李依檬,劉 熙,吳添舒*

零維碳基納米材料細胞毒性效應的研究進展

李依檬1,劉 熙2,吳添舒1*

(1.東南大學公共衛(wèi)生學院,環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室,江蘇 南京 210009；2.東南大學醫(yī)學院,江蘇 南京 210009)

介紹了碳基納米材料進入細胞的主要途徑,重點總結(jié)分析了幾種常見零維碳基納米材料導致細胞發(fā)生不同形式的死亡效應及其可能的毒作用機制,影響納米材料毒性的各種理化性質(zhì)也有所闡述.最后在本課題研究成果的基礎上對未來碳基納米材料的毒性研究前景進行了思考和展望,將為碳基納米材料設計優(yōu)化和廣泛應用提供有價值的參考.

碳基納米材料；文獻計量學；納米毒理學；細胞死亡方式

在過去的幾十年里,納米技術已經(jīng)成為一個快速發(fā)展的領域,產(chǎn)生了許多具有不同物理和化學性質(zhì)的納米材料,納米復合材料因其重量輕、強度高、導電性好而成為研究熱點,并且得到了廣泛的應用.碳基納米材料是一種具有單一物理化學性質(zhì)的新型納米材料,這些材料已經(jīng)在生物醫(yī)學應用中得到了廣泛的適應性應用,包括納米醫(yī)學、生物傳感器、生物芯片、生物電子學等領域[1].

由于碳基納米材料較小的體積和特殊的表面性質(zhì),它可以輕易地通過呼吸道、消化道、皮膚和注射等途徑進入人體,直接或經(jīng)由淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán),使其在生物體的各個系統(tǒng)之間遷移并引起全身性的生物效應.碳基納米材料進入人體的呼吸系統(tǒng)后,一般沉積在支氣管和肺泡部,不但可能經(jīng)肺泡上皮毛細血管或被巨噬細胞吞噬后進入血液循環(huán)系統(tǒng),而且可能直接穿透肺間質(zhì)時會與肺間質(zhì)細胞發(fā)生作用,引起炎癥等一系列疾病的發(fā)生.由于一些納米材料已經(jīng)廣泛應用于牙膏、膠囊、口香糖、藥品添加劑等日常用品中,消化道暴露成為人群暴露的另一個常見途徑.其中,小尺寸、高脂溶性及表面帶正電的納米顆粒相對更容易跨越胃腸道粘膜,進入粘膜下層組織,經(jīng)淋巴和血液循環(huán)轉(zhuǎn)運入全身器官并發(fā)揮損傷作用.皮膚作為機體對外界環(huán)境損害因素的第一道屏障,并不具有高度通透性,但碳基納米材料憑借其粒徑的減小及表面性質(zhì)的改變易被吸收.此外,近些年研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒對腫瘤細胞具有殺傷作用,因此將納米顆粒直接注入體內(nèi),并利用納米顆粒載帶活性成分運送到病變組織和細胞,進行靶向藥物運輸.該項納米醫(yī)藥技術雖然給腫瘤治療帶來了光明,但是隨之產(chǎn)生了納米材料的另一種暴露途徑,即注射暴露,也可能造成正常組織細胞的損傷[2].

大量納米材料應用到了人類生活生產(chǎn)的各個領域,它們在環(huán)境和人群中的暴露率將大幅度提升,而目前對于納米材料的毒性效應研究較少,缺乏全面透徹的認識.此外,由于部分納米材料在有關疾病,如腫瘤的診斷和治療有著顯著的優(yōu)勢,深入了解并規(guī)避其毒性能為醫(yī)療技術進步提供可能性.因此,全面了解納米材料的毒性行為,才能更好地應用納米材料并發(fā)展納米技術[3].由于生命的基本單位是細胞,納米材料的生物效應和毒性機制信息通常來源于細胞實驗,近年來,越來越多的研究者開始探索碳基納米材料的細胞毒性,以期為其的生物安全性應用提供保障.本文總結(jié)分析了現(xiàn)有碳基納米材料細胞毒性的研究現(xiàn)狀、未來發(fā)展動向、以及已有的研究成果,并對碳基納米材料的毒性研究前景進行了思考和展望.

1 碳基納米材料細胞毒性研究的出版趨勢

借助陳超美教授開發(fā)的Citespace V可視化文獻分析軟件進行文獻計量學分析[4].該軟件提供的突發(fā)關鍵詞探測技術通過統(tǒng)計評估關鍵詞隨時間推移而變化的出現(xiàn)次數(shù),將頻次在某段時間內(nèi)快速增加的關鍵詞探測出來,再將這些關鍵詞按時間順序排列,從而確定該領域的研究發(fā)展趨勢,為相關領域的研究指引方向.

以TS=( carbon nanomaterials AND cytotoxicity)作為檢索式,從Web of Science中檢索了過去九年期間(即2012～2020)的相關研究文獻,之后應用Excel 2019軟件和CiteSpace V軟件對數(shù)據(jù)進行了定性和定量的分析,并通過CiteSpace V軟件對初篩數(shù)據(jù)做進一步除重處理,共得到1097篇不重復文獻(截止2020.10月).獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析后顯示,隨著時間的推移,與碳基納米材料毒性相關出版物的數(shù)量呈逐年上升趨勢(趨勢線2=0.2849)(圖1),由此可見,碳基納米材料的細胞毒性研究正在穩(wěn)步發(fā)展.

在該領域相關的前五大出版國中,中國以286篇文獻排名第一,這表明中國在碳基納米材料的細胞毒性研究領域取得了重大進展(圖2).但是美國出版的文獻在被引用數(shù)量上仍舊多于中國,由此可知,美國學者在碳基納米材料細胞毒性方面研究成果的質(zhì)量更高,更能夠得到相關學者引用的關鍵詞地圖顯示的科學相關出版物直觀地表明了所有集群與索引詞標記提取出的參考.大型集群不僅包括毒性、表面功能化、細胞凋亡、細胞吸收等生物相關效應,也包括富勒烯、氧化石墨烯、納米金剛石等應用廣泛的碳基納米材料,這說明了碳基納米材料的的毒性評估及其潛在毒性機制的探索正在成為現(xiàn)下流行的研究熱點(圖3).

圖1 2012年至2020年出版物數(shù)量統(tǒng)計及趨勢圖

圖2 2012年至2020年關于碳基納米材料的細胞毒性研究的國家/地區(qū)網(wǎng)絡

圖3 2012年至2020年碳基納米材料毒性研究的引用關鍵詞網(wǎng)絡

此外,共引圖將從參考文獻中提取的索引項進行了標記(圖4).大類中不但包括了諸如體外毒性、自噬、共聚焦活細胞成像、暴露等生物學效應,也包括碳納米點、氧化石墨烯等明確的碳基納米材料名稱,這表明碳基納米材料正在成為納米毒理學領域研究的熱點對象,學者們對該材料的研究更加多元化,也更加深入.

圖4 利用碳基納米材料進行納米科學研究的參考文獻共引

突發(fā)關鍵詞指該領域突變或新興的研究趨勢,提供了研究前沿的合理預測.本文作者通過該項探測技術提取了前20個碳基納米材料細胞毒性前沿研究的關鍵詞,預測發(fā)現(xiàn)該領域今后主要研究方向?qū)⒓性趯μ蓟{米材料中的納米片、納米復合材料,石墨烯量子點等與巨噬細胞和肺細胞的相關毒性研究(圖5).除了對碳基納米材料進行毒理學研究外,也有和納米材料在癌癥等疾病中診斷和治療的交叉研究,推斷以基礎且深入的納米毒理學研究為基礎,未來在疾病的臨床治療上也會有不小的進展.

通過文獻計量學的研究,明確了對碳基納米材料進行細胞毒理學研究是目前納米材料和納米毒理學領域的研究熱點,在未來幾年將呈上升趨勢.碳基納米材料種類繁多,按其空間維度受納米尺度的約束程度可以分為三類:零維、一維和二維.其中零維納米材料(0-dimensional nanomaterials)是指在空間三維尺度方向均在納米尺度的物質(zhì),如納米顆粒、原子團簇和量子點等,一般由少量原子和分子組成.零維碳基納米材料有很多,常見者如碳黑納米粒子(CBNPs)、納米金剛石(ND)、富勒烯(C60)、氧化石墨烯(GO)、碳納米點(C-dots)以及石墨烯量子點(GQDs)等,由于其具有優(yōu)異的物化性能組合,如機械強度高、電導率和導熱率高、光學性能好等特點,它們在許多領域得到了廣泛應用,也增加了公眾和環(huán)境對碳基納米材料的潛在暴露,其生物安全性和毒性效應引起了人們的廣泛關注.目前部分零維碳基納米材料已經(jīng)進行了安全性測評,本文將已有的相關領域的毒理學數(shù)據(jù)進行了分析總結(jié),特別關注了如今細胞毒理學中的研究熱點——細胞死亡方式的探索,為后續(xù)該領域的研究提供了指導方向和數(shù)據(jù)參考.

圖5 使用碳基納米材料進行納米科學研究的出版物中引用突出最強的關鍵詞

2 碳基納米材料被細胞攝入的研究

細胞內(nèi)化過程在納米材料的生物醫(yī)學應用及其健康危害中起著關鍵作用.Reja等[5]的研究發(fā)現(xiàn)了碳基納米材料與幾種納米材料相似的進入細胞的途徑.由于碳基納米材料體積小,可通過微胞吞、網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞和小凹介導的內(nèi)吞途徑直接進入細胞.同時,碳基納米材料的細胞毒性不僅體現(xiàn)在正常細胞中,對癌細胞系也有損傷作用,包括不同來源的成纖維細胞、成骨細胞、巨噬細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞.而不同的碳基納米材料與細胞的相互作用也有所不同.

Georgakilas等[6]人的研究顯示石墨烯納米材料比表面積較高,因此該材料可以進行較為有效的吸附,也可能與分子及其功能性聚集物結(jié)合.在胞吞作用之前,石墨烯納米材料與細胞膜的直接接觸是產(chǎn)生功能性石墨烯納米材料(FGNs)細胞毒性的重要因素[7].由于FGNs分為單層和多層形態(tài),單層或低層的材料暴露于活細胞時,在其和細胞膜二者的相互接觸過程內(nèi),會對細胞膜造成直接有效的物理膜損傷[8].GO在尺寸相對較小的情況下可以進入細胞內(nèi),而尺寸較大的可以依附在細胞表面并將細胞包裹起來[6].

此外,一些經(jīng)典的碳納米材料還會由于本身理化特征的優(yōu)勢進一步影響與細胞的相互作用.李煒的研究表明水溶液中的C60是以團聚的形態(tài)呈現(xiàn),并且他們的表面形態(tài)特征、尺寸大小及其表面顆粒電荷都將影響與細胞的相互作用.C60在水溶液中呈非單一分子表現(xiàn),是以團聚(100～200mm)的形態(tài)呈現(xiàn)[9].同時,多個研究團隊已經(jīng)明確了碳納米管提供的關鍵優(yōu)勢之一是能夠有效跨越生物屏障,這將使其能夠用于治療活性分子的傳遞,經(jīng)KOSTAS KOSTARELOS的研究發(fā)現(xiàn),不同類型的功能化碳納米管(f-CNTs)具有被多種細胞吸收的能力,并能在細胞內(nèi)通過不同的細胞屏障流通[10].同時在實驗的支持下,王馨悅的研究團隊發(fā)現(xiàn)在多壁碳納米管的影響下,細胞表面高度及其表面糙度具有顯著的改變.

總而言之,碳基納米材料與細胞膜產(chǎn)生接觸后,由于材料與細胞膜有相互作用的,所以較為容易地實現(xiàn)入胞的過程.另外,由于細胞表面的不同帶電狀態(tài),很大程度上改變了相互作用之間的能量水平,則會產(chǎn)生特質(zhì)迥異的結(jié)構(gòu)[11].碳基納米材料在與細胞的相互作用過程中,大部分直接有效的特異性反應可與其表面的配體和細胞膜上的補體分子或受體之間結(jié)合,此作用產(chǎn)生了受體介導的內(nèi)吞反應[12].

3 零維碳基納米材料的細胞毒性研究

3.1 碳黑納米粒子(CBNPs)

CBNPs是顆粒物環(huán)境污染的重要組成部分,廣泛應用于橡膠、塑料、油墨和涂料中,但是CBNPs的大量生產(chǎn)導致職業(yè)暴露量急劇增加,其毒性備受關注[13].CBNPs能通過呼吸道進入肺部并在肺部積聚,而肺泡巨噬細胞位于肺泡腔和小氣道,它們對于清除有毒污染物和防御被入侵的微病原體至關重要,CBNPs通過誘導巨噬細胞的壞死導致肺部炎癥[14],還可以吸附Pb2+形成CBNPs-Pb2+復合物,通過粒子化改變其物理性質(zhì),協(xié)同誘導大鼠肺泡巨噬細胞凋亡并阻斷自噬通量[15].由此可見,CBNPs與很多呼吸系統(tǒng)疾病息息相關.

3.2 納米金剛石(ND)

NDs是一種新型納米碳材料,具有多種引人注目的力學、化學、光學和生物特性,使其通過生物分子的表面修飾或功能化在藥物載體方面發(fā)揮極其重要作用[16].NDs具有將生物片段導入單個細胞或靶向細胞的潛力,成群的NDs圍繞在藥物周圍,以確保藥物與健康細胞分離,直到藥物到達靶部位的癌細胞,并在癌細胞中釋放出來,且NDs的大小使腎臟能夠在不阻塞其他血管的情況下輕松將其排出體外,因此被廣泛應用于癌癥治療[17].例如表面功能化非生物毒性爆震納米金剛石(DND)被提出與全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合用于增強ATRA藥物對急性早幼粒細胞白血病(APL)典型靶癌細胞HL-60的療效[18],含阿霉素的聚甘油功能化納米金剛石可通過激活多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)細胞自噬用于治療癌癥[19].

此外,在眼部給藥領域,NDs已被發(fā)現(xiàn)在青光眼等疾病的治療中有重要的應用[20].NDs也是局部保護皮膚免受曬傷的極佳候選藥物,它們不表現(xiàn)出光催化活性,而光催化活性是產(chǎn)生活性氧(ROS)的主要因素,從而導致皮膚損傷;它們表現(xiàn)出散射特性,從而防止紫外線B引起的皮膚損傷[21].

3.3 富勒烯(C60)

C60是碳的第三種同素異形體,其中C60是最常見、最小的富勒烯.富勒烯有三種形式包括球體、橢球體和小管,分子大小從30到3000個碳原子不等,其具有耐高溫、耐壓和耐輻射的特性[22].據(jù)報道, MTT法觀察到C60對肺泡巨噬細胞沒有細胞毒性作用[23],對人巨噬細胞的細胞毒性也非常低,不作為生物誘導劑引發(fā)炎癥反應[24].但是,C60可能具有強大的抗癌活性,水溶性羥化富勒烯C60(OH)24和Nano- C60均被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞的自噬密切相關[25-26],可見探索富勒烯在低濃度和非細胞毒性濃度下誘導自噬的能力是否可以用來改善癌癥化療將是非常值得的.

3.4 石墨烯量子點(GQDs)

GQDs是一種新型納米石墨烯,由幾層石墨烯碎片組成,由于其獨特的可調(diào)諧光致發(fā)光性能、物理化學性能、高光穩(wěn)定性、良好的生物相容性和體積小,可作為生物相容性成像探針用于同時示蹤和給藥[27].利用GQDs,可以克服低溶解度、快速排泄、低生物相容性和低靶向性等給藥挑戰(zhàn)[28],因此可以用于治療癌癥.例如GQDs在藍光照射下產(chǎn)生ROS,并通過氧化應激誘導U251人膠質(zhì)瘤細胞凋亡和自噬[29].在GQDs表面摻入伊馬替尼(一種專為抑制酪氨酸激酶而設計的分子),可通過誘導細胞凋亡有效內(nèi)化并殺傷癌細胞,特別適用于白血病的治療[30].體外研究表明,由于GQDs超小體積與高氧含量的特點,其細胞毒性極低.同時,體內(nèi)生物分布實驗顯示,GQDs在小鼠主要器官中無物質(zhì)積累,腎臟可以將其快速清除[31],但也有研究證實了GQDs可以通過p38MAPK和NF-kB信號通路誘導人巨噬細胞的炎癥反應、凋亡和自噬,其大小和表面面積對免疫系統(tǒng)存在影響[32].

3.5 碳納米點(C-dots)

C-dots作為一種新興的碳基納米材料,是一種具有非晶或晶芯結(jié)構(gòu)的納米顆粒,其制備工藝簡單,具有發(fā)光性好、細胞毒性小、生物相容性好、發(fā)射性能可調(diào)等優(yōu)點[33].許多實驗組對C-dots的毒性進行了測試和研究,由于它主要由碳、氫、氧等無毒元素組成,因此具有良好的生物相容性,對活細胞和植物生長幾乎沒有任何毒性作用[34],被廣泛用于生物成像、靶向藥物給藥納米生物偶聯(lián)物、細胞分化平臺以及組織工程.

3.6 氧化石墨烯(GO)

GO是石墨烯最著名的衍生物,它是一種薄的碳納米結(jié)構(gòu),在基面和邊緣都有各種極性含氧官能團,如羥基(OH)、羰基(C=O)羧基(C-O-OH)和烷氧基(C-O-C).這些含氧基團的存在導致GO在水和其他有機溶劑中的分散性和溶解度,并能顯著改善其機械、電子和電化學性能[35].關于GO的細胞毒性效應或機制的研究主要集中在納米材料進入細胞模型,但覆蓋細胞功能的研究相對較少.在某些情況下, GO對細胞活力無顯著影響,但它可能在細胞信號轉(zhuǎn)導和網(wǎng)絡功能上發(fā)揮著重大作用.

4 零維碳基納米材料引起不同形式的細胞死亡及其毒作用機制

4.1 凋亡

細胞凋亡是一種程序性、非炎癥性的反應,它在發(fā)生機制方面的顯著特點是獨特的DNA裂解以及激活細胞凋亡的關鍵執(zhí)行分子——半胱天冬酶3和9(caspases 3and 9).細胞凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)包括膜起泡、細胞萎縮、染色質(zhì)凝聚、核小體間DNA碎裂以及凋亡小體的形成.特別地,一種從內(nèi)層到外壁的漿膜磷脂酰絲氨酸觸發(fā)器是巨噬細胞檢測到可吞噬的凋亡細胞的典型信號[36].細胞凋亡存在多種特征,比如,HL-60細胞暴露于富勒烯衍生物后,可因為活性氧的生成而出現(xiàn)DNA碎裂和染色質(zhì)凝結(jié)等[37].即使對新型碳基納米材料GQDs,細胞接觸后也出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學和生物化學特征[38].Qin等研究者進一步發(fā)現(xiàn)GQDs是通過線粒體相關途徑誘導細胞凋亡,涉及半胱天冬酶家族的激活,表現(xiàn)為Bax、Bad、caspase 9和caspase 3表達的增強[32].

此外,碳基納米材料組裝的生物分子作為一種高效的藥物傳遞系統(tǒng),促進了各種癌細胞的凋亡作用.Fan的研究表明,爆轟納米金剛石(DND)可以通過形成DND–ATRA復合物傳遞藥物,并有效促進HL-60細胞的凋亡[39].然而,在某些情況下,一些碳基納米材料卻對細胞凋亡具有保護作用.Lao等人報道,C60-(C(COOH)2)2納米粒子具有選擇性進入被氧化損傷的腦內(nèi)皮細胞而非正常內(nèi)皮細胞的特殊能力,能夠通過調(diào)節(jié)幾個與JNK通路相關的信號物質(zhì)防止細胞凋亡,包括減少JNK磷酸化、激活蛋白1(AP-1)和半胱天冬酶3(caspase 3)、抑制多聚ADP聚合酶(PARP)裂解和釋放線粒體細胞色素C[40].

4.2 自噬

自噬主要是細胞內(nèi)的一個適應性過程,具有細胞保護功能,使其能在營養(yǎng)缺乏和ATP缺乏的條件下生存.簡單地說,大自噬是最典型的自噬途徑,也可能是主要的自噬途徑.在這個過程中,通過吞噬體的作用,細胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)被隔離,吞噬體膨脹并成熟,形成稱為自噬體的雙膜小泡.自噬體可與核內(nèi)體融合,并最終與溶酶體融合,形成自噬溶酶體.在微自噬中,細胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)被溶酶體或者液泡膜的突起和分離直接吞噬[36].

許多研究都觀察到零維碳基納米材料誘導了細胞自噬,并對其毒作用機制進行了研究.一項研究表明,含阿霉素的聚甘油功能化納米金剛石(Nano-DOX)暴露會激活多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自噬.由于DOX是一種公認的凋亡誘導劑,DOX處理后的GC呈現(xiàn)ΔΨm消退、細胞表面膜聯(lián)蛋白V和半胱氨酸蛋白酶3活性明顯上升.相比之下, Nano-DOX處理的GC凋亡標志只發(fā)生輕微改變,但Beclin-1和LC3-II等自噬標記上調(diào)明顯且出現(xiàn)許多自噬小體[41].GQDs暴露也被發(fā)現(xiàn)可以導致一系列自噬的形態(tài)和生化特征,包括自噬小泡的形成、LC3-I/LC3-II的轉(zhuǎn)換、beclin-1表達的增加和自噬靶點p62的降解[32].

此外,Yamawaki等[25]報道了水溶性羥化富勒烯C60(OH)24可引起血管內(nèi)皮細胞多聚泛素化蛋白的積累和自噬體的形成,導致自噬細胞死亡.Harhaji等[26]隨后報道,Nano-C60在膠質(zhì)瘤細胞系中誘導酸化的胞漿內(nèi)小泡,提示自噬,這有助于Nano-C60的細胞靜態(tài)作用.由此可見,C60(OH)24和Nano-C60在相對低的濃度下都能引起一定程度的自噬,不會導致顯著的細胞死亡.鑒于富勒烯特別是Nano-C60在高濃度的暴露條件下對正常細胞具有相對較大的毒性,探索富勒烯在低濃度和非細胞毒性濃度下誘導自噬的能力是否可以用來改善癌癥化療將是非常值得的[42].此外,橄欖油提取的C60暴露12周,可使得腦內(nèi)Caspase-3、Beclin-1等氧化應激指標上調(diào),Bcl-2下調(diào),改善了LC3-I/II比率,阻止了自噬通量的極大增加,改善氧化還原失調(diào)、高血糖誘導的細胞凋亡紊亂,對高糖應激海馬細胞具有細胞保護作用;同時,C60通過BCL-2/Beclin-1的互反表達調(diào)控自噬,可防止海馬功能紊亂[43].

4.3 壞死

細胞壞死被定義為一種意外的、促炎的細胞死亡形式,各種病理條件如外傷、毒素暴露、缺血、病毒或細菌感染、神經(jīng)退行性疾病等均可導致細胞壞死.細胞在壞死早期會表現(xiàn)出一系列特異性的形態(tài)學改變,包括水腫、羽狀變性、渾濁腫脹和空泡變性.在此之后,不可逆轉(zhuǎn)的細胞壞死與線粒體內(nèi)膜和外膜之間的關鍵分離有關,氧化磷酸化能力也發(fā)生不可逆性損失.最后,在壞死晚期,細胞質(zhì)中失去內(nèi)容并呈現(xiàn)均勻嗜酸性外觀,細胞質(zhì)細胞器膜不規(guī)則現(xiàn)象,線粒體腫脹,基質(zhì)密度增加,液泡形成和磷酸鈣沉積.在細胞核層面,可以發(fā)現(xiàn)有染色質(zhì)凝結(jié)、核分裂和色質(zhì)破壞[44].

有研究表明C57BL/6小鼠巨噬細胞暴露于CBNPs,通過溶酶體破裂、組織蛋白酶B釋放活性氧生成以及減少細胞內(nèi)TP水平,在體內(nèi)和體外誘導的急性壞死細胞中,mtDNA從壞死細胞中泄漏激活了中性粒細胞而導致肺部炎癥[14].水溶性納米微粒羥基化富勒烯,即富勒醇,對人晶狀體上皮細胞、人視網(wǎng)膜色素上皮細胞具有細胞毒性作用,可通過激活細胞的caspase-3、增強蛋白酶活性導致其發(fā)生壞死[45].多羥基化C60主要具有抗氧化和細胞保護作用,僅具有溫和的不依賴于ROS的促凋亡活性,與多羥基化C60不同,純晶體C60似乎具有較強的促氧化能力,可以導致細胞快速壞死[46].

4.4 焦亡

焦亡是一種與炎性小體激活、caspase-1裂解和下游IL-1釋放相關的細胞死亡類型.研究發(fā)現(xiàn),焦亡具有壞死和凋亡兩者的特征,它既類似凋亡是一種程序性細胞死亡的形式,又類似壞死表現(xiàn)為膜完整性的喪失[47].焦亡的發(fā)生機制具有幾個特點.首先,caspase-1的酶介導細胞死亡的過程在細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用;其次,焦亡的特點是漿膜快速破裂,細胞內(nèi)促炎物質(zhì)的釋放,導致細胞體積增大;第三,染色體DNA的裂解是一個致命的事件,它是由一種未被識別的caspase-1激活的核酸酶在焦亡作用中產(chǎn)生的;最后,肌動蛋白細胞骨架的破壞也在細胞焦亡中被觀察到,但這種破壞的機制尚不清楚[47].

研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞暴露于CBNPs后細胞內(nèi)的NLRP3炎性小體激活,以激活半胱天冬酶-1和IL-1釋放,通過半胱天冬酶-1抑制劑和焦亡抑制劑對CBNPs誘導的細胞死亡的抑制作用,證實了暴露的細胞凋亡為焦亡[48].

4.5 鐵死亡

鐵死亡是一種由鐵依賴的脂過氧化積累導致的新非凋亡程序性細胞死亡的形式,伴有谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的降低[49].鐵死亡作為一種被研究者發(fā)現(xiàn)不久的一種新型死亡方式,形態(tài)學特點還不是很明確,目前的研究提出的改變包括細胞體積收縮、線粒體膜密度增加等.鐵死亡的誘導物可分為兩類小分子物質(zhì),第一類為系統(tǒng)Xc-抑制劑,第二類為GPx4抑制劑.此外,一些藥物,如索拉非尼、青蒿素及其衍生物,可導致鐵死亡[50].

研究發(fā)現(xiàn),氮摻雜石墨烯量子點(N-GQDs)通過誘導線粒體氧化應激引起小膠質(zhì)細胞鐵蛋白增多,小膠質(zhì)BV2細胞出現(xiàn)胞內(nèi)鐵超載、GSH缺失、ROS生成過多和脂質(zhì)過氧化等鐵死亡特征;相同暴露方式下氨基功能化的石墨烯量子點(A-GQDs)誘導的鐵蛋白作用較N-GQDs溫和,提示氨基功能化對GQDs引起的鐵死亡有輕微的保護作用[51-52].

4.6 壞死性凋亡

壞死性凋亡是一種不依賴半胱氨酸蛋白酶細胞死亡途徑,它是由細胞外或細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的擾動引起的,主要依賴于MLKL、RIPK3和RIPK1[53].某些碳基納米材料也可以引起細胞發(fā)生壞死性凋亡,它是許多人類病理的一部分,包括病毒感染和神經(jīng)元興奮性毒性,可以導致亨廷頓病、帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[36].

表1 不同結(jié)構(gòu)的零維碳基納米材料誘導細胞死亡的體外研究

表2 不同結(jié)構(gòu)的零維碳基納米材料誘導細胞死亡的體內(nèi)研究

5 碳基納米材料誘導的細胞死亡間關系

雖然大多數(shù)生物分子只控制一種細胞死亡途徑,但是最近的證據(jù)表明有特定生物分子參與兩種或兩種以上的細胞死亡途徑[56],納米材料導致的細胞死亡效應間也存在這多種聯(lián)系(圖6).如果外部刺激導致細胞內(nèi)能量水平的降低不能激活自噬途徑,細胞就會激活壞死來控制細胞[57].此外,有研究證實了幾種重要的凋亡調(diào)控蛋白,如Bcl-2家族成員、caspase-8和FADD樣凋亡蛋白,同樣能夠控制自噬[58],而自噬通路中ATG5、Beclin-1和ATG4D的激活也會對細胞凋亡產(chǎn)生影響[59].在心臟病發(fā)作等病理條件下,細胞凋亡作為細胞中第一個發(fā)現(xiàn),也是最重要的細胞死亡途徑,并無特異性作用,壞死過程作為備用途徑,清除了受損細胞[60].在caspase-8未表達的細胞中,TNFR1與FAS、TNFR2、TRAILR1和TRAILR2等受體除了刺激細胞凋亡外,還可通過RIPK1激活的ripk3觸發(fā)細胞的壞死過程[61].

雖然自噬和壞死之間的相互作用復雜,但這兩種死亡途徑間具有共同的介質(zhì).經(jīng)典細胞凋亡抑制劑zVAD-FMK可以通過抑制caspases蛋白活性阻斷細胞發(fā)生凋亡,同時也可以通過抑制溶酶體組織蛋白酶阻斷自噬的發(fā)生[62],或者通過限制激酶RIPK1的活性來導致細胞的壞死[63].乙?；笍秃衔?NAD+-依賴的蛋白去乙酰化酶)除了通過活化ATG5、ATG7和ATG8誘發(fā)自噬外,還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞中的RIPK3活性,導致壞死[64].此外,在另一項試驗中,Basit顯示Bcl-2抑制劑obatoclax可以觸發(fā)自噬,進而激活RIPK1介導細胞壞死[65].

目前大量的體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn),碳基納米材料主要通過氧化應激、DNA損傷和炎癥誘導誘發(fā)細胞死亡[55].C60可以通過誘導HL-60細胞中活性氧的產(chǎn)生,導致DNA碎裂和染色質(zhì)凝結(jié),從而誘發(fā)凋亡[37]. CBNPs作用于C57BL/6小鼠巨噬細胞,通過溶酶體破裂、組織蛋白酶B釋放活性氧生成以及減少細胞內(nèi)TP水平,在體內(nèi)和體外誘導急性細胞壞死, mtDNA從壞死細胞中泄漏激活了中性粒細胞而導致肺部炎癥[14].

在研究碳基納米材料對正常細胞產(chǎn)生的毒性時,科學家們開始日益重視利用它們的細胞毒性來治療腫瘤.例如,在GQDs表面摻入伊馬替尼,可通過誘導細胞凋亡來殺傷癌細胞,特別適用于白血病的治療[66].含阿霉素的聚甘油功能化ND可通過激活GBM細胞自噬用于治療癌癥[19].C60(OH)24和Nano-C60在低濃度或非細胞毒性濃度下可以增強細胞的自噬能力來改善癌癥化療[42].

圖6 納米材料導致多種細胞死亡方式的分子作用機制和相互聯(lián)系

6 零維碳基納米材料的理化表征對細胞毒性的影響

碳基納米材料由于其成本效益高、毒性低、環(huán)保、熒光、發(fā)光性好、易于合成和表面鈍化功能化等特點,應用越來越廣泛,受到研究者的廣泛關注[67],但是其可能導致的毒性效應也不容忽視.在毒理學研究領域,碳基納米材料的暴露劑量肯定與其毒性效應密切相關.以GODs為例,低濃度劑量時GO不存在明顯細胞毒性,但當濃度>250μg/mL時,50nm的GQDs對PC12細胞有著較為明顯的細胞毒性,且細胞活力顯著降低[68].研究者發(fā)現(xiàn),碳基納米材料的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)同樣可以影響其誘導的細胞死亡模式,但是其毒作用機制較為復雜.在大多數(shù)情況下,碳基納米材料的細胞毒性可以由其晶體結(jié)構(gòu)決定,其他的理化特性,包括形狀、大小、表面反應、化學成分、面外電荷、過渡金屬的存在、納米拓撲結(jié)構(gòu)和表面粗糙度等都不同程度地決定了其細胞毒性的大小.

6.1 尺寸

碳基納米材料需要通過許多不同的方法進行制備、轉(zhuǎn)移或改性,以獲得獨特的性能.尺寸是描述每個階段的納米材料的重要特征性指標之一,但與此同時,由于小尺寸和其所需的精度可以極大地影響碳基納米材料的屬性[69].越來越多的研究表明,碳基納米材料的毒性和顆粒大小成反比.炭黑納米粒子(CBNPs)是零維碳基納米材料,以不同方式大量生產(chǎn),當通過吸入暴露于肺部時,水溶性差的炭黑對健康構(gòu)成威脅.不溶性顆粒的核心部分產(chǎn)生活性氧,對實驗動物產(chǎn)生毒性[70].在封閉的反應室中,不動的炭黑聚集體基本上是100～1000nm大小范圍內(nèi)的細粉,在制造過程的最后步驟中,由于范德華力,形成更大的聚集體[71].

研究證實,尺寸小于100nm的納米顆?？梢赃M入細胞,<35nm的顆粒能夠跨越血腦屏障,<40nm的可以進入細胞核.當其直徑<40nm時,毒性與尺寸呈正相關,即尺寸越小毒性越小;尺寸在100～500nm范圍內(nèi)時,毒性與大小呈負相關[72-73].

6.2 形貌與結(jié)構(gòu)

隨著納米顆粒成像技術的發(fā)展,其形狀與生物效應間的關系也受到越來越多的關注.形狀各異的納米顆粒與細胞膜的相互作用會產(chǎn)生些許差異,細胞膜上分子及細胞功能之間的內(nèi)在運動都會對其附著的顆粒形狀變化有不同程度的影響,由此導致細胞內(nèi)吞作用的變化[74].C-dots由于其親水性和細胞通透性,已經(jīng)在很多應用領域取代了傳統(tǒng)的金屬量子點,包括光電、光催化和藥物靶向[75].C60具有獨特的籠狀結(jié)構(gòu),其特殊的物理化學性質(zhì)可能與獨特的分子印跡有關[76].根據(jù)結(jié)構(gòu)相異的富勒烯類化合物,從而體現(xiàn)出不同的細胞毒性,這表明了富勒烯的細胞毒性和它的化學結(jié)構(gòu)具有密切相關性,富勒烯母體所連接的支鏈類型和數(shù)目會對該材料在體內(nèi)的細胞毒性造成影響[77].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),毒性最高的是富勒烯母體,而隨著側(cè)鏈類型和數(shù)目的變化,細胞毒性呈明顯下降趨勢[78].

納米金剛石[79]是碳基晶體納米顆粒,在納米尺度上繼承了金剛石結(jié)構(gòu),具有優(yōu)異的性能,如光學透明度、硬度和化學惰性[80].納米金剛石的SP3四面體結(jié)構(gòu)在1332cm-1處呈現(xiàn)拉曼信號,并且由于點缺陷而能夠發(fā)熒光[81].然而,非熒光納米金剛石顯示出強烈的相干反斯托克斯拉曼散射效應.NDs細胞攝取的定量分析有望應用于生物標記和生物成像.有研究表明,納米金剛石的氧化形式會破壞胚胎干細胞中的脫氧核糖核酸[82].

6.3 分散性

在不同濃度(200、400、600和800g/mL)下,有學者研究了直徑為(6.5±2) nm的PEI包覆的CQDs基納米雜化物對非洲綠猴腎上皮細胞的細胞毒作用.MTT分析顯示,納米雜化物在濃度為600g/mL時殺死了39%的細胞,盡管在較低濃度下沒有明顯的毒性跡象[83].對原始熒光碳量子點(～7nm)的細胞毒性進行了評估顯示,量子點優(yōu)先位于細胞表面,其暴露誘導氧化應激和降低細胞活力.作為細胞毒性最強的細胞,在濃度為100g/mL時,帶正電荷的量子點在G0/G1期引發(fā)細胞周期的顯著改變[84].有學者研究了羥基修飾的GQDs對人肺癌細胞株H1299和A549的不良作用.水動力直徑為(10.3±1.9) nm的羥基量子點在濃度為50克/毫升時,顯著降低了細胞活力和細胞內(nèi)活性氧的生成.細胞信號通路分析顯示羥基化的GQDs誘導兩種類型細胞的G0/G1停滯、細胞衰老和抑制Rb磷酸化[85].經(jīng)證實,長時間孵育后,GQDs對人乳腺癌(MCF-7)和人胃癌(MGC-803)細胞的細胞毒性較低.在小窩介導的胞吞作用后,納米顆粒顯著滲透到細胞的細胞質(zhì)和細胞核中,但它們不影響細胞形態(tài)[86].

6.4 表面修飾

石墨烯的二維結(jié)構(gòu)和化學功能賦予了其吸附各種化合物的能力,使其成為一種吸引表面增強拉曼光譜的納米材料.Jablonska經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),石墨烯是一種有效的熒光猝滅劑,可以提高拉曼光譜的質(zhì)量,并通過化學機制提高拉曼光譜增強因子[87].相反,還原GO的化學靈活性使其能夠在拉曼光譜活性載體上對分子或細胞進行可調(diào)性吸附,被應用于細胞的拉曼成像[88].當石墨晶體轉(zhuǎn)化為納米粒子時,圍繞石墨粒子的邊緣就出現(xiàn)了.外圍區(qū)域周圍開放邊緣的存在導致了納米石墨化合物的獨特性能,不同于它們的封閉表面同類,如C60和CNTs[89].

碳量子點通常是直徑小于10nm的準球形納米粒子,由碳、氧、氫、氮和其他元素組成.由于其親水性和細胞滲透性,碳量子點在許多應用中已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的金屬基量子點,包括光伏、光催化和藥物靶向[90].氧化的碳量子點可能含有5%～50%的氧,這取決于合成程序.碳量子點通常在紫外-可見光譜中呈現(xiàn)兩個光學吸收帶[91].當碳納米點被表示為2～10nm大小的π共軛單片時,它們被稱為石墨烯量子點[92].研究表明,石墨烯量子點具有磁性、電子和光學特性.

7 本團隊相關研究成果

近年來,隨著碳基納米材料應用研究的廣泛開展,本團隊同樣意識到其生物安全性評價的重要性.本課題組對納米材料暴露導致的多種細胞死亡方式早有研究[93-95],近期就零維碳基納米材料中的GQDs進行了深入的生物安全性評價和毒效應機制研究.雖然GQDs的成分沒有任何毒性,但是其與單純的碳元素有所不同,一定劑量和一定時間的暴露依然導致了生物體的負面生物效應,尤其是其對細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)具有較大的影響,最終可能會導致較為嚴重的毒性后果,包括細胞死亡[96-97].這些研究成果與研究者已經(jīng)歸納總結(jié)的納米材料與細胞相互作用后誘導產(chǎn)生細胞毒性的作用機制一致[98]:納米材料與DNA發(fā)生作用,破壞DNA片段結(jié)構(gòu),抑制細胞周期的分裂和蛋白質(zhì)的合成.

基于已有的納米材料導致細胞死亡效應的研究基礎,本課題組重點探討了GQDs導致的一種新型細胞死亡方式——鐵死亡及其作用機制.鐵死亡是2012年學者Dixon首次報道并命名的一種鐵依賴性并伴隨脂質(zhì)過氧化反應的細胞非凋亡性程序性壞死,誘導腫瘤細胞鐵死亡是目前癌癥治療領域一個新興熱點[100].我們的研究結(jié)果顯示不同化學修飾的GQDs可以誘發(fā)神經(jīng)細胞的鐵死亡效應,不但強調(diào)了對所謂低毒組分的新型納米材料進行生物安全性評價的重要性,而且也為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療提供了新的研究方向[99].

8 結(jié)語

目前大部分針對零維碳基納米材料的細胞毒性研究仍然聚焦在凋亡、自噬和壞死.研究GQDs導致的鐵死亡效應以及背后的分子調(diào)控機制,不但可以為其在腫瘤治療方面的應用提供一定數(shù)據(jù),也為GQDs的生物安全性評價提供了新的研究思路.

建議毒理學家在未來可以通過以下幾個方面改進納米材料細胞毒性研究:使用多種細胞來反映納米材料對正常細胞和癌細胞的毒性效應,分析其相似和不同,將納米毒理學研究真正應用于實際的醫(yī)學應用;模擬病理生理條件,更好地預測納米材料在不同體內(nèi)條件下的毒性;加入生物分子,反映特定生物微環(huán)境下納米材料與生物分子間的相互作用;重點關注納米材料的理化性質(zhì)對毒性效應的影響,優(yōu)化納米材料的制備,從源頭降低普通納米材料的毒性,研制具有特殊作用的納米材料.

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Research advances on the cytotoxic effects of zero-dimensional carbon-based nanomaterials.

LI Yi-meng1, LIU Xi2, WU Tian-shu1*

(1.The Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China；2.School of Medicine, Southeast University, Nanjing 210009, China)., 2021,41(9)：

The main pathways of carbon-based nanomaterials entering into cells were introduced in this paper, and the analysis of different forms of cell death caused by several commonly used zero-dimensional carbon-based nanomaterials and their potential toxic mechanisms was focused on. The physical and chemical factors affecting the cell death induced by carbon-based nanomaterials were elaborated as well. Finally, the prospects of toxicity study of carbon-based nanomaterials based on our findings were provided in this review, which benefits the design optimization and wider application of carbon-based nanomaterials in the future.

carbon-based nanomaterials；bibliometrics；nanotoxicology；cell death

X503.1,X171.5

A

1000-6923(2021)09-4402-13

李依檬(1998-),女,四川成都人,本科生,主要從事勞動與衛(wèi)生保障專業(yè)研究.

2021-01-28

國家自然科學基金(82103884);江蘇省基礎研究計劃(BK20180371);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2242020K40192);東南大學至善青年學者項目(2242020R40140)

* 責任作者, 講師, ninatswu@seu.edu.cn, ninatswu@126.com