孫萬里 郭玉琪 王月 李養(yǎng)軍 楊振華 張衛(wèi)東 曹楊 任云霞

結核病(Tuberculosis，TB)是由致病菌結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染所引起的呼吸道系統(tǒng)慢性傳染疾病，MTB是一種兼性細胞內(nèi)寄生菌，機體感染MTB時，誘導巨噬細胞自噬與凋亡，自噬是巨噬細胞清除病原體的一種防御機制[1-3]。因此，深入研究BCG感染引起巨噬細胞凋亡、自噬的作用機制，有助于提高巨噬細胞對藥物的敏感性，為結核病治療靶標的研究提供依據(jù)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類由脯氨酸介導的絲氨酸/蘇氨酸活性的蛋白激酶，是介導信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)導通路之一，在細胞增殖、分化、遷移、凋亡等生理過程中發(fā)揮作用，c-JunN 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)為MAPK通路蛋白之一，目前有多項研究表明 MAPK 信號家族在細胞或動物試驗的自噬各階段發(fā)揮重要作用[4-5]。郭偉偉等[6]構建新生大鼠缺血再灌注(I/R)模型，過表達miRNA-138后發(fā)現(xiàn)，p-p38/p38、p-c-jun/c-jun 及 p-JNK1/2/JNK1/2顯著下調(diào)，表明miRNA-138可通過抑制JNK/p38 MAPK通路，抑制大鼠心肌細胞的凋亡，并減輕活性氧損傷，從而保護新生大鼠心肌細胞。賴華毅等[7]研究表明， 鼠傷寒沙門氏菌spvB基因?qū)δc上皮細胞自噬的抑制作用，可能與其對細胞p38MAPK通路的負調(diào)控相關。但JNK/MAPK通路對結核桿菌感染的巨噬細胞凋亡、自噬的作用報道較少，因此，本研究通過構建卡介苗菌株(Bacillus calmette guerin,BCG) 感染的巨噬細胞模型，探索JNK/MAPK通路在BCG 感染的巨噬細胞中的作用機制，以期為臨床結核病的防治提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、實驗材料

小鼠巨噬細胞 RAW264.7由中科院上海細胞庫提供；BCG菌株由上海生物制品研究所提供；JNK抑制劑SP600125 購自Sigma公司；FBS胎牛血清、DMSO、青霉素、鏈霉素購自美國Invitrogen公司；0.25%EDTA胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；Middlebrook 7H10培養(yǎng)基購自美國BD公司；噻唑藍(MTT)試劑盒；BCA試劑盒、ECL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；兔抗鼠p38MAPK、JNK、ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2、LC3、Beclin-1、P62單克隆抗體購自美國CST公司，β-actin、HRP 標記羊抗兔 IgG 抗體購自北京中杉金橋公司。

二、實驗方法

1 細胞培養(yǎng)與建立細胞感染模型

BCG接種在Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，調(diào)整菌體濃度，RAW264.7細胞調(diào)整至相同密度，將對數(shù)生長期的細胞按4×106個/mL接種至六孔板中，待各組細胞貼壁且生長狀態(tài)良好，按照細胞：BCG菌個數(shù)=1 ∶10的比例，將BCG加入各組細胞孔內(nèi)，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 細胞干預及分組

實驗分為4組，即對照組、BCG組、對照+SP600125、BCG+SP600125，通路抑制劑SP600125組即RAW264.7細胞預先用含10 μmol/L SP600125的培養(yǎng)液預處理1 h后，再將BCG與RAW264.7細胞共培養(yǎng)12h，繼續(xù)后續(xù)實驗。

3 實時熒光定量(Real-time quantification PCR，RT-qPCR)實驗檢測Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA水平

采用實時熒光定量(Real-time quantification PCR，RT-qPCR)檢測1.2.3各組細胞及HCV29細胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA相對表達量。以β-actin為內(nèi)參，反應體系為15μL，2×SYBR Mix 8μL，上下游引物各 0.5μL，cDNA模板2μL，去離子水4μL，反應條件：95℃，120s；95℃，30s；60℃，75s；95℃，15s共40個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法分別計算Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA相對表達量。Bax、Bcl-2、caspase-3、β-actin引物序列(見表1)。

表1 Bax、Bcl-2、caspase-3和β-actin引物序列

4 吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)染色觀察自噬

吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)染色檢測各處理組細胞自噬率，將以上各組細胞吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，加入2μL的AO/EB溶液，各含AO、EB的濃度分別為0.1mg/mL，室溫避光孵育15min，加入500μL PBS洗滌2～3次，熒光顯微鏡觀察細胞自噬。

5 噻唑藍比色法(MTT)檢測RAW264.7細胞存活率

將各組RAW264.7細胞，每孔加20 μL的MTT溶液，37℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，全自動酶標儀490 nm處測定吸光度OD值，實驗重復3次，細胞存活率(%)=(OD實驗組/OD空白對照組)×100%。

6 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組細胞用0.25%EDTA的胰酶溶液消化細胞，PBS洗滌2～3次后將細胞制成細胞懸液，加入 5 μl Annexin V-FITC 混合均勻，在4℃條件下避光孵育 20 min，再加 5 μL PI 染液，孵育 5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

7 免疫印跡法(Western blotting，WB)檢測JNK、p38MAPK、ERK1/2、LC3、Beclin-1、P62自噬相關蛋白表達

收集各組細胞，冷PBS洗滌去除BCG，加入2 ml細胞裂解液使蛋白充分裂解，離心取上清蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取50μg蛋白加入上樣緩沖液沸水煮5min，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，加5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入一抗p38MAPK、JNK、ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2、LC3、Beclin-1、P62和β-actin(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，室溫平衡后，TBST溶液漂洗，再加入HRP標記二抗(1 ∶500)，室溫避光孵育2h，使用ECL化學發(fā)光液暗室曝光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并對各條帶進行灰度分析，分析條帶實驗結果。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、 BCG誘導RAW264.7細胞中JNK、ERK1/2、p38MAPK蛋白表達水平

與對照組相比，BCG組RAW264.7細胞中ERK1/2、p38MAPK蛋白表達差異不明顯(P>0.05)，JNK蛋白及磷酸化表達水平顯著升高(P<0.05)；與BCG組相比，BCG+SP600125組ERK1/2、p38MAPK蛋白及磷酸化水平表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，JNK蛋白及磷酸化水平表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2，圖1)。

圖1 各組細胞中JNK、ERK1/2、p38MAPK蛋白表達

表2 BCG誘導RAW264.7細胞中JNK、p38MAPK蛋白表達水平

二、JNK/MAPK通路對BCG感染RAW264.7細胞自噬的影響

與對照組相比，BCG組RAW264.7細胞中橘、紅色熒光增多，自噬水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BCG組相比，BCG+SP600125組細胞中橘、紅色熒光減少，自噬水平著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組RAW264.7細胞自噬(×400)

三、JNK/MAPK通路對BCG感染RAW264.7細胞存活率的影響

與對照組相比，BCG組RAW264.7細胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BCG組相比，BCG+SP600125組存活率著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 NK/MAPK通路對BCG感染RAW264.7細胞存活率的影響

四、各組細胞Bax、Bcl-2、caspase-3表達水平情況

與對照組相比，BCG組RAW264.7細胞中Bax、caspase-3 mRNA表達水平顯著升高，Bcl-2 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BCG組相比，BCG+SP600125組Bax、caspase-3 mRNA表達顯著降低，Bcl-2 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

表4 各組細胞Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達水平情況

五、 JNK/MAPK通路對BCG感染RAW264.7細胞凋亡的影響

與對照組相比，BCG組RAW264.7細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BCG組相比，BCG+SP600125組凋亡率著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表5、圖3)。

圖3 各組RAW264.7細胞凋亡

表5 JNK/MAPK通路對BCG感染RAW264.7細胞凋亡的影響

六、JNK/MAPK通路對BCG感染RAW264.7細胞LC3、Beclin-1、P62蛋白表達的影響

與對照組相比，BCG組LC3、Beclin-1蛋白表達顯著升高，P62蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BCG組相比，BCG+SP600125組LC3、Beclin-1蛋白表達顯著降低，P62蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4、表6)。

圖4 各組細胞LC3、Beclin-1、P62蛋白表達電泳圖

表6 各組細胞LC3、Beclin-1、P62蛋白表達情況

討 論

MTB存在于被感染宿主巨噬細胞內(nèi)，可通過多種機制對巨噬細胞的凋亡進行調(diào)控，巨噬細胞凋亡對于MTB的生存至關重要，影響MTB的發(fā)生、發(fā)展及預后[8]。自噬是細胞維持自身穩(wěn)態(tài)的一種機制，在免疫反應中發(fā)揮重要作用，研究表明，細胞自噬具有清除MTB的作用，因此，研究巨噬細胞的凋亡、自噬，可以進一步明確MTB的致病機制，為MTB的治療提供新的治療方向[9-10]。

當機體感染MTB之后，巨噬細胞可以通過自身凋亡以殺死MTB，同時激活鄰近未被感染的巨噬細胞，來增強機體對MTB的殺傷力。本研究結果顯示，BCG感染巨噬細胞 RAW264.7后，細胞存活率降低，凋亡率升高，Bax、caspase-3表達水平增加，Bcl-2表達水平降低，表明BCG感染促進細胞凋亡，與姬文蘭等[11]研究結果一致。自噬是巨噬細胞中固有免疫和適應性免疫的重要組成部分，有利于細胞清除感染的病原體來減輕自身損傷，自噬與凋亡作為程序性死亡的兩種方式，二者既相互獨立，又緊密相連。LC3是自噬小體標志蛋白，LC3的水平高低可以反映細胞發(fā)生自噬的水平， Beclin-1 是抑癌基因 BECN1 表達的自噬相關標志物，p62為自噬活化過程中的一個調(diào)節(jié)分子，其表達水平與與自噬程度呈負相關[12-13]。本研究結果顯示，BCG感染巨噬細胞 RAW264.7后，細胞自噬水平升高，LC3、Beclin-1蛋白表達水平升高、P62蛋白表達水平降低，表明BCG感染增加巨噬細胞 RAW264.7發(fā)生自噬。然而BCG感染引起巨噬細胞凋亡與自噬的具體機制尚不清楚。

MAPK通路主要包括胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)，c-JunN 末端激酶(c-JunN -terminal kinase，JUK)及p38激酶(p38 kinase)[14]，在生長因子、細胞因子等刺激下，MAPK可通過蘇氨酸/酪氨酸雙位點磷酸化激活多種轉(zhuǎn)錄因子，對細胞的生長、分化等多項生理過程進行調(diào)控，多項研究表明，MAPK信號通路參與了凋亡與自噬的發(fā)生[15-16]。尹昭懿等[17]研究表明，中藥珍珠梅黃酮納米粒上調(diào)MAPK通路相關分子JNK,下調(diào)ERK的活性，抑制人肝癌HepG2細胞增殖，誘導細胞凋亡及自噬。Kang等[18]研究表明，飛燕草素通過誘導自噬和激活JNK/MAPK途徑而充當放射增敏劑，從而增強了非小細胞肺癌細胞的凋亡。本研究顯示BCG感染的RAW264.7細胞中ERK1/2、p38MAPK蛋白表達差異不明顯，JNK蛋白及磷酸化表達水平顯著升高，說明BCG感染主要影響RAW264.7細胞中JNK通路，不影響ERK1/2、p38MAPK通路，表明JNK通路在巨噬細胞抗MTB感染中具有重要作用。萬敏等[19]研究表明，在異丙腎上腺素誘導的心肌細胞中，鹽酸羥考酮能抑制JNK/p38 MAPK信號通路，而促進心肌細胞增殖，減少細胞凋亡，表明抑制JNK/MAPK通路具有抗細胞凋亡的作用。本研究使用通路抑制劑SP600125處理BCG感染的 RAW264.7細胞后，細胞存活率及Bcl-2表達水平增加，Bax、caspase-3表達水平及凋亡率下降，表明抑制JNK通路可減少BCG感染的 RAW264.7細胞凋亡，與先前報道一致。另外，使用通路抑制劑SP600125處理BCG感染的 RAW264.7細胞，細胞自噬水平下降，LC3、Beclin-1蛋白表達水平降低、P62蛋白表達水平升高，表明MAPK家族中的JNK/通路與BCG感染的 RAW264.7細胞自噬有關。

綜上，結核桿菌感染可抑制巨噬細胞增殖、誘導巨噬細胞凋亡與自噬，可能與激活JNK/MAPK通路有關。