā)酵液多糖含量檢測

采用苯酚-硫酸法，測定抗氧化及美白活性較優(yōu)培養(yǎng)基的靈芝液體深層發(fā)酵液中多糖含量[21]。分別吸取一定梯度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液置于試管中，用超純水定容至1.0 mL，得到9個不同濃度的葡萄糖溶液 （0、0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、 0.05 mg·mL-1、 0.06 mg·mL-1、 0.07 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1），向試管中加入1.0 mL苯酚溶液（0.5%）后，立即加入5.0 mL濃硫酸，快速混勻靜放置反應(yīng)30 min，490 nm下測吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

取1 mL樣品液，用3倍體積95%乙醇進行醇析24 h，后5 500 r·min-1離心30 min，去除上清液，收集沉淀放超低溫冷凍干燥機中干燥2 h～3 h[22]，后加入超純水20 mL，溶解其中沉淀物并稀釋到一定的濃度，直至完全溶解，再吸取其中1 mL待測樣品液，使用苯酚-硫酸法測定其吸光度，再按照葡萄糖標(biāo)曲線計算待測樣品液的總糖含量。

1.2.6 不同靈芝菌株發(fā)酵液三萜含量檢測

精確移取 100 μg·mL-1齊墩果酸溶液 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 置于試管中[21]。將所有試管進行水浴加熱直至溶劑揮發(fā)干，然后加入1 mL高氯酸和0.4 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液，快速混勻，后于65℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，常溫冷卻后，用冰醋酸將溶液體積調(diào)節(jié)至5 mL，在550 nm波長處測量其吸光度。將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和濃度分別設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)曲線的垂直和水平坐標(biāo)，依據(jù)兩者的關(guān)系，建立回歸方程，重復(fù)上述方法測定靈芝中三萜的含量。

參照參考文獻[23]，使用香草醛-高氯酸顯色法，在試管中加入0.1 mL抗氧化及美白活性較優(yōu)培養(yǎng)基的靈芝發(fā)酵液，加入0.9 mL無水乙醇，在室溫條件下靜置1 h后，沸水浴使液體揮發(fā)，直至干燥，以干凈試管為空白對照組，在樣液及空白試管中加入0.4 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液以及1 mL的高氯酸迅速混合均勻，進行65℃、15 min的水浴加熱，測定其在550 nm波長處的吸光度，取3組平行樣吸光度的平均值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品的三萜含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同靈芝菌株發(fā)酵液抗氧化能力

不同菌株在不同培養(yǎng)條件下發(fā)酵液的DPPH自由基清除率統(tǒng)計見圖1。

圖1 4個靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中DPPH自由基的清除率結(jié)果統(tǒng)計Fig.1 Statistics of the scavenging rates of DPPH of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

由圖1結(jié)果表明，麥芽浸粉培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基）中4個靈芝菌株發(fā)酵液的DPPH清除率均顯著高于CYM培養(yǎng)基。隨著發(fā)酵時間的延長，4個靈芝發(fā)酵液的DPPH清除率均顯著增加，在5 d～6 d達到最大值。麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)比較6 d時比較4個靈芝菌株發(fā)酵液的DPPH自由基清除率發(fā)現(xiàn)，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，達到94.08%，菌株ACCC 51718發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最低，為88.64%。4個靈芝菌株液體深層發(fā)酵液對超氧陰離子清除率見圖2。

圖2 4個靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中超氧陰離子的清除率結(jié)果統(tǒng)計Fig.2 Statistics of the scavenging rates of superoxide anions of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

由圖2可知，在麥芽浸粉培養(yǎng)基中4個靈芝菌株發(fā)酵液對超氧陰離子清除率大部分優(yōu)于CYM培養(yǎng)基。隨著發(fā)酵時間的延長，4個靈芝發(fā)酵液的超氧陰離子清除率也均顯著增加，在5 d時達到最高，6 d后逐漸下降。在培養(yǎng)5 d時，在麥芽浸粉培養(yǎng)基中菌株CICC 14022液體深層發(fā)酵液的超氧陰離子清除率達25%，高于清除率最低的菌株ACCC 51718液體深層發(fā)酵液近3倍，菌株ACCC 51718發(fā)酵液的清除率最低，僅為9%；此時，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液的超氧陰離子清除率為13.6%。

2.2 不同靈芝菌株發(fā)酵液美白能力

不同菌株在不同培養(yǎng)條件下的靈芝發(fā)酵液美白能力檢測結(jié)果見圖3。

圖3 4個靈芝液體深層發(fā)酵液對酪氨酸酶活性的抑制率統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Statistics of the inhibition rates of tyrosinase activity of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

圖3結(jié)果表明，麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下4個靈芝菌株發(fā)酵液對酪氨酸酶活性的抑制率均高于CYM培養(yǎng)基。同時，不同發(fā)酵時間靈芝發(fā)酵液對酪氨酸酶活性的抑制率也有顯著差異，發(fā)酵前6 d，其抑制率逐漸升高，在發(fā)酵第6天時，麥芽浸粉培養(yǎng)基中液體深層發(fā)酵菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液對酪氨酸酶活性抑制率最高，達90.26%。菌株CICC 14022發(fā)酵液的抑制率最低，為87.4%，二者差異不顯著。

2.3 麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝發(fā)酵液多糖含量及三萜含量

由于試驗中麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝抗氧化活性及美白能力較高。因此，對靈芝麥芽浸粉發(fā)酵液進行檢測，其多糖及三萜含量測定結(jié)果見圖4～圖5。

圖4 4個靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中的多糖含量結(jié)果統(tǒng)計Fig.4 Statistics of the polysaccharide content of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

圖5 4個靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中三萜的含量結(jié)果統(tǒng)計Fig.5 Statistics of the triterpene content of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

由圖4可知，菌絲體多糖含量從第5天開始出現(xiàn)明顯增加趨勢，至第6天時靈芝菌株發(fā)酵液中多糖含量最高。4個靈芝菌株中，菌株CGMCC 5.1817和菌株CICC 14022發(fā)酵液中的多糖含量最高，均達3.4 mg·mL-1，菌株ACCC 51726發(fā)酵液中多糖含量最低，為2.6 mg·mL-1。在7 d時靈芝發(fā)酵液中多糖含量開始下降。

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長（3 d～5 d），三萜含量顯著增加，在第6天時達到最大值，第7天開始下降。在第6天時，靈芝菌株CGMCC 5.1817與菌株CICC 14022發(fā)酵液中三萜含量差異顯著，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液的三萜含量最高，達1 550 μg·mL-1，是菌株CICC 14022的3倍，其三萜含量最低，為 480 μg·mL-1。

3 討論

靈芝富含多種生物活性物質(zhì)，主要是三萜類化合物、多糖、類固醇、核苷酸、脂肪酸、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖肽等[24]。由于靈芝的結(jié)構(gòu)具有多樣性，其功能也不同，包括抗氧化作用、抗皰疹病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗癌等特性，只有特定品種的靈芝才有良好的抗氧化活性和美白活性[24]。市場上靈芝產(chǎn)品繁多，多利用的是靈芝子實體提取物，子實體價格高，使得靈芝類化妝品的原料成本過高。培養(yǎng)靈芝的傳統(tǒng)方法需要數(shù)月或1年，液體深層發(fā)酵液因不需要進一步提取，可以減少生產(chǎn)含有功能活性成分原料的時間和成本。通過探究利用液體深層發(fā)酵技術(shù)替代子實體提取來制備低成本靈芝化妝品原料的可行性，以期篩選抗氧化和美白活性較好的菌株。結(jié)果表明，采用麥芽浸粉培養(yǎng)基4個靈芝菌株發(fā)酵液對DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶活性的抑制率均高于CYM培養(yǎng)基。靈芝在進行液體深層發(fā)酵時培養(yǎng)基中的碳源、氮源等對其子實體的DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶活性的抑制率均有影響。靈芝以可溶性淀粉為可利用碳源，其足夠靈芝子實體后期生長需要且容易被吸收利用[25]。蛋白胨中含有糖類、維生素、氮源，是真菌培養(yǎng)基的主要原料。蛋白胨的添加量與子實體的生長在一定程度上呈正相關(guān)[24]。麥芽浸粉培養(yǎng)基中碳源可溶性淀粉含量、氮源中蛋白胨含量均高于CYM培養(yǎng)基。DPPH自由基、超氧陰離子的清除力測定結(jié)果表明，菌株CICC 14022的液體深層發(fā)酵液中超氧陰離子清除率比菌株CGMCC 5.1817高出10%，但其DPPH自由基清除率低于菌株CGMCC 5.1817，綜上，菌株CGMCC 5.1817與菌株CICC 14022相比抗氧化活性無顯著差異。

由于酪氨酸酶在黑色素合成過程中是必不可少的，其抑制劑在化妝品行業(yè)中的作用越來越重要[14]。酪氨酸酶抑制劑可作為一種強效美白劑，可改善皮膚問題[26]。由于靈芝是具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)的豐富來源，且大多數(shù)靈芝無較大的副作用，人們對從天然來源的酪氨酸酶抑制劑的興趣日漸增加，靈芝的乙醇提取物已顯示出抑制酪氨酸酶活性的作用[27]。然而，目前尚無靈芝液體深層發(fā)酵液抑制酪氨酸酶活性的研究報道。本研究結(jié)果顯著表明，在4個菌株中，菌株CGMCC 5.1817液體深層發(fā)酵液具有良好的美白活性，其酪氨酸酶抑制率高達90.26%。

目前的研究中，多糖和三萜是靈芝最常見的天然化合物，與靈芝的抗氧化活性有關(guān)。研究結(jié)果表明，不同菌株和不同發(fā)酵時間的靈芝液體深層發(fā)酵液，其多糖和三萜含量有區(qū)別。在發(fā)酵前期，靈芝菌絲體正處于生長階段，需要消耗發(fā)酵液中較多的營養(yǎng)成分，使發(fā)酵液中多糖和三萜含量增加不明顯[28]；在發(fā)酵中期靈芝生長旺盛，其自身所含的多糖和三萜含量顯著增加；在發(fā)酵后期，靈芝中的多糖和三萜已全部釋放，但隨著靈芝子實體生長需繼續(xù)消耗多糖和三萜，所以其多糖和三萜含量會逐漸降低[29]。菌株ACCC 51718和菌株ACCC 51726發(fā)酵液中三萜含量未有顯著差異，菌株CICC 14022液體深層發(fā)酵液中多糖含量為3.4 mg·mL-1，與菌株CGMCC 5.1817多糖含量近似，但其三萜含量相差3倍（480 μg·mL-1）。因此，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液中多糖、三萜的含量最高。

綜上所述，研究結(jié)果清楚地表明了靈芝的培養(yǎng)條件和菌株來源對抗氧化活性和美白活性均有影響。4個菌株中，菌株CGMCC 5.1817具有很強的清除自由基能力以及酪氨酸酶抑制活性，且多糖和三萜含量較高。因此其在抗衰及美白類化妝品市場有很大的發(fā)展空間。