胡昌坤，張雪梅，馬增春，高 月

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.廣東藥科大學(xué)，廣州 510006)

電離輻射在科技日益發(fā)展的今天應(yīng)用于許多領(lǐng)域(科研、醫(yī)學(xué)、軍事、工業(yè))，對(duì)于長(zhǎng)期在輻射環(huán)境下的工作人員，低劑量電離輻射(low dose radiation, LDR)也是一個(gè)重要的影響健康的因素[1]，美國(guó)國(guó)家輻射防護(hù)和測(cè)量委員會(huì)(NCRP)在2020年發(fā)布的一份題為“整合輻射生物學(xué)和流行病學(xué)的信息以加強(qiáng)低劑量健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法”的報(bào)告，足以證明對(duì)低劑量引起健康風(fēng)險(xiǎn)的重視[2]。

近幾年來(lái)關(guān)于低劑量輻射致癌的報(bào)告[3]，以及LDR機(jī)制的研究普遍認(rèn)為L(zhǎng)DR誘導(dǎo)的反應(yīng)與高劑量電離輻射(how dose radiation, HDR)誘導(dǎo)的反應(yīng)不同，存在著獨(dú)特的生理機(jī)制[4]，除了癌癥，低劑量還會(huì)帶來(lái)組織反應(yīng)和非癌癥健康影響(如白內(nèi)障、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和循環(huán)系統(tǒng)疾病)等一系列不確定性的健康風(fēng)險(xiǎn)，有證據(jù)表明，0.5 Gy以下的劑量也可能增加心血管疾病的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。所以對(duì)于輻射生物學(xué)領(lǐng)域來(lái)說(shuō)最具爭(zhēng)議的就是關(guān)于低劑量輻射的生物效應(yīng)的探討和研究。免疫系統(tǒng)對(duì)于機(jī)體是抵御外界侵入的重要防御系統(tǒng)之一[7]，腸道作為人體最大的免疫器官，是人體防御外界侵入的第一道防線[8]，放射性腸損傷一直以來(lái)以急性腸損傷研究較多[9]，但是目前鮮有對(duì)于LDR腸道損傷相關(guān)的研究[10]，因此建立低劑量輻射小鼠腸道損傷模型對(duì)于預(yù)防低劑量輻射藥物的研發(fā)與評(píng)價(jià)具有重要的研究意義。本文通過(guò)比較不同低劑量輻射下小鼠腸道相關(guān)損傷指標(biāo)的變化，以此篩選出LDR腸道小鼠損傷最優(yōu)照射劑量。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠40只，6周齡，18～22 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組(NC)、低劑量組(L組，0.04 Gy/d×5 d，累積0.2 Gy)、中劑量組(M組，0.12 Gy/d×5 d，累積0.6 Gy)、高劑量組(H組，0.2 Gy/d×5 d，累積1.0 Gy)，每組10只小鼠。

1.2 輻射源及主要儀器

60Co γ射線照射源為軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，單次照射劑量率為 3.01 cGy/min；PE VictorX 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Perkin Elmer公司；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Sysmex2000i)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0131 M)、SOD活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0101 M)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C1088)均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于酶免生物技術(shù)有限公司，γ-H2AX購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1照射方法

每天將小鼠置于離照射源最長(zhǎng)距離(4 m)處，并用鉛磚全身屏蔽，以達(dá)到照射裝置最低劑量率，3種劑量分別連續(xù)照射5天。

1.4.2體重

照射前1天及每天照射后立即對(duì)小鼠稱(chēng)重。

1.4.3臟器指數(shù)

照射后24小時(shí)取小鼠脾臟和胸腺稱(chēng)重并計(jì)算臟器指數(shù)。

1.4.4外周血

照射結(jié)束后24小時(shí)鼠眼球取血，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Sysmex2000i)測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、 血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)等指標(biāo)。

1.4.5小腸組織MDA含量、SOD活性

照射結(jié)束后24小時(shí)取小鼠空腸組織勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA含量、SOD活性。

1.4.6小腸組織細(xì)胞因子含量

照射結(jié)束后24小時(shí)取小鼠空腸組織勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6細(xì)胞因子含量。

1.4.7小腸組織DNA損傷

照射結(jié)束后2小時(shí)取小鼠十二指腸固定并制作成石蠟切片，石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、標(biāo)記、顯色、復(fù)染等處理，進(jìn)行免疫熒光γ-H2AX抗體染色觀察小腸組織DNA損傷。

1.4.8TUNEL法檢測(cè)小腸組織細(xì)胞凋亡

采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、標(biāo)記、顯色、復(fù)染等處理，熒光染色觀察小腸組織細(xì)胞凋亡情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±單次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)差表示，NC組與 L、M、H組之間采用t檢驗(yàn)，L、M、H 組之間比較采用單因素方差分析。以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表使用Prism8.0制作。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 低劑量輻射對(duì)小鼠外周血象的影響

對(duì)外周血象實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果列于表1。由表1可見(jiàn)，與對(duì)照組(NC)相比，照射組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)均有所降低，其中H組有顯著性差異(p<0.01)，照射組血小板計(jì)數(shù)(PLT)均有所降低，L、M組顯著降低(p<0.05)，RBC、HGB、HCT亦有不同程度升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，3種劑量照射后24小時(shí)均對(duì)小鼠造血系統(tǒng)有不同程度損傷。

表1 各組小鼠照射后外周血象的變化Tab.1 Effects of low dose radiation on peripheral blood cells of mice

2.2 低劑量輻射對(duì)小鼠體重的影響

圖1為各組小鼠照射期間體重的變化。由圖1可見(jiàn)，小鼠照射期間體重變化與對(duì)照組相比，照射組體重有所降低，其中M組體重降低最多，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組小鼠照射期間體重的變化Fig.1 Changes in body weight afterirradiation in each group

2.3 低劑量輻射對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

圖2為照后24小時(shí)各組小鼠臟器指數(shù)的變化。由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組(NC)相比，照射組脾臟指數(shù)(SI)均顯著性降低(L組p<0.05，M、H組p<0.01)，胸腺指數(shù)(TI)均有所降低但沒(méi)有顯著性差異。

*與對(duì)照組(NC)相比p<0.05；**與對(duì)照組(NC)相比p<0.01；n=6。圖2 各組小鼠照射后臟器指數(shù)的變化Fig.2 Changes of viscera index afterirradiation in each group

2.4 低劑量輻射對(duì)小鼠小腸組織SOD活性、MDA含量的影響

照射結(jié)束后24小時(shí)測(cè)定空腸組織中MDA含量、SOD活性，結(jié)果列于表2。由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組(NC)相比，照射組小腸組織MDA含量明顯上升(L組p<0.05，M、H組p<0.01)，SOD活性有不同程度降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 低劑量輻射對(duì)小鼠小腸組織細(xì)胞因子的影響

照射結(jié)束后24小時(shí)測(cè)定小鼠空腸組織細(xì)胞因子，結(jié)果示于圖3。由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，各照射組中TNF-α、IL-2、IL-1β和IL-6作為代表性的促炎因子與照射劑量呈劑量依賴(lài)性升高，其中M、H組中IL-1β、IL-6、TNF-α升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-1β：M、H組p<0.05，IL-2：M組p<0.05、H組p<0.01，TNF-α：M、H組p<0.05)。

表2 照射后各組小鼠小腸組織中MDA含量、SOD活性Tab.2 MDA content and SOD activity in smallintestine of irradiated mice

*與對(duì)照組(NC)相比p<0.05；**與對(duì)照組(NC)相比p<0.01；n=6。圖3 照射后各組小鼠小腸組織中細(xì)胞因子的變化Fig.3 The expression of Cytokines in intestinaltissues of mice in each group

2.6 低劑量輻射對(duì)小鼠小腸組織DNA損傷程度

在照射結(jié)束后2小時(shí)對(duì)小鼠十二指腸進(jìn)行γ-H2AX熒光染色，觀察DNA損傷程度，結(jié)果示于圖4。由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，照射組中小腸組織有明顯的DNA損傷，其中M和H組中損傷現(xiàn)象最為嚴(yán)重，主要集中于小腸隱窩部位，L組有相對(duì)較輕的損傷改變。

圖4 照射后各組小腸組織DNA損傷變化(DAPI：細(xì)胞染色，Merge：雙色整合)Fig.4 Changes of DNA damage in small intestine of mice after irradiation

圖5 照射后各組小鼠小腸組織細(xì)胞凋亡程度(DAPI：細(xì)胞染色，Merge：雙色整合)Fig.5 The degree of cell apoptosis in small intestine tissue of mice after irradiation

2.7 低劑量輻射對(duì)小鼠小腸組織細(xì)胞凋亡的影響

在照射結(jié)束后24小時(shí)對(duì)小鼠十二指腸進(jìn)行TUNEL熒光染色，觀察細(xì)胞凋亡程度，結(jié)果示于圖5。由圖5可見(jiàn)，與對(duì)照組(NC)相比，照射組中小腸組織有明顯細(xì)胞凋亡，其中M組和H組最為嚴(yán)重。

3 討論

目前所認(rèn)知的HDR損傷具有全身效應(yīng)，對(duì)于機(jī)體全身各個(gè)器官都有不同損傷。然而LDR相對(duì)于HDR有自己獨(dú)特的作用機(jī)制[11]，近年來(lái)低劑量輻射誘導(dǎo)的生物效應(yīng)(細(xì)胞間介質(zhì)、炎癥和免疫反應(yīng)、癌癥和非癌癥誘導(dǎo))都與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[12-14]。Flockerzi等人[15]對(duì)具有不同修復(fù)能力的小鼠品系的研究表明，分次低劑量輻射(每天100 mGy)會(huì)增加DNA損傷，累積劑量會(huì)影響肺實(shí)質(zhì)中的復(fù)制和凋亡，從而影響肺功能。Cheda等人[16-18]已經(jīng)證明LDR可以通過(guò)改變免疫細(xì)胞群和細(xì)胞因子釋放以及增強(qiáng)先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的相互作用來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。Tada[19]也提出長(zhǎng)期LDR可對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整體、組織、細(xì)胞及基因水平產(chǎn)生影響，導(dǎo)致多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生。腸道作為人體最大的免疫器官，放射性腸損傷作為經(jīng)典放射性損傷特征之一是輻射損傷熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[20]。然而對(duì)于LDR腸道損傷國(guó)內(nèi)外研究較少，所以我們此次研究LDR對(duì)于小鼠腸道損傷的影響對(duì)LDR腸道損傷相關(guān)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

本文主要從腸道輻射免疫損傷調(diào)控機(jī)理中三個(gè)方面：DNA損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子以及其他一些經(jīng)典指標(biāo)(臟器指數(shù)，外周血象等)探討低劑量輻射對(duì)小鼠腸道損傷的影響，前期大量的研究已經(jīng)證明輻射會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，可以通過(guò)生物學(xué)指標(biāo)改變的方法來(lái)測(cè)定[21]。γ-H2AX作為DNA損傷指標(biāo)測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)[22]，我們用γ-H2AX免疫熒光來(lái)評(píng)價(jià)不同劑量下腸道早期DNA損傷程度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組(NC)，M、H組小腸組織DNA損傷最為明顯。細(xì)胞凋亡是機(jī)體免疫損傷的標(biāo)志之一，關(guān)于凋亡的機(jī)理已有諸多研究[23-24]，通過(guò)測(cè)定小腸組織細(xì)胞凋亡程度來(lái)反映腸道免疫系統(tǒng)損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組(NC)，M、H組小腸組織細(xì)胞凋亡最為明顯。細(xì)胞因子(cytokine)是由免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能的多肽分子[25-26]，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等起著重要作用，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究表明，低劑量全身外照射可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，影響機(jī)體免疫功能[27]，通過(guò)測(cè)定小腸組織中炎癥細(xì)胞因子的變化來(lái)觀察腸道損傷程度。結(jié)果表明，相比于對(duì)照組(NC)，M、H組細(xì)胞因子有明顯上升趨勢(shì)并有相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本文通過(guò)比較小鼠照射前后體重、臟器指數(shù)、MDA含量、SOD活性、DNA損傷、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)的變化，最終確定低劑量輻射小鼠腸道損傷模型的最佳照射方案為每天照射0.12 Gy連續(xù)照射5天累積0.6 Gy。本實(shí)驗(yàn)為低劑量輻射腸道損傷評(píng)價(jià)提供了新的科學(xué)依據(jù)與方法，后續(xù)研究用此照射劑量和方法進(jìn)一步進(jìn)行低劑量輻射藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。