王 慶,李 瑩,汪文博,楊宇峰

廣東省蛭態(tài)輪蟲物種多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育研究

王 慶,李 瑩,汪文博,楊宇峰*

(暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,廣東 廣州 510632)

為了解廣東省蛭態(tài)輪蟲物種多樣性,采集廣東省不同水陸生境樣品98份,記錄蛭態(tài)輪蟲3目4科12屬66種(含亞種).陸生環(huán)境中鑒定出蛭態(tài)輪蟲56種,其中苔蘚生境42種?落葉生境40種?地衣生境12種,水生生境蛭態(tài)輪蟲15種,陸生生境的蛭態(tài)輪蟲種類明顯多于水生生境蛭態(tài)輪蟲.為驗證形態(tài)鑒定的準(zhǔn)確性,獲取蛭態(tài)輪蟲COⅠ基因序列4屬16種37條,種間遺傳距離8.59%～23.17%,其中楔足盤網(wǎng)輪蟲()和迅捷旋輪蟲()的COⅠ基因序列為全球首次報道.COI基因序列中腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)的總含量(71.2%)遠(yuǎn)大于鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C) (28.8%)的含量.系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)物種鑒定結(jié)果一致;同屬形態(tài)相近的物種,具有較高的同源性.研究結(jié)果表明,形態(tài)學(xué)鑒定與DNA 條形碼技術(shù)相結(jié)合,有助于提高蛭態(tài)輪蟲種類鑒定的準(zhǔn)確性和探究蛭態(tài)輪蟲各屬的發(fā)育地位,促進蛭態(tài)輪蟲物種多樣性和生態(tài)學(xué)研究.

蛭態(tài)輪蟲；生物多樣性；DNA條形碼；COI基因；生物地理

蛭態(tài)輪蟲是水生無脊椎微型動物,屬于輪蟲動物門真輪綱蛭態(tài)亞綱,是目前為止有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞發(fā)生學(xué)和基因?qū)W證據(jù)的最大、最古老以及最多樣化的無性進化多細(xì)胞動物類群[1-2].蛭態(tài)輪蟲具有專性孤雌生殖和隱生兩大特性,是研究分類學(xué)、生態(tài)學(xué)以及遺傳進化的理想模型[3-6].蛭態(tài)輪蟲廣泛分布于淡水水體中,并棲息于苔蘚、地衣、落葉等半水生環(huán)境[7].蛭態(tài)輪蟲鑒定較為困難,只有在活體時才能觀察到關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征,并極易收縮.由于蛭態(tài)輪蟲物種鑒定需要活體狀態(tài),不同于常見水體輪蟲,一些研究只將蛭態(tài)輪蟲統(tǒng)一作為一大類別進行分類和討論,導(dǎo)致蛭態(tài)輪蟲物種多樣性和生態(tài)學(xué)研究進展較慢.隨著DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定方面的發(fā)展,該技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合,使得蛭態(tài)輪蟲種類鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠,并可探究蛭態(tài)輪蟲物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.系統(tǒng)學(xué)分類分析還可幫助了解蛭態(tài)輪蟲的進化歷史過程,推斷物種之間的親緣關(guān)系.

Hebert等首次提出了DNA條形碼概念,并表明線粒體COI基因具有變異速度適中、可用通用引物擴增的特點[8].因此利用線粒體COI基因作為分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于研究物種進化.目前在輪蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)地理學(xué)研究中采用的分子遺傳標(biāo)記主要是線粒體COI 基因序列和少量的核 DNA標(biāo)記,如 ITS 和微衛(wèi)星[9].由于輪蟲個體小、基因組DNA含量少以及微衛(wèi)星引物篩選難度大等原因,核DNA標(biāo)記目前在輪蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)地理學(xué)研究中應(yīng)用并不普遍[10].隨著基因標(biāo)記技術(shù)的使用,蛭態(tài)輪蟲潛在的物種多樣性和分子隱種逐漸被發(fā)掘[11-12].

廣東省位于南嶺以南,南海之濱,是我國陸地最南部的省份,地域遼闊,地形復(fù)雜,生態(tài)類型多樣.全境位于北緯20°13￠～25°31￠和東經(jīng)109°39￠～117°19￠之間,北回歸線橫貫廣東.因此,廣東省從北向南分別為中亞熱帶、南亞熱帶和熱帶氣候.廣東省為東亞季風(fēng)區(qū),年平均氣溫高,且降水充沛,非常適合常綠植物的生長.對于廣東省河流、城市湖泊和大型水庫等典型淡水棲息環(huán)境,單巢綱輪蟲物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)研究都較為全面[13-15],蛭態(tài)輪蟲研究較少,僅以蛭態(tài)輪蟲提及,鮮有種類多樣性記載.本研究基于形態(tài)學(xué)鑒定和DNA條形碼技術(shù),對廣東省蛭態(tài)輪蟲物種多樣性進行了較為全面的調(diào)查,研究結(jié)果對于豐富我國的蛭態(tài)輪蟲物種多樣性和廣東省生物多樣性具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 采樣點設(shè)置與樣品信息

自2017年9月至2019年12月,選擇廣東省城市公園、山脈、島嶼等不同水陸區(qū)域站點98個,包括白云山、帽峰山、火爐山、珠海萬山群島、汕頭南澳島等區(qū)域,采集水體、苔蘚、地衣和落葉等不同生境樣品,其中水庫、湖泊、河流、溪流、水坑、咸淡水池塘等不同類型水體樣品13個,土壤、石壁和樹干等生境苔蘚樣品47個,地衣樣品6個,樹木和竹林落葉樣品30個,花朵露水樣品2個.

1.2 樣品采集與鑒定

對土壤、苔蘚、地衣和落葉等陸生環(huán)境樣品的采集:用取土環(huán)刀或工具鏟采集樣品放入特制的牛皮紙袋中,實驗室敞口自然風(fēng)干后置入封口袋中密封保存.對于水生環(huán)境樣品:采集激流中底棲樣品時,用500mL瓶裝容器刮取收集水底基質(zhì);采集水生植物附著樣品時,摘取植物根莖進行沖洗后收集沖洗液;帶回實驗室后立即進行活體觀察和鑒定.

陸生樣品蛭態(tài)輪蟲的提取:取樣品放置于錐形瓶內(nèi),加入純水浸泡,2～12h后,待蛭態(tài)輪蟲與樣品分離,經(jīng)20μm篩網(wǎng)過濾3～4次,將濾液轉(zhuǎn)移至5mL計數(shù)框中鏡檢;或?qū)悠贩湃?0mL規(guī)格的離心管中,加入50%的蔗糖溶液,離心機3000轉(zhuǎn)離心5分鐘,取上清液稀釋后觀察.

使用顯微鏡(OLYMPUS BX51)觀察蛭態(tài)輪蟲的形態(tài)學(xué)特征,錄制其運動和攝食狀態(tài)下的視頻,隨后仔細(xì)分析并記錄視頻中獲取的輪盤、唇片(lip)、咀嚼器齒式等結(jié)構(gòu)特征,參考分類書籍和文獻[16-18]進行物種鑒定.為跟蹤物種分類系統(tǒng)的最新進展,同時參考輪蟲專業(yè)分類網(wǎng)站[19].

1.3 蛭態(tài)輪蟲單克隆培養(yǎng)和DNA提取

使用生菜汁進行蛭態(tài)輪蟲的單克隆培養(yǎng).將生菜磨碎后過濾,濾液滅菌后冷凍保存待用.挑取蛭態(tài)輪蟲置于24孔板中,每孔1只并加入1mL超純水和10μL生菜汁,每3d更換1次培養(yǎng)液并觀察記錄蛭態(tài)輪蟲的生長繁殖狀況.

挑取單克隆培養(yǎng)輪蟲,置于載玻片上,使用超純水清洗數(shù)次,鏡檢確保蟲體周圍和表面均無雜質(zhì)顆粒,將輪蟲轉(zhuǎn)移至0.2mL PCR管中,吸出多余水份,在解剖鏡下將輪蟲破碎,確保DNA充分提取.

樣品DNA提取使用HotSHOT方法,配制堿性裂解液(NaOH 25mmol/L, EDTA 0.2mmol/L, pH 8.0)和中和緩沖液(Tris-HCl 40mmol/L, pH 5.0),按1:1比例混合.向每個PCR管加入裂解液10 μL,渦旋振蕩后放入PCR儀95℃裂解30min;-20℃冷凍5～10min后加入10μL中和液,提取的DNA在-80℃中保存.

1.4 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系共25μL,設(shè)置3個平行.PCR反應(yīng)體系: 引物(LCO1490: 5’-GGTCAACAAATCATA- AAGATATTGG-3’), 0.5μL;引物(HCO2198: 5’-TA- AACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’), 0.5μL; DNA模板: 5μL; ExTaq酶: 0.125μL; dNTP(Mg+): 2μL; Buffer: 2.5μL; ddH2O補足至25μL.PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性1min;95℃變性40s,48℃退火30s,72℃延伸45s,共30個循環(huán);72℃延伸5min后4℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后利用Sanger法進行雙向測序.

1.5 數(shù)據(jù)分析

所獲原始序列經(jīng)Bioedit軟件檢查校正測序結(jié)果峰圖,利用SeqMan軟件對序列進行拼接,人工校正剪去兩端不可靠堿基序列;在NCBI進行Blast比對,查找相似度高的物種序列,從GenBank上下載其他蛭態(tài)輪蟲COⅠ序列.用MAFFT進行多重序列比對,刪除兩端不對齊序列,使所有片段長度一致,比對結(jié)果使用MEGA7.0軟件分析.使用軟件DAMBE 6.0[20]進行堿基替換飽和度分析,COⅠ序列的堿基轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)隨種間遺傳距離的增大呈明顯上升趨勢,可以進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.采用Kimura 2-parameter模型計算不同物種間的遺傳距離,通過最大似然法(Maximum Likelihood method,ML)使用BEAST v1.8.4構(gòu)建蛭態(tài)輪蟲貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果

2.1 蛭態(tài)輪蟲種類組成

共鑒定出蛭態(tài)亞綱輪蟲3目4科12屬66種(含亞種)(表1),包括旋輪屬15種,粗頸輪屬14種,盤網(wǎng)輪屬10種,宿輪屬10種,輪蟲屬7種,敖突輪屬2種,原盤輪屬2種,突盤輪屬2種,盔甲輪屬1種,水蛭輪屬1種,圍輪屬1種和雙趾輪屬1種.其中,污輪蟲()出現(xiàn)頻次最高(23.5%),其次為貝氏盤網(wǎng)輪蟲() (14.3%),棲居粗頸輪蟲() (13.3%),游蕩盤網(wǎng)輪蟲() (11.2%)和褶皺旋輪蟲() (10.2%).

2.2 不同生境中蛭態(tài)輪蟲物種多樣性比較

圖1 四類生境中蛭態(tài)輪蟲物種多樣性的比較

陸生環(huán)境中鑒定出蛭態(tài)輪蟲56種,其中苔蘚生境42種、落葉生境40種、地衣生境12種,水體15種(圖1).陸生生境的蛭態(tài)輪蟲種類明顯多于水體;28種蛭態(tài)輪蟲既可在苔蘚中生存,也可棲息在落葉中;苔蘚生境和水體中有5種共有物種,水體獨有種類10種.不同生境蛭態(tài)輪蟲物種多樣性差異較大.

2.3 COI基因序列組成分析與種間遺傳距離

共獲得37條COⅠ序列,通過BLAST比對分析,鑒定出16個形態(tài)學(xué)物種的分子信息(表2).對蛭態(tài)輪蟲測序獲得的COⅠ基因序列進行核苷酸組成分析,序列中A、C、G、T的平均含量分別為25%、10%、18.8%、46.2%,其中A+T的總含量(71.2%)遠(yuǎn)大于G+C的總含量(28.8%),高AT特性是明顯的堿基偏倚現(xiàn)象,符合COⅠ基因的堿基組成特點.

根據(jù)Kimura 2-parameter模型,所有的種間遺傳距離結(jié)果均大于3%,物種間最大的遺傳距離為0.2317,為輪蟲屬的轉(zhuǎn)輪蟲()和旋輪屬的巨環(huán)旋輪蟲(),它們的棲息環(huán)境均為淡水水體,但形態(tài)、大小等特征具有明顯差異.種間距離最小的是同屬于盤網(wǎng)輪科盤網(wǎng)輪屬的游蕩盤網(wǎng)輪蟲()和貝氏盤網(wǎng)輪蟲(),為0.0859.

2.4 各屬系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.4.1 粗頸輪屬 獲得4個粗頸輪屬()物種的COⅠ基因,共9條序列,分別為寬闊粗頸輪蟲()、四角粗頸輪蟲()、乳突粗頸輪蟲()和粗多刺粗頸輪蟲().經(jīng)Blast比對,與該4種相似性最高的序列均為同種輪蟲序列.其中,寬闊粗頸輪蟲與基因庫中寬闊粗頸輪蟲EU751246.1的相似度為99%;四角粗頸輪蟲與基因庫中四角粗頸輪蟲EF650532.1、FJ426410.1、EU499789.1的相似度分別為100%、99%和99%;乳突粗頸輪蟲序列1和2與乳突粗頸輪蟲 KM043196.1的相似度為100%;粗多刺粗頸輪蟲序列1、2、3與基因庫中多刺粗頸輪蟲EF650498.1的相似度為99%.形態(tài)學(xué)物種鑒定與DNA分子鑒定的結(jié)果一致.以同屬于旋輪科的間盤輪屬作為分析時的外類群,MH251791.1- MH251792.1單獨聚為一支,粗頸輪屬所有物種序列聚為另一支(圖2).

根據(jù)Kimura 2-parameter模型計算粗頸輪屬各物種的種間距離,發(fā)現(xiàn)寬闊粗頸輪蟲和的遺傳距離最小為0.0995,系統(tǒng)發(fā)育樹中這兩個物種聚為最相近的一支.粗多刺粗頸輪蟲和的遺傳距離最大,為0.1924,系統(tǒng)發(fā)育樹中這兩個物種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn).粗多刺粗頸輪蟲為多刺粗頸輪蟲()的亞種之一,與該屬其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),遺傳距離也較高,該物種與其亞種單獨聚為一支.寬闊粗頸輪蟲?四角粗頸輪蟲這兩個物種的序列除了基因庫中的相同種類外,與粗頸輪屬的、泡狀粗頸輪蟲()和同源性較高,親緣關(guān)系較近.

表1 廣東省蛭態(tài)亞綱輪蟲調(diào)查物種

續(xù)表1

表2 基于COI基因序列通過K2P模型計算的蛭態(tài)輪蟲遺傳距離

續(xù)表2

圖2 基于COI基因構(gòu)建的粗頸輪屬系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.2 旋輪屬 獲得6個旋輪屬()物種的COⅠ基因序列共12條,分別是寬體旋輪蟲()、微戟旋輪蟲()、尖角旋輪蟲()、巨環(huán)旋輪蟲()、褶皺旋輪蟲()和迅捷旋輪蟲().經(jīng)BLAST比對,前5個物種在GenBank中均找到了相似度高的同一物種序列,相似度分別為98%、99%、99%、97%和100%,均不低于97%,形態(tài)學(xué)鑒定的物種結(jié)果與基因序列比對結(jié)果一致.該6種輪蟲中5種來自陸生生境(苔蘚和落葉),只有巨環(huán)旋輪蟲生活在穩(wěn)定水體中,且分布廣泛.微戟旋輪蟲與種間遺傳距離最小為0.1249;巨環(huán)旋輪蟲與褶皺旋輪蟲和雙戟旋輪蟲()遺傳距離最大,同為0.1896.旋輪屬輪蟲種間遺傳距離數(shù)值比較集中,基因之間重組率較高.經(jīng)比對,GenBank中無迅捷旋輪蟲的基因序列,本研究首次獲得了該輪蟲的COⅠ基因,其與同屬的遺傳距離最小為0.1278,在發(fā)育樹中聚為一支,兩個物種的同源性較高(圖3).本研究獲得的序列除了與同種物種的序列聚為一支以外,進化樹的其他分支聯(lián)系緊密,聚類并無較明顯的分歧.

圖3 基于COI基因構(gòu)建的旋輪屬系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.3 輪蟲屬 發(fā)現(xiàn)兩種輪蟲屬()種類,污輪蟲()和轉(zhuǎn)輪蟲(),獲得8條COⅠ基因序列.經(jīng)BLAST比對,污輪蟲與EU751161.1-751162.1的相似度為99%,轉(zhuǎn)輪蟲與JQ309463.1-309467.1的相似度為98%,種群間差異度小于3%.根據(jù)Kimura 2-parameter模型計算輪蟲屬的種間遺傳距離,采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以蛭態(tài)輪蟲兩條序列作為外類群,輪蟲屬所有物種序列聚為一支(圖4).輪蟲屬最小種間距離0.1188,為和懶輪蟲()兩個物種,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示這兩個物種親緣關(guān)系最近,聚為同一支(圖4).污輪蟲和轉(zhuǎn)輪蟲遺傳距離最大,為0.1977,其親緣關(guān)系相對最遠(yuǎn).輪蟲屬的聚類結(jié)果分為兩大類群,第一類群的物種包括污輪蟲、長足輪蟲()、懶輪蟲和;第二類群包括轉(zhuǎn)輪蟲和,這兩個物種的棲息生境均為池塘的水生植物區(qū).長足輪蟲和生活在穩(wěn)定水體中,與陸生環(huán)境生存的其他2個物種聚為一支,表明物種的同源性可能與地理距離或蟲體形態(tài)特征相關(guān),不僅僅取決于生境.污輪蟲的聚類情況較為復(fù)雜,同一生境地點獲得的基因序列分開,與基因庫中已有序列分別聚類,顯示同域物種分化現(xiàn)象.

圖4 基于COI基因構(gòu)建的輪蟲屬系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.4 盤網(wǎng)輪屬 獲得4種盤網(wǎng)輪屬()物種的COⅠ基因序列8條.經(jīng)BLAST序列比對,游蕩盤網(wǎng)輪蟲()、瑞氏盤網(wǎng)輪蟲)、貝氏盤網(wǎng)輪蟲()與其聚為一支對應(yīng)的物種相似度分別為99%、98%和99%.以蛭態(tài)輪蟲和作為外類群,盤網(wǎng)輪屬物種全部聚為一支(圖5).基因庫中未發(fā)現(xiàn)楔足盤網(wǎng)輪蟲()基因序列,本研究首次獲得該輪蟲的COI基因.該屬中,與楔足盤網(wǎng)輪蟲種間遺傳距離最大,為0.1478;貝氏盤網(wǎng)輪蟲與南方盤網(wǎng)輪蟲()種間遺傳距離最小,為0.1032,親緣關(guān)系最近(圖5),2個物種的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征相似,其喙部比較發(fā)達(dá)且都具有左右各一的堅硬纖毛,身體各部分形態(tài)和長度也無較大差別,唯一較明顯的區(qū)別是貝氏盤網(wǎng)輪蟲的足部有3個圓環(huán)狀結(jié)構(gòu),南方盤網(wǎng)輪蟲無此結(jié)構(gòu),這也是貝氏盤網(wǎng)輪蟲的重要分類特征.楔足盤網(wǎng)輪蟲和游蕩盤網(wǎng)輪蟲在形態(tài)上僅有足部和趾存在較大差異,其他部位類似,種間遺傳距離為0.1091,相對于楔足盤網(wǎng)輪蟲與其他物種的遺傳距離較小,具有較高的同源性.

圖5 基于COI基因構(gòu)建的盤網(wǎng)輪屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 蛭態(tài)輪蟲的物種多樣性

目前全球共發(fā)現(xiàn)蛭態(tài)輪蟲3目4科19屬574種,其中原輪目(Philodinavida)3屬9種、盤網(wǎng)輪目(Adinetida)2屬28種、旋輪目(Philodinida)14屬537種[19].我國的蛭態(tài)輪蟲記錄有4科13屬89種[21-22].目前為止,蛭態(tài)亞綱輪蟲的4科在中國已全部記錄,仍有6屬(、、、、、)的物種有待發(fā)現(xiàn)探究,這些屬的物種相對于常見種,形態(tài)上都有其自身的特殊性,可能是為適應(yīng)特殊生境而發(fā)生的適應(yīng)性進化.由于蛭態(tài)輪蟲分類學(xué)研究力度較弱以及高度的形態(tài)變異性,潛在的物種豐富度和分子隱種被嚴(yán)重低估[23-25].目前已記載的蛭態(tài)輪蟲數(shù)僅能代表真實物種多樣性的一部分.在今后的研究中,尋找特殊的新生境和研究方法的更新可能會發(fā)現(xiàn)更多蛭態(tài)輪蟲物種.

蛭態(tài)輪蟲分布廣泛,常見種類出現(xiàn)在多個不同類型的生境中[7].調(diào)查發(fā)現(xiàn),苔蘚和落葉中的蛭態(tài)輪蟲物種豐富度較高,很多常見種在2種生境中均可生存(圖2).本次采集的23個苔蘚、地衣、落葉和水體樣品中都發(fā)現(xiàn)了污輪蟲,涵蓋了多種水陸棲息地生境,數(shù)量多、分布廣,為物種地理區(qū)域格局的研究奠定了基礎(chǔ).研究發(fā)現(xiàn),落葉中的蛭態(tài)輪蟲體表常有附屬結(jié)構(gòu),如短刺、環(huán)狀凸起物等.這些結(jié)構(gòu)增加了蟲體本身的摩擦力,可以牢固地附著在基質(zhì)表面,更好地適應(yīng)多風(fēng)環(huán)境.苔蘚地衣的組織結(jié)構(gòu)密集,保水抗風(fēng)性較好,苔蘚生境穩(wěn)定,適合蛭態(tài)輪蟲生長繁殖,物種較豐富,多樣性高[22-24].水生生境中的蛭態(tài)輪蟲一般聚集在水生植物生長的地方,水生植物為其提供了附著基質(zhì),有利于蛭態(tài)輪蟲固著和攝食[11,22], 并可根據(jù)蛭態(tài)輪蟲評價水體狀況?[26].蛭態(tài)輪蟲物種豐富度在穩(wěn)定水體中最低,原因可能是蛭態(tài)輪蟲可通過低濕休眠度過不定期干燥等多變環(huán)境,以此成為其競爭和生存的重要策略.有研究顯示,蛭態(tài)輪蟲經(jīng)歷了低濕休眠后繁殖力反而增強,且有助于保持適合度的穩(wěn)定[27].蛭態(tài)輪蟲為無性生殖方式,能在環(huán)境適宜時迅速拓殖棲息地.因此周期性干燥等環(huán)境壓力可能對其并非脅迫,而是生活史策略中不可或缺的因素,利于其與同生境的其他生物競爭,從而有助于蛭態(tài)輪蟲物種的生存與延續(xù)[28].

蛭態(tài)輪蟲體型微小無背甲,易收縮為無法辨認(rèn)的球狀,因此種類鑒定時不能對其進行有效固定或刺激性干擾.除了盤網(wǎng)輪科以外,其他3科不僅需要獲取蟲體的爬行體態(tài)特征,還須獲取攝食狀態(tài)下的輪盤特征才能進行形態(tài)學(xué)鑒定;其次,蟲體運動劇烈難以在高倍顯微鏡下捕捉關(guān)鍵分類特征和進行及時有效的追蹤觀察;再者,目前最為全面的鑒定資料依然為早期發(fā)表的德語書籍,由于語言障礙使得鑒定和檢索資料利用困難[2].因此,該類群動物的分類學(xué)研究一直進展較為緩慢,尤其是在非德語或非英語的亞非國家?[22, 29-30].在現(xiàn)有技術(shù)手段下,借助分子生物學(xué)手段獲取傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)物種的遺傳信息進行比對分析,有助于揭示該類群潛在的物種多樣性和生物地理分布格局.

3.2 蛭態(tài)輪蟲的分子系統(tǒng)發(fā)育研究

本研究共獲取蛭態(tài)輪蟲COⅠ基因序列37條,包括4屬16種,通過DNA條形碼技術(shù)驗證了形態(tài)學(xué)分類的準(zhǔn)確性.蛭態(tài)輪蟲體型微小,同屬不同物種間形態(tài)差異小,特別是旋輪屬的物種,數(shù)量多、特征相近,在鑒定過程中易混淆,為避免這種錯誤的出現(xiàn),將分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)分類學(xué)方法相結(jié)合,可以確保物種鑒定的準(zhǔn)確性.蛭態(tài)輪蟲COI序列中A+T的平均含量(71.2%)高于4種淡水臂尾輪蟲A+T的平均含量(65.6%)[31],與8種淡水臂尾輪蟲4和5基因序列中A+T含量相當(dāng)(71.7%)[32],高AT特性是明顯的堿基偏倚現(xiàn)象,符合COⅠ基因的堿基組成特點,在其他無脊椎動物線粒體基因中廣泛存在.

目前對蛭態(tài)輪蟲盤網(wǎng)輪屬的分類學(xué)研究相對最多,也最易通過形態(tài)識別[33].本研究共采集了盤網(wǎng)輪屬的4個形態(tài)學(xué)物種,其中游蕩盤網(wǎng)輪蟲分布非常廣泛,幾乎所有地區(qū)水陸生境都有其存在,變異度高,已有研究顯示其形態(tài)學(xué)物種之下有36個分子隱種[11];瑞氏盤網(wǎng)輪蟲易于識別與培養(yǎng),該種具有較為廣泛的地理分布.由于易采集和培養(yǎng),在獲得游蕩盤網(wǎng)輪蟲和瑞氏盤網(wǎng)輪蟲全基因組信息后,其已成為研究基因組特征和遺傳進化的重要模式生物[6,34].

對于部分稀有物種,本研究未能獲取相關(guān)的COⅠ基因數(shù)據(jù),因為DNA提取和擴增成功率較低,且多數(shù)稀有物種的樣品數(shù)量較少,并且不容易培養(yǎng),實驗失敗后很難再獲取輪蟲樣品.為了提高基因提取和擴增的成功率,獲取更多物種的基因序列,可做如下改進:(1) DNA提取時盡可能地將蛭態(tài)輪蟲個體破碎完全,釋放更多的內(nèi)容物質(zhì),提高基因提取和擴增效率;(2) 利用蛭態(tài)輪蟲孤雌生殖特點,進行單克隆培養(yǎng),提取DNA時向PCR管中加入多只單克隆培養(yǎng)輪蟲,提高DNA含量,更易擴增成功.

4 展望

蛭態(tài)輪蟲體型微小,在環(huán)境不適時進入低濕休眠利于傳播,往往被認(rèn)為具有全球性分布特征,而不具備地域性特征[7].近年來研究顯示南極地區(qū)存在極高比例的地域性物種,有高達(dá)95%的獨立進化單元,已描述12個新種[27].對熱帶地區(qū)泰國水體蛭態(tài)輪蟲調(diào)查也發(fā)現(xiàn)蛭態(tài)輪蟲既有全球性廣布種,也存在地域性物種[35].對不同棲息地的探索有助于發(fā)現(xiàn)更多占據(jù)不同生態(tài)位的蛭態(tài)輪蟲.形態(tài)學(xué)分類工作未記錄到大量地域性新物種的存在,可能是因為很多分子隱種未被發(fā)現(xiàn),以及很多非常細(xì)微的形態(tài)學(xué)變異未被有效記錄,因此后續(xù)研究不僅應(yīng)利用更多樣的顯微鏡技術(shù),也應(yīng)利用DNA分類技術(shù)對不同生境和不同地理區(qū)域的物種進行研究.我國具有多樣化的生境,應(yīng)嘗試運用多種研究方法擴展蛭態(tài)輪蟲調(diào)查的廣度和深度,增加對青藏高原和熱帶地區(qū)濕地環(huán)境中輪蟲群落的調(diào)查,將有助于全面了解蛭態(tài)輪蟲多樣性及其分布模式,豐富我國蛭態(tài)輪蟲物種多樣性,進一步探究蛭態(tài)輪蟲的生態(tài)學(xué)作用.

5 結(jié)論

利用形態(tài)學(xué)和DNA分類手段,調(diào)查廣東省不同水陸生境蛭態(tài)輪蟲物種多樣性,鑒定出蛭態(tài)輪蟲3目4科12屬66種,并獲取4屬16種共37條COⅠ序列.調(diào)查結(jié)果表明:(1)廣東省蛭態(tài)輪蟲物種多樣性高,不同生境間物種組成差異較大,陸生生境物種更為豐富;(2)系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了相應(yīng)物種的分類地位和親緣關(guān)系,證實了形態(tài)學(xué)觀察配以DNA分類手段鑒定的有效性,為我國蛭態(tài)輪蟲物種多樣性和生物地理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)資料.

[1] Fontaneto D, Barraclough T G. Do species exist in asexuals? Theory and evidence from bdelloid rotifers [J]. Integrative and Comparative Biology, 2015,55(2):253-263.

[2] Ricci C. Bdelloid rotifers: ‘sleeping beauties’ and ‘evolutionary scandals’, but not only [J]. Hydrobiologia, 2017,796(1):277-285.

[3] Welch D B M, Meselson M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange [J]. Science, 2000,288(5469):1211-1215.

[4] Gladyshev E A, Meselson M, Arkhipova I R. Massive horizontal gene transfer in bdelloid rotifers [J]. Science, 2008,320(5880):1210-1213.

[5] Wilson C G, Sherman P W. Anciently asexual bdelloid rotifers escape lethal fungal parasites by drying up and blowing away [J]. Science, 2010,327(5965):574-576.

[6] Flot J F, Hespeels B, Li X, et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga [J]. Nature, 2013,500 (7463):453-457.

[7] Fontaneto D. Long-distance passive dispersal in microscopic aquatic animals [J]. Movement Ecology, 2019,7(1):10.

[8] Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes [J]. Proceeding of Royal society of London. Biological Science, 2003,270(1512):313-321.

[9] Schenk J, Fontaneto D. Biodiversity analyses in freshwater meiofauna through DNA sequence data [J]. Hydrobiologia, 2020,847:2597–2611.

[10] 項賢領(lǐng),陶媛媛,席貽龍.輪蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)地理格局研究進展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015,34(7):2048-2057.

Xiang X L, Tao Y Y, Xi Y L. Review on phylogeographical pattern and population genetic structure of rotifer [J]. Chinese Journal of Ecology, 2015,34(7):2048-2057.

[11] Fontaneto D, Iakovenko N S, Eyres I, et al. Cryptic diversity in the genus Adineta Hudson & gosse, 1886 (Rotifera: Bdelloidea: Adinetidae): a DNA taxonomy approach [J]. Hydrobiologia, 2011,662:27-33.

[12] Iakovenko N S, Smykla J, Convey P, et al. Antarctic bdelloid rotifers: diversity, endemism and evolution [J]. Hydrobiologia, 2015,761:5-43.

[13] Wang Q, Yang Y F, Chen J F. Impact of environment on the spatio- temporal distribution of rotifers in the tidal Guangzhou segment of the Pearl River Estuary, China [J]. International Review of Hydrobiology, 2009,94(6):688-705.

[14] 梁迪文,王 慶,魏 南,等.廣州市不同類型水體輪蟲群落結(jié)構(gòu)的時空變動及與理化因子間的關(guān)系[J]. 湖泊科學(xué), 2017,29(6):1433-1443.

Liang D W, Wang Q, Wei N, et al. Spatial and temporal variation in rotifer community structure and the response to environmental factors among different water bodies in Guangzhou City [J]. Journal of Lake Sciences, 2017,29(6):1433-1443.

[15] 黃 珂,李慧明,徐少林,等.不同水力調(diào)度模式的兩座調(diào)水型水庫輪蟲群落結(jié)構(gòu)的比較[J]. 湖泊科學(xué), 2019,31(3):853-861.

Huang K, Li H M, Xu S L, et al. Comparative analysis of rotifer community structures in two pumped-storage reservoirs with different retention times [J]. Journal of Lake Sciences, 2019,31(3):853-861.

[16] 王家楫.中國淡水輪蟲志[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1961.

Wang J J. Freshwater rotifers of China [M]. Beijing: Science Press, 1961.

[17] Donner J. Ordnung Bdelloidea (Rotatoria, Radertiere) Bestimmungsbü cher zur Bodenfauna Europas 6 [M]. Berlin: Akademie-Verl, 1965.

[18] Ricci C, Melone G. Key to the identification of the genera of bdelloid rotifers [J]. Hydrobiologia, 2000,418:73-80.

[19] Jersabek C D, Leitner M F. The rotifer world catalog [EB/OL]. http://www.rotifera.hausdernatur. at/, 2021-01-05.

[20] Xia X. DAMBE6: New tools for microbial genomics, phylogenetics and molecular evolution [J]. Journal of Heredity, 2017,108:431-437.

[21] 李 瑩,王 慶,魏 南,等.蛭態(tài)輪蟲中國新記錄種及其研究展望[J]. 水生生物學(xué)報, 2020,44(2):423-428.

Li Y, Wang Q, Wei N, et al. Newly recorded species of bdelloid rotifer in China and research prospects [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2020,44(2):423-428.

[22] Zeng Y, Wei N, Wang Q, et al. Bdelloid rotifers (Rotifera, Bdelloidea) of China: diversity and new records [J].ZooKeys, 2020,941:1-23.

[23] Kaya M, Herniou E A, Barraclough T G, et al. Inconsistent estimates of diversity between traditional and DNA taxonomy in bdelloid rotifers [J]. Organisms Diversity and Evolution, 2009,9(1):3-12.

[24] Fontaneto D, Kaya M, Herniou E A, et al. Extreme levels of hidden diversity in microscopic animals (Rotifera) revealed by DNA taxonomy [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2009,53(1):182-189.

[25] Robeson M S, King A J, Freeman K R, et al. Soil rotifer communities are extremely diverse globally but spatially autocorrelated locally [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011,108(11):4406-4410.

[26] Kuczyńska-Kippen N. The use of bdelloids in reference to rotifer biocoenotic indices as an indicator of the ecological state of small field water bodies: The effect of macrophytes, shading and trophic state of water [J]. Ecological Indicators, 2018,89:576-583.

[27] Hinz C, Ahlrichs W H, Bininda-Emonds O R P. Immediate and heritable costs of desiccation on the life history of the bdelloid rotifer Philodina roseola [J]. Organisms Diversity & Evolution, 2018,18(4):399-406.

[28] Sommer S, Fontaneto D, Ozgul A. Demographic processes underlying fitness restoration in bdelloid rotifers emerging from dehydration [J]. Freshwater Biology, 2019,64(7):1295-1302.

[29] Song M O, Lee C H. A new and five rare bdelloids from Korea [J]. Zootaxa, 2017,4242(3):529-547.

[30] Song M O, Min G S. A new species and ten new records of bdelloid rotifers from Korea [J]. Zootaxa, 2015,3964(2):211-227.

[31] 鮑 蕾,牛翠娟,馬 蕊,等.四種臂尾輪蟲線粒體COI基因部分序列及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 動物學(xué)研究, 2003,24(3):200-204.

Bao L, Niu C J, Ma R, et al. Sequences and phylogeny of partial mitochondrial COⅠ gene from four brachionus species [J]. Zoological Research, 2003,24(3):200-204.

[32] 程雙懷,魏世祥,張 逸,等.基于ND4和ND5基因序列研究八種臂尾輪蟲的系統(tǒng)關(guān)系和分類地位[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 40(12):1823-1829.

Cheng S H, Wei S X, Zhang Y, et al. Phylogenetic relationship and taxonomic status of eightspecies (rotifera) inferred from ND4 and ND5 genes [J]. Journal of Fisheries of China, 2016,40(12):1823-1829.

[33] ?rstan A. Taxonomic morphology of the genus Adineta (Rotifera: Bdelloidea: Adinetidae) with a new species from a suburban garden [J]. Zootaxa, 2018,4524(2):187-199.

[34] Nowell R W, Almeida P, Wilson C G, et al. Comparative genomics of bdelloid rotifers: Insights from desiccating and nondesiccating species [J]. PLoS Biology, 2018,16(4):e2004830.

[35] Jaturapruek R, Fontaneto D, Meksuwan P, et al. Planktonic and periphytic bdelloid rotifers from Thailand reveal a species assemblage with a combination of cosmopolitan and tropical species [J]. Systematics and Biodiversity, 2018,16(2):128-141.

Species diversity and phylogenetic analysis of bdelloid rotifers in Guangdong Province.

WANG Qing, LI Ying, WANG Wen-bo, YANG Yu-feng*

(Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)., 2021,41(9)：4367～4377

In order to investigate species diversity of bdelloid rotifer in Guangdong Province, 98 samples from different habitats in Guangdong Province were collected, and 66 species (including subspecies) of bdelloid rotifers were recorded belonged to 3 orders, 4 families, 12 genera. Fifty-six species of bdelloid rotifer were identified in terrestrial environment, including 42 species in bryophyte habitats, 40 species in deciduous habitats, 12 species in lichen habitats, and 15species in aquatic habitats. The species number of bdelloid rotifer in terrestrial habitats was significantly more than that in aquatic habitats. To verify the accuracy of morphological identification, 37 COI gene sequences of 16 species belonged to 4genera were obtained, and the genetic distance among them ranged from 8.59% to 23.17%. The COI gene sequences ofandwere first reported in the world. The total content (71.2%) of adenine (A) and thymine (T) was higher than that (28.8%) of guanine (G) and cytosine(C). The cluster results of phylogenetic tree were consistent with those of morphological species identification; the species with similar morphology belonged to the same genus have higher homology. The results showed that the combination of morphological identification and DNA barcoding technology could improve the accuracy of species identification for bdelloid rotifers, explore their phylogenetic position at molecular level, and promote the species diversity and ecological research of bdelloid rotifers.

bdelloid rotifer；biodiversity；DNA barcoding；COI gene；biogeography

X17

A

1000-6923(2021)09-4367-11

王 慶(1981-),男,安徽安慶人,副研究員,博士,主要從事輪蟲生態(tài)學(xué)研究.發(fā)表論文60余篇.

2021-02-18

廣東省自然科學(xué)基金面上項目(2021A1515010814)

* 責(zé)任作者, 教授, tyyf@jnu.edu.cn