魏祖晨，趙順鑫，李卓蔚，趙晶晶，周 濃，郭冬琴

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶404120）

木香（Saussurea costus）作為菊科風(fēng)毛菊屬植物主要以云木香和川木香兩種形式為主［1］，以其根入藥，具有利脾化食和行氣止痛之效，可治療積食、嘔吐瀉痢、胸腹脹痛以及消化不良等病癥，故作為治療胃腸道常用藥［2］。市場(chǎng)上的木香藥材多年以來主要依賴于野生采挖，導(dǎo)致野生資源幾近枯竭，因此尋找合適的木香人工育苗方法顯得尤為重要。

叢枝菌根真菌（AMF）是土壤中的一類有益菌，可與80%以上的植物根系共生［3］。侵染率是表示其與宿主植物是否能建立共生關(guān)系的重要指標(biāo)，侵染率越高表明AMF 與植物形成的共生關(guān)系越緊密。侵染主要是通過形成叢枝結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，AMF 的一端深入植物根系細(xì)胞內(nèi)與宿主植物進(jìn)行物質(zhì)交換，另一端則穿越根際，擴(kuò)大根際對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收［3-4］。此外，AMF 與植物形成的菌根還會(huì)使植物根際的微生物群落比例和土壤酶活性都會(huì)發(fā)生變化［5］。綠化植物接種AMF 后，其根際微環(huán)境中的土壤養(yǎng)分含量、土壤微生物數(shù)量以及土壤酶活性都顯著增加，土壤肥力明顯提高［6］。連作土壤施用AMF 能夠明顯提高土壤酶活性以及解決土壤微生物群落比例不均等問題［7］。因此，采用不同AMF 混合接種以改善和增強(qiáng)土壤環(huán)境已成為一種趨勢(shì)。

土壤酶活性既可以反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況，還可以增加土壤碳、氮、磷含量，提高土壤肥力［8］。此外，土壤酶活性還與土壤中微生物間的關(guān)系極其密切。在生理代謝過程中，土壤酶活性增強(qiáng)可以加速有機(jī)物含量的增加，為微生物大量生長(zhǎng)提供所需的養(yǎng)分，促使微生物的繁殖速度加快，使微生物的生長(zhǎng)環(huán)境得到改善；而微生物也可以向土壤中不斷分泌各種酶，使土壤中酶活性也大大地提升［9］。因此，適宜的土壤酶活性與健康的微生物環(huán)境能使植物健康生長(zhǎng)。本課題組前期研究表明，接種AMF 能提高云木香葉片中營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗氧化酶的活性，增強(qiáng)云木香的抗逆能力［10］。木香苗期接種不同AMF 對(duì)其根際土壤養(yǎng)分、微生物數(shù)量以及土壤酶活性均有一定影響，外源接種AMF 有利于木香幼苗的生長(zhǎng)［11］。結(jié)合課題組前期成果及相關(guān)文獻(xiàn)［6-11］，本研究混合接種不同AMF 對(duì)云木香根際微生物以及土壤酶活性的影響，為AMF 在云木香生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

云木香種子主要采集于重慶市開縣大進(jìn)鎮(zhèn)云木香種植基地，該基地海拔高度為325 m，屬于暖濕亞熱帶季風(fēng)氣候。挑選株高1.6~1.8 m、莖葉完好的云木香健壯植株，采集成熟、新鮮的種子2 000 粒左右，經(jīng)重慶三峽學(xué)院周游博士鑒定為菊科植物-云木香（S.costus）。

1.2 樣品處理

AMF 純凈菌劑購(gòu)買自美利堅(jiān)共和國(guó)國(guó)際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心（INVAM），經(jīng)重慶三峽學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增繁殖以及儲(chǔ)存保管［12］，菌劑擴(kuò)繁使用河沙與山基土（1：3）混合制成培養(yǎng)基質(zhì)。試驗(yàn)組構(gòu)建菌種組合的試驗(yàn)方案見表1［13］。

表1 不同處理組及其接種AMFTable 1 Different treatment groups and inoculated AMF

于重慶市萬(wàn)州區(qū)鐵峰山國(guó)家森林公園室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，栽培用容器為15 cm×18 cm 的棕色塑料花盆（用酒精擦拭3 遍后用），栽培介質(zhì)與菌劑擴(kuò)繁基質(zhì)相同，在121℃滅菌2 h。

試驗(yàn)主要包括7 個(gè)處理組，其中，6 組混合接種AMF 作為處理組（育苗時(shí)接種AMF）和1 組對(duì)照（CK組），每處理組各10 次重復(fù)。每盆播種20 粒云木香種子，播種前種子用10%次氯酸鈉溶液消毒15 min后，清水沖洗干凈，晾干備用。播種時(shí)將AMF菌土均勻施于云木香種子的表土下，每盆按照10 mL劑量進(jìn)行接種，孢子密度約為30個(gè)/mL，主要由帶有孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質(zhì)混合制成。同時(shí)播種紫云英混合培養(yǎng)，紫云英種子也需要用10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，清水沖洗干凈，晾干備用。待云木香幼苗出土后除去紫云英植株，出苗后間苗3株，幼苗生長(zhǎng)過程中不接種AMF。CK組不接種AMF，其他處理方式與處理組一致。將盆栽放置于室溫（自然光照）下，定期觀察與分析，按照云木香的常規(guī)養(yǎng)護(hù)方法管理，每周澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 孢子密度測(cè)定

孢子密度采用濕篩傾注蔗糖離心法測(cè)定孢子數(shù)量，以每10 g 土樣所含孢子的數(shù)量表示孢子密度［14］。

1.3.2 叢枝菌根真菌侵染率和侵染強(qiáng)度測(cè)定

將云木香樣品根系剪成1 cm 根段，從中隨機(jī)選取30 條大小均勻一致的根系進(jìn)行侵染率和侵染強(qiáng)度的測(cè)定。將選取好的根系置于10%氫氧化鉀溶液中，90℃恒溫水浴加熱45 min后，棄去氫氧化鉀溶液，將根系水洗凈，再用1%鹽酸溶液進(jìn)行酸化，經(jīng)前處理的根系放入90℃乳酸甘油曲利本藍(lán)染液中加熱45 min，最后將處理好的根系用十字交叉法測(cè)定AMF 的侵染率。根據(jù)黃艷萍等［15］的方法統(tǒng)計(jì)菌根侵染率和侵染強(qiáng)度。

1.3.3 土壤養(yǎng)分測(cè)定

速效氮、速效磷、有機(jī)質(zhì)和有機(jī)碳含量分別采用堿解擴(kuò)散法、碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法、K2Cr2O7和濃H2SO4加熱法和重鉻酸鉀外加熱法進(jìn)行測(cè)定［16］，pH值采用酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 土壤微生物數(shù)量測(cè)定

采用牛肉膏培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基分別對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌進(jìn)行培養(yǎng)及計(jì)數(shù)［17］，按照公式計(jì)算土壤內(nèi)微生物群落總量：

微生物群落總量（103）=細(xì)菌+真菌+放線菌

1.3.5 土壤酶活性測(cè)定

過氧化氫酶、土壤蛋白酶、磷酸酶、蔗糖酶以及脲酶活性分別采用紫外分光光度法、改良茚三酮比色法、對(duì)硝基苯磷酸二鈉法、3，5-二硝基水楊酸比色法以及靛酚比色法進(jìn)行測(cè)定［18］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合接種不同AMF 對(duì)云木香根際土中孢子密度的影響

由圖 1 可知，與 CK 組比較，除 A 和 B 處理組外，其余4 組云木香根際土中孢子密度均有所上升，其中F 組增加近2 倍。A 與B 處理組分別混合接種4 種不同AMF，結(jié)果卻顯示云木香根際土中孢子密度相較于CK 組有所下降；而其它組分別混合接種2 種不同AMF，結(jié)果顯示孢子密度卻有不同程度地增加，這說明同時(shí)接種過多AMF 可能會(huì)引起孢子密度降低，這可能是由于不同AMF 之間相互作用對(duì)孢子密度產(chǎn)生了抑制。由圖1 分析可知，混合接種2 種不同AMF 對(duì)根際土孢子密度的增加有促進(jìn)作用，而混合接種2 種不同AMF 組合對(duì)孢子密度的增加也有所不同。由此可知，混合接種不同AMF 并不是越多越好，接種的同時(shí)要考慮不同AMF 菌種之間產(chǎn)生的協(xié)同或抑制作用以及這種機(jī)制對(duì)云木香孢子密度的影響，根據(jù)不同目的選擇不同的AMF 混合接種可以得到更理想的效果。

圖1 混合接種不同AMF后孢子密度的變化Fig. 1 Changes of spore density in mixed inoculation of differ?ent AMF

2.2 混合接種不同AMF 對(duì)云木香根系侵染率的影響

由圖2 可知，CK 組未被侵染，而混合接種不同AMF 的云木香根系均被100%侵染，但侵染強(qiáng)度有所不同，可能是由于云木香與混合菌種之間存在相互選擇的作用，其中D 組侵染強(qiáng)度最高。這說明云木香苗期外源混合接種不同AMF 能正常生長(zhǎng)，且能和云木香根系形成良好的菌根共生體。

圖2 混合接種不同AMF后侵染率及侵染強(qiáng)度的變化Fig.2 Change of infection rate and intensity of mixed inocula?tion of different AMF

2.3 混合接種不同AMF 對(duì)云木香根際土壤養(yǎng)分和pH的影響

經(jīng)表2 分析可知，混合接種不同AMF 后，云木香根際土的pH 保持在6.12~6.21 之間，土壤環(huán)境呈弱酸性，與CK 組相近，證明外源混合接種不同AMF并未對(duì)云木香根際土壤環(huán)境的pH 產(chǎn)生顯著影響。與CK 組相比，除B 處理組外，其余處理組均使云木香根際土壤內(nèi)的速效氮、速效磷、有機(jī)質(zhì)和有機(jī)碳含量有所提高，其中，E 處理組的增長(zhǎng)率最高，C 處理組次之?；旌辖臃NE處理組后云木香根際土上述指標(biāo)依次增加93.02%、26.12%、43.40%和43.41%，混合接種C處理組后云木香根際土上述指標(biāo)依次增加66.71%、23.37%、30.00%和29.99%。方差分析可知，E 處理組和C 處理組與CK 間差異均達(dá)顯著水平，這說明外源接種不同AMF 不僅可以與根系形成良好的共生體，還能夠增強(qiáng)土壤肥力。

表2 混合接種不同AMF后根際土壤養(yǎng)分含量和pH的變化Table 2 Changes of nutrient content and pH of rhizosphere soil treated by mixed inoculation of different AMF

2.4 混合接種不同AMF 對(duì)云木香根際土壤微生物數(shù)量的影響

外源混合接種不同AMF 后，云木香根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量以及均顯著高于CK 組（表3）。其中，E 處理組的細(xì)菌和放線菌增長(zhǎng)幅度最大，依次為66.20%和95.90%（P＜0.05），C 處理組的增長(zhǎng)幅度次之，依次為61.97%和68.44%（P＜0.05）。而真菌的數(shù)量除B 處理組外，其余處理組均呈上升的趨勢(shì)。其中，C 處理組的真菌數(shù)量上升最多，與CK 相比，其增長(zhǎng)率為58.25%。此外，外源混合接種C 處理組還可以顯著提高微生物總量，其增長(zhǎng)率達(dá)到了67.72%。以上結(jié)果表明，混合接種不同AMF可以改善根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使云木香根際土壤微生物群落表現(xiàn)為放線菌＞細(xì)菌＞真菌。

表3 混合接種不同AMF后根際土壤微生物數(shù)量的變化Table 3 Variation of microbial quantity in rhizosphere soil treated by mixed inoculation of different AMF

2.5 混合接種不同AMF 對(duì)云木香根際土壤酶活性的影響

混合接種不同AMF對(duì)云木香根際土壤酶活性的影響具有差異（表4），其中蛋白酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶及蔗糖酶的活性比CK組均有提高。蛋白酶可以促進(jìn)土壤中含蛋白質(zhì)氮的有機(jī)化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化為植物生長(zhǎng)提供充足的氮源，而云木香苗期外源混合接種不同AMF可使各處理組的蛋白酶活性升高2~27倍。脲酶是唯一能水解尿素的酶，其活性高低直接反映了植物對(duì)氮素的轉(zhuǎn)化程度和直接利用情況。與CK組比較，各處理組脲酶變化呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，僅有A、C兩組略微下降，其酶促產(chǎn)物是植物氮素另一主要來源，這說明混合接種不同AMF 對(duì)云木香根際土中氮素的積累奠定了基礎(chǔ)。土壤中磷酸酶活性是衡量土壤磷素生物轉(zhuǎn)化強(qiáng)度大小與方向的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中測(cè)定了不同pH磷酸酶的活性，除部分處理組中性磷酸酶活性略微下降，其余均為上升，這說明外源混合接種不同AMF 可以促進(jìn)土壤中磷素的代謝過程。過氧化氫酶可以促進(jìn)過氧化氫（H2O2）的分解，并能夠預(yù)防H2O2過度積累而對(duì)植物體造成毒害作用。本試驗(yàn)處理組過氧化氫酶活性均上升，這提高了云木香免受H2O2的毒害能力，保證了其健康生長(zhǎng)。蔗糖酶又名轉(zhuǎn)化酶，可以通過水解有機(jī)物增加土壤中易溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，為土壤中生物提供充足的光合作用產(chǎn)物，故蔗糖酶活性即可體現(xiàn)土壤生物學(xué)活性，也可以用來評(píng)價(jià)土壤肥力和土壤熟化程度。本試驗(yàn)中除D 處理組有部分下降外，其余處理組蔗糖酶活性均有所上升。綜上所述，外源混合接種不同AMF均能顯著提高土壤肥力。

表4 混合接種不同AMF后根際土壤酶活性的變化Table 4 Changes of enzyme activity in rhizosphere soil treated by mixed inoculation of different AMF

2.6 相關(guān)性分析

經(jīng)過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)（表5），云木香根際土中的速效氮與速效磷、有機(jī)質(zhì)和有機(jī)碳含量之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)依次為0.949、0.944 和0.944；速效磷與有機(jī)質(zhì)和有機(jī)碳之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)均為0.957；有機(jī)質(zhì)與有機(jī)碳之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為1.000。土壤中的各營(yíng)養(yǎng)成分間均呈正相關(guān)，說明了各營(yíng)養(yǎng)成分之間具有促進(jìn)協(xié)同作用，對(duì)增強(qiáng)土壤肥力有重要意義。土壤內(nèi)微生物群落的數(shù)量及比例對(duì)植物的生長(zhǎng)非常重要，云木香根際土中的細(xì)菌數(shù)量與放線菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.897，這說明細(xì)菌與放線菌數(shù)量的適當(dāng)增加能保證云木香的健康生長(zhǎng)。細(xì)菌數(shù)量與酸性磷酸酶活性之間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.885；真菌數(shù)量與中性磷酸酶活性之間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.897；脲酶活性與堿性磷酸酶活性之間呈顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.862。

表5 相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis

續(xù)表

3 討論

分析本研究結(jié)果可知，外源混合接種不同的AMF 能影響云木香根際土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性和微生物群落數(shù)量。AMF 通過侵染作用與宿主植物根系形成叢枝結(jié)構(gòu)，這是其能與宿主植物形成良好共生關(guān)系的主要原因。共生關(guān)系體現(xiàn)在AMF 通過自身的生理代謝改善土壤環(huán)境，而宿主植物也能為AMF提供合適的寄生環(huán)境。

試驗(yàn)組中6 種不同的AMF 組合對(duì)云木香根際土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性以及微生物數(shù)量產(chǎn)生的影響不同。與CK組相比，A、B處理組的孢子密度略有下降，而其余處理組均有不同程度地增加，這與何敏紅發(fā)現(xiàn)接種AMF 能顯著提高構(gòu)樹種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)下及種間競(jìng)爭(zhēng)下孢子密度結(jié)果一致［19］。但A、B 組孢子密度下降同時(shí)也表明根際土壤中孢子密度的變化與接種的AMF 組成有關(guān)，混合過多AMF 可能會(huì)增強(qiáng)種間競(jìng)爭(zhēng)而抑制根際土中孢子數(shù)量的增加。所有接種AMF 的處理組侵染率都達(dá)到100%，與谷文超等［20］研究結(jié)果相符，表明其與云木香根系形成了良好的菌根體系。在土壤養(yǎng)分的變化中，部分處理組速效氮與有機(jī)磷上升較為明顯，其中E 處理組速效氮含量上升近2倍，有機(jī)磷含量上升也最明顯。此外，與CK 組相比，有機(jī)碳和有機(jī)質(zhì)含量增加，試驗(yàn)組土壤pH 變化不明顯，整體呈現(xiàn)弱酸性水平。土壤中的細(xì)菌可以參與土壤氨化作用和有機(jī)質(zhì)的分解；而放線菌能分解土壤中的有機(jī)物且能分泌抗生素，拮抗土壤中的病原菌，保護(hù)植株健康生長(zhǎng)；真菌則可以參與腐殖質(zhì)的形成、有機(jī)質(zhì)的分解和土壤氨化作用等。外源混合接種AMF 后，云木香根際土壤微生物數(shù)量總體表現(xiàn)為放線菌＞細(xì)菌＞真菌。雖然三種微生物數(shù)量比CK 組均有增加，但細(xì)菌和放線菌增加最為明顯，也是優(yōu)勢(shì)群落。細(xì)菌和放線菌數(shù)量的顯著增加能改善土壤群落結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)植物激素、抗生素等的合成，對(duì)于云木香健康生長(zhǎng)及抗逆性的增強(qiáng)有重要意義。土壤養(yǎng)分含量與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)與周游等［9］對(duì)接種不同AMF 后的滇重樓土壤環(huán)境研究結(jié)果一致。土壤酶活性變化是植物生長(zhǎng)過程中十分重要的指標(biāo)，試驗(yàn)測(cè)定的各種酶活性總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。蔗糖酶、磷酸酶和脲酶活性的增加表明AMF 能促進(jìn)有機(jī)物的轉(zhuǎn)化，也能加快土壤中含氮化合物和含磷化合物的降解，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供了充足的氮素和磷素。而過氧化氫酶的分解作用能使云木香免受H2O2的毒害。相關(guān)性分析中，土壤養(yǎng)分的速效氮和速效磷與有機(jī)質(zhì)和有機(jī)碳含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，表明土壤養(yǎng)分相互之間影響非常顯著，這對(duì)于云木香的生長(zhǎng)培育非常有利。

綜上所述，混合接種不同AMF 能顯著影響云木香根際土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性以及微生物群落結(jié)構(gòu)，混合接種不同的AMF 對(duì)云木香各項(xiàng)指標(biāo)產(chǎn)生的影響有所不同。因此，應(yīng)根據(jù)云木香生長(zhǎng)培育的不同需求及栽培環(huán)境的不同，選擇接種不同的AMF組合以達(dá)到理想效果。上述研究成果能為藥用植物云木香的生長(zhǎng)及AMF 資源利用提供一定的理論依據(jù)。