劉明強(qiáng),陳海偉,張廣智,康學(xué)文*
1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科,蘭州 730030;2甘肅省骨與關(guān)節(jié)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730030
下腰痛(low back pain,LBP)是一種常見(jiàn)疾病,全世界約80%的人在其一生中出現(xiàn)過(guò)LBP的癥狀,引起LBP的原因主要有脊柱病變、軟組織病變、神經(jīng)病變及非特異性疼痛等。研究發(fā)現(xiàn),椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration,IDD)引起的椎間盤(pán)突出和椎管狹窄可能是導(dǎo)致LBP的最主要原因,給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。椎間盤(pán)組織由中心膠凍狀的髓核、外圍的纖維環(huán)和椎體上下緣的軟骨終板(cartilage endplate,CEP)組成。髓核位于椎間盤(pán)的中心位置,主要由富含Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)組成,是椎間盤(pán)承載和緩沖壓力載荷的重要功能成分[2],在IDD過(guò)程中髓核最先發(fā)生改變。目前對(duì)IDD的治療僅可緩解患者的臨床癥狀,不能延緩或逆轉(zhuǎn)IDD的進(jìn)程。因此,尋找新的更有效的IDD治療方法一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3-4]。
近年來(lái),隨著對(duì)干細(xì)胞療法、基因靶向治療及組織工程等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入研究,外泌體對(duì)骨科疾病的治療價(jià)值越來(lái)越受到關(guān)注[5-7]。來(lái)源于干細(xì)胞及其他細(xì)胞的外泌體是一類可以包裹多種生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等的細(xì)胞外囊泡[8]。外泌體容易獲得,無(wú)免疫原性且與靶細(xì)胞具有獨(dú)特的親和性,可參與機(jī)體多種病理生理過(guò)程,如細(xì)胞凋亡、異常血管生成、炎癥反應(yīng)、凝血反應(yīng),以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA等物質(zhì)的轉(zhuǎn)移,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞通信和表觀遺傳修飾,目前已被應(yīng)用于IDD的重塑研究[9]。本文就不同細(xì)胞來(lái)源外泌體的生物學(xué)特性和功能及其在IDD治療中的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述,以期為后續(xù)研究提供新的思路。
幾乎所有細(xì)胞都可在正常和異常狀態(tài)下釋放細(xì)胞外囊泡到細(xì)胞外空間。細(xì)胞外囊泡是被磷脂雙層膜包圍的小顆粒,根據(jù)其生物發(fā)生途徑、大小、蔗糖密度梯度、脂質(zhì)組成、沉降力和內(nèi)容物可分為微囊泡、凋亡小體與外泌體[10]。微囊泡和凋亡小體主要通過(guò)細(xì)胞膜出芽的方式形成。外泌體來(lái)源于細(xì)胞內(nèi),主要是由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的多泡體(multivesicular bodies,MVBs)與細(xì)胞膜融合,并向外釋放其包含的腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles,ILVs),這些被釋放到細(xì)胞外的ILVs即外泌體[11-12]。三種細(xì)胞外囊泡的主要特征如表1所示。
表1 細(xì)胞外囊泡的分類及主要特征Tab.1 Classification and main characteristics of extracellular vesicles
外泌體是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的參與細(xì)胞間通訊的納米級(jí)膜狀囊泡,呈膜性扁平狀,由干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞分泌,可通過(guò)超速離心、密度梯度離心、聚乙二醇沉淀等方法提取,并可用納米粒子跟蹤分析、動(dòng)態(tài)光散射、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行鑒定[19]。外泌體廣泛存在于血液、唾液、精液、滑液、羊水、母乳及體外的細(xì)胞培養(yǎng)基中,可通過(guò)有效轉(zhuǎn)運(yùn)生物活性蛋白、信使核糖核酸(mRNA)和微核糖核酸(miRNA)在細(xì)胞間通訊和組織再生調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]。
外泌體的功能主要取決于其內(nèi)容物,不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體包裹的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、細(xì)胞因子等生物活性成分的含量和種類不同,其中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸是外泌體中的主要功能成分。脂質(zhì)膜可促進(jìn)受體細(xì)胞對(duì)外泌體的吸收,并阻止其內(nèi)容物在運(yùn)輸過(guò)程被損壞,如保護(hù)miRNA免受RNA酶的降解,參與調(diào)控靶細(xì)胞的信息傳遞。外泌體中包含一系列蛋白質(zhì),如四次跨膜蛋白、熱休克蛋白及與外泌體來(lái)源相關(guān)的Tetraspanins蛋白等,這些蛋白可參與膜運(yùn)輸及融合,并可作為表面標(biāo)志物用于鑒定體外外泌體[21]。外泌體可轉(zhuǎn)運(yùn)核酸,如mRNA、非編碼RNA,成熟的miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因mRNA結(jié)合可抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯。此外,外泌體還可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、促進(jìn)自噬、促進(jìn)血管生成及調(diào)節(jié)免疫功能。綜上,外泌體的主要功能可能是通過(guò)保護(hù)并運(yùn)輸其內(nèi)容物而介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊[22]。
隨著人口的老齡化,IDD已成為臨床多發(fā)疾病,且近年來(lái)其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。IDD是導(dǎo)致中老年人腰腿疼痛的主要原因之一,但其具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚,是當(dāng)前臨床亟待解決的一大難題?,F(xiàn)有的研究表明,IDD的發(fā)病機(jī)制與炎性因子的累積、ECM的異常分解代謝、細(xì)胞凋亡等關(guān)系密切[23]。外泌體作為細(xì)胞間相互調(diào)控的囊泡,主要通過(guò)其內(nèi)容物調(diào)控基因的表達(dá)及細(xì)胞功能,從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD的發(fā)生與發(fā)展。
Lu等[24]將來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體與退變的髓核細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞增殖明顯增加;蛋白聚糖及Ⅱ型膠原等ECM的表達(dá)量與共培養(yǎng)時(shí)間呈正比,退變相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖及維持ECM平衡。
髓核細(xì)胞過(guò)度凋亡是IDD的主要病理特征。將尿液干細(xì)胞來(lái)源的不同濃度的外泌體與壓力載荷誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞共培養(yǎng),采用Western blotting及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,髓核細(xì)胞凋亡率隨外泌體濃度的增加而降低[25]。Luo等[26]分別用正常與退變終板軟骨干細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞,結(jié)果顯示,與退變終板軟骨干細(xì)胞來(lái)源的外泌體比較,正常終板軟骨干細(xì)胞來(lái)源的外泌體明顯降低了凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)以及TUNEL染色陽(yáng)性率,增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Zhang等[27]的研究發(fā)現(xiàn),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)與外泌體共處理組髓核細(xì)胞中NLRP3、caspase-1和cleaved GSDMD的表達(dá)水平明顯低于脂多糖單獨(dú)誘導(dǎo)組。上述研究結(jié)果提示外泌體可減輕髓核細(xì)胞的凋亡反應(yīng)。
此外,外泌體在治療IDD的其他方面也發(fā)揮了重要作用。例如干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可降低CEP細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、7、9及鈣化相關(guān)蛋白runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達(dá),即外泌體可抑制CEP細(xì)胞的凋亡和鈣化反應(yīng)[22]。脊索細(xì)胞來(lái)源的外泌體可抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管管道的形成,且抑制效果與外泌體的給藥劑量呈正比;將非退變纖維環(huán)細(xì)胞外泌體與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果顯示外泌體可降低內(nèi)皮細(xì)胞的遷移速度。由此可見(jiàn),外泌體可抑制椎間盤(pán)組織中異常血管再生,延緩IDD的發(fā)生[28-29]。干細(xì)胞來(lái)源的外泌體減少了H2O2誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞炎性因子[一氧化氮合酶(iNOS)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)]的表達(dá),提示外泌體可減輕炎癥反應(yīng)[30]。
IDD的主要特征是異常應(yīng)力、炎癥反應(yīng)等不利因素的刺激引起髓核細(xì)胞數(shù)量減少和ECM降解。外泌體通過(guò)促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖,抑制髓核細(xì)胞凋亡/焦亡、椎間盤(pán)異常血管增生以及炎性因子的產(chǎn)生而增加有活性髓核細(xì)胞的數(shù)量,改善椎間盤(pán)的炎癥微環(huán)境。因此,外泌體可能是延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD的潛在選擇。
3.1 促進(jìn)干細(xì)胞向類軟骨樣髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化 近年來(lái),促進(jìn)干細(xì)胞向類軟骨樣髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化是IDD治療研究的一個(gè)重要方向。將正常髓核細(xì)胞來(lái)源的外泌體與干細(xì)胞共培養(yǎng),檢測(cè)干細(xì)胞中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原基因和蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原等ECM的表達(dá)量與共培養(yǎng)時(shí)間呈正比,即共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),ECM的表達(dá)量越多,提示髓核細(xì)胞來(lái)源的外泌體可誘導(dǎo)干細(xì)胞向類軟骨樣髓核細(xì)胞分化,從而促進(jìn)有活性的髓核細(xì)胞數(shù)量增加,維持ECM的穩(wěn)態(tài)[24,31-32]。
3.2 抑制炎癥反應(yīng) 研究發(fā)現(xiàn),炎性小體可通過(guò)增加IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)MMP、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTs)的產(chǎn)生而水解蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等ECM成分,進(jìn)而參與IDD的病理過(guò)程[33]。外泌體可明顯抑制炎癥反應(yīng)及炎性小體的形成。Xia等[30]的研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞來(lái)源的外泌體與H2O2共處理組炎性因子環(huán)氧化酶-2(COX-2)、iNOS和炎性小體TXNIP-NLRP3的蛋白和mRNA表達(dá)水平高于空白對(duì)照組,低于H2O2單獨(dú)處理組,提示干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)抑制炎性小體的形成來(lái)發(fā)揮抗炎作用,從而下調(diào)ECM降解蛋白酶的表達(dá),減緩ECM的分解代謝反應(yīng),維持ECM的穩(wěn)態(tài),延緩IDD的進(jìn)程。
3.3 抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖 IDD主要是因細(xì)胞死亡導(dǎo)致髓核細(xì)胞數(shù)量減少及ECM降解,異常應(yīng)力、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等不利因素刺激可引起細(xì)胞死亡,而凋亡是髓核細(xì)胞死亡的主要形式。因此,IDD的治療應(yīng)以抑制髓核細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖為主。
錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積、Ca2+的消耗及氧化還原狀態(tài)的改變可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激反應(yīng),引起細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),在壓力負(fù)荷或糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡模型中加入干細(xì)胞來(lái)源的外泌體后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、GRP94)、激活作用轉(zhuǎn)錄因子(ATF6)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的凋亡調(diào)節(jié)因子(CHOP)表達(dá)降低,未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的分支蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇依賴性激酶1α(IRE1α)的磷酸化水平降低,而蛋白激酶B(AKT)和細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平升高,髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、12的表達(dá)明顯降低,提示干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)激活A(yù)KT、ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[25,34]。
3.4 通過(guò)miRNA調(diào)控椎間盤(pán)組織修復(fù) miRNA是一類長(zhǎng)度不超過(guò)20個(gè)堿基的非編碼RNA,是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后抑制因子。miRNA主要是與靶基因mRNA的3'UTR通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯來(lái)進(jìn)行基因表觀遺傳學(xué)修飾,沉默靶基因的表達(dá)或調(diào)控多個(gè)疾病相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[35]。骨髓、胎盤(pán)來(lái)源的外泌體可改變椎間盤(pán)組織中多種miRNA的表達(dá)水平,尤其是一些調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵miRNA分子,是外泌體應(yīng)對(duì)組織損傷和修復(fù)的有效調(diào)節(jié)因子。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miRNA在延緩IDD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用,miRNA的表達(dá)譜與髓核細(xì)胞的增殖、凋亡,炎癥反應(yīng),以及ECM重塑等明顯相關(guān);但miRNA在椎間盤(pán)組織間隙容易被降解,而外泌體的遞送可通過(guò)保護(hù)miRNA不被降解來(lái)改善miRNA的短期穩(wěn)定性[36]。因此,不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體包裹的miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞功能參與椎間盤(pán)的修復(fù)及重塑,是外泌體治療IDD的潛在機(jī)制[37]。具體如表2所示。
表2 外泌體中miRNA在IDD治療中的研究Tab.2 Studies on miRNA in exosomes in the treatment of intervertebral disc degeneration
Zhang等[38]的研究發(fā)現(xiàn),自噬激活髓核細(xì)胞來(lái)源外泌體包裹的miR-27a可與MMP13靶向結(jié)合而降低MMP1、3、9、13以及ADAMTs 4、5基因的表達(dá),增加蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)以維持ECM的穩(wěn)態(tài)。Zhu等[40]發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可顯著減輕ECM降解及髓核細(xì)胞凋亡,且主要是外泌體中miR-532-5p通過(guò)下調(diào)RASSF5基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的;雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示,miR-532-5p含有野生型RASSF5基因3'UTR的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),表明野生型RASSF5是miR-532-5p的直接靶基因。Zhu等[37]研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體中的miR-142-3p可通過(guò)下調(diào)混合譜系激酶3(MLK3)的表達(dá)來(lái)調(diào)控髓核細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng),顯著降低TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12等炎性因子的表達(dá)及髓核細(xì)胞凋亡率;通過(guò)miRNA靶標(biāo)分析工具(TargetScan)分析發(fā)現(xiàn),miR-142-3p可與野生型MLK3的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),外泌體中的miR-142-3p可通過(guò)靶向結(jié)合MLK3而降低IL-1β誘導(dǎo)的p38、JNK、ERK的磷酸化水平,即外泌體中miR-142-3p通過(guò)靶向結(jié)合MLK3來(lái)抑制MAPK信號(hào)通路的激活,從而延緩IDD的發(fā)生與發(fā)展。
Cheng等[41]的研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體中的miR-21可與PTEN靶向結(jié)合并下調(diào)其表達(dá),從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),沉默PTEN基因后磷酸化的AKT表達(dá)增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào),而凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)明顯下調(diào),提示外泌體包裹miR-21可靶向抑制PTEN基因的表達(dá),從而激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而抑制髓核細(xì)胞的凋亡。
此外,Xie等[22]使用H2O2誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞建立退變模型發(fā)現(xiàn),與H2O2單獨(dú)誘導(dǎo)組相比,使用間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體與H2O2誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞共處理,可明顯下調(diào)終板軟骨干細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、7、9及鈣化相關(guān)蛋白R(shí)unx2和BMP-2的表達(dá);生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),外泌體中miR-31-5p水平明顯升高,且可靶向結(jié)合并抑制ATF6基因的表達(dá),提示外泌體中miR-31-5p通過(guò)下調(diào)ATF6的表達(dá)來(lái)減輕終板軟骨細(xì)胞的凋亡和鈣化。
綜上,不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體主要是通過(guò)其包裹的miRNA與相應(yīng)的靶基因結(jié)合而抑制炎癥、凋亡相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮延緩IDD的作用,提示外泌體中包裹的miRNA可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的潛在機(jī)制。外泌體作為一種潛在的促進(jìn)椎間盤(pán)修復(fù)的細(xì)胞外囊泡,其作用機(jī)制可能是包含的內(nèi)容物通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因及相關(guān)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗炎、抗凋亡、維持ECM穩(wěn)態(tài)的作用,然而具體調(diào)節(jié)機(jī)制尤其是外泌體促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不明確,仍需進(jìn)一步研究。
多項(xiàng)研究表明,外泌體參與并減輕了IDD的多種病理生理過(guò)程,但其延緩或治療IDD的作用機(jī)制仍不明確。盡管外泌體可通過(guò)其內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)胞間通訊和表觀遺傳修飾,調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的功能,從而恢復(fù)有活性的髓核細(xì)胞數(shù)量,維持ECM穩(wěn)態(tài),減輕炎癥反應(yīng),但其應(yīng)用于IDD的治療仍存在諸多挑戰(zhàn)。如外泌體提純、靶向運(yùn)輸、給藥劑量、給藥方式,以及外泌體的細(xì)胞來(lái)源、生長(zhǎng)狀態(tài)和培養(yǎng)條件等均可影響外泌體的作用;椎間盤(pán)作為體內(nèi)最大的無(wú)血管組織,承載著持續(xù)的壓力負(fù)荷,椎間盤(pán)組織中高滲、低氧、低pH、低營(yíng)養(yǎng)的微環(huán)境不利于髓核細(xì)胞的增殖和外泌體的穩(wěn)定[42];一些外泌體可能通過(guò)其包裹的非編碼RNA沉默髓核細(xì)胞中有利基因的表達(dá)而加速IDD的發(fā)生[43]。然而隨著對(duì)椎間盤(pán)及外泌體研究的不斷深入,外泌體在IDD治療中的應(yīng)用前景將更加廣闊。