閆悅欣 梁思怡 紀(jì)勝男 李麗麗 哈婧

摘要：為了解決提取效率低而導(dǎo)致的市售蓮子心含量項(xiàng)鮮有合格的問(wèn)題，對(duì)蓮子心飲片中有效成分的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。分別對(duì)蓮心堿的提取方式、提取溶劑以及提取溶劑體積進(jìn)行了考察，利用優(yōu)化后的提取方法制備蓮子心飲片供試品溶液，選用Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×150 mm）色譜柱，以乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（體積比55∶44∶1）為流動(dòng)相，在流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，進(jìn)樣量為10 μL條件下，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，最佳的提取條件為選擇25 mL 0.08%鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑，超聲提取40 min;優(yōu)化后的提取方法使蓮心堿的含量測(cè)定較穩(wěn)定，蓮心堿的提取效率得到顯著的提升;蓮心堿進(jìn)樣量在36.9 ～ 369.5 ng時(shí)，線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率為99.9%，RSD為1.79%。優(yōu)化后的提取方法操作簡(jiǎn)便，提取率高，重復(fù)性好，方法準(zhǔn)確，可為蓮心堿的提取以及后續(xù)蓮子心飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：色譜分析;蓮子心飲片;蓮心堿;含量測(cè)定;高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.7535/hbgykj.2021yx04008

Optimization of the determination method of

Nelumbinis Plumula decoction pieces

YAN Yuexin1， LIANG Siyi1， JI Shengnan1， LI Lili2， HA Jing1

（1. School of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China; 2. Hebei Yuzhilin Pharmaceutical Company Limited， Xingtai， Hebei 054400， China）

Abstract： In order to solve the problem of the low qualification rate of content detemination items of commercial Nelumbinis Plumula decoction pieces causing by the low extraction effciency of active ingredients，the extraction method of liensinine in Nelumbinis Plumula decoction pieces was optimized. The extraction method of liensinine， the extraction solvent， and the volume of the extraction solvent were investigated respectively， and the test solution of the Nelumbinis Plumula decoction pieces was prepared by using the optimized extraction method. The method was performed on Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm× 150 mm ） column with acetonitrile-0.05 mol/L sodium docecylsulfonate solution-glacial acetic acid （volume ratio 55∶44∶1） as the mobile phase. The content of liensinine in the Nelumbinis Plumula decoction pieces was determined under the conditions of the flow rate of 1.0 mL/min， the column temperature of 30 °C， the detection wavelength of 284 nm， and the injection volume of 10 μL. The results show that the best extraction conditions are 25 mL of 0.08% hydrochloric acid methanol solution as the extraction solvent， and ultrasonic extraction for 40 minutes. The optimized extraction method makes the content determination of liensinine more stable， and the extraction efficiency of liensinine is significantly improved. The liensinine has a good linear relationship in the injection range of 36.9 ～ 369.5 ng. The average recovery rate is 99.9%， and the RSD is 1.79%. The method is simple and accurate with the good reproducibility and high extraction rate， which can provide a reference for the extraction of liensinine and the formulation of the quality standards of Nelumbinis Plumula decoction pieces.

Keywords：chromatographic analysis; Nelumbinis Plumula decoction pieces; liensinine; content determination; high performance liquid chromatography（HPLC）

蓮子心為睡蓮科植物蓮（Nelumbinis nucifera Gaertn.）成熟種子中的干燥幼葉及胚根[1]。蓮子心中含有生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、降血糖、保護(hù)心血管、促進(jìn)脂肪分解等藥理活性[2-8]。蓮子心在中國(guó)資源豐富，主產(chǎn)于福建、湖南、江蘇等地[9-12]。采用《中華人民共和國(guó)藥典（2015年版 一部）》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）蓮子心含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，測(cè)定蓮子心飲片，市售飲片鮮有合格品，導(dǎo)致中藥臨床和制劑生產(chǎn)幾乎無(wú)蓮子心可用[13-15]。根據(jù)研究報(bào)道，多數(shù)蓮子心中蓮心堿含量達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，可能是由于蓮心堿提取效率不夠高，但現(xiàn)有改進(jìn)的蓮子心提取方法，其含量測(cè)定結(jié)果并不滿(mǎn)意[15]。本文通過(guò)考察合適的提取方式、提取溶劑以及提取溶劑體積，對(duì)《中國(guó)藥典》蓮子心含量測(cè)定項(xiàng)下方法中的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，提高飲片中蓮心堿的提取率。第4期閆悅欣，等：蓮子心飲片含量測(cè)定方法優(yōu)化河北工業(yè)科技第38卷

1儀器、藥品及試劑

1.1主要儀器

LC-10ATvp高效液相色譜儀，日本DHIMADZU公司提供;SQP十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司提供;DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司提供;KQ-250B超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司提供;FZ102萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司提供。

1.2試劑及藥品

蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品 （批號(hào)為111696-201703，純度≥96.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供），甲醇、乙腈 （色譜純，Sunrise Chem公司提供），十二烷基磺酸鈉、冰醋酸 （分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供），蓮子心飲片 （樣品1產(chǎn)自中國(guó)浙江，樣品2產(chǎn)自中國(guó)福建，樣品3產(chǎn)自中國(guó)廣東，樣品4產(chǎn)自中國(guó)湖南，樣品5產(chǎn)自中國(guó)江蘇，樣品6產(chǎn)自中國(guó)湖北）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相為乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（體積比為55∶44∶1），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備

取蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液 （蓮心堿質(zhì)量=蓮心堿高氯酸鹽質(zhì)量/1.358 7）。

2.3供試品溶液的制備考察

2.3.1提取方式的比較

《中國(guó)藥典》中蓮子心含量測(cè)定項(xiàng)下的提取方法：以2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）鹽酸甲醇溶液為提取溶劑，水浴回流30 min。本試驗(yàn)設(shè)定提取溶劑為2%鹽酸甲醇溶液，對(duì)水浴回流和超聲處理 （功率為250 W，頻率為40 kHz） 這2種方式的提取效果進(jìn)行比較。

稱(chēng)取樣品約0.5 g （過(guò)4號(hào)篩），精密稱(chēng)定，平行6組，每組2份，加入2%鹽酸甲醇溶液25 mL，每組設(shè)定不同時(shí)間，分別用水浴回流、超聲處理 （功率為250 W，頻率為40 kHz） 提取樣品，然后放冷，稱(chēng)重，補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，精密取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定。結(jié)果2種方式提取出蓮心堿的含量接近，綜合蓮心堿的提取效率及提取時(shí)間，確定提取方式為超聲處理40 min，見(jiàn)表1（所用樣品為樣品4，產(chǎn)自中國(guó)湖南）。

2.3.2不同鹽酸含量的提取溶劑對(duì)蓮心堿提取效率的影響

精密取樣品約0.5 g （過(guò)4號(hào)篩），平行11組，每組2份，分別加入純甲醇和不同鹽酸含量的鹽酸甲醇溶液 （4%，2%，1%，0.8%，0.5%，0.2%，0.1%，0.09%，0.08%，0.07%）各25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min （功率為250 W，頻率為40 kHz），放冷，再稱(chēng)定重量，補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，其余試驗(yàn)內(nèi)容按“2.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行。

由含量測(cè)定結(jié)果可知，蓮心堿的提取效率與提取溶劑中鹽酸的含量有關(guān)，當(dāng)鹽酸含量從4%逐漸降低至0.08%時(shí)，蓮心堿的含量逐漸升高，同時(shí)色譜圖的分離度也明顯改善，當(dāng)鹽酸含量為0.07%時(shí)，蓮心堿的含量不再升高，當(dāng)提取溶劑為純甲醇時(shí)，蓮心堿的含量降低。因此，適當(dāng)降低提取溶劑中鹽酸的含量，有利于蓮心堿的提取以及色譜圖峰形的改善，含量測(cè)定結(jié)果及色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

2.3.3提取溶劑體積的考察

稱(chēng)取樣品約0.5 g （過(guò)4號(hào)篩），精密稱(chēng)定，平行3組，每組2份，分別加入不同體積 （15，25，40 mL） 0.08%鹽酸甲醇溶液，稱(chēng)重，超聲處理40 min （功率為250 W，頻率為40 kHz），冷卻，稱(chēng)定重量，補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，其余試驗(yàn)內(nèi)容按“2.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行。由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)提取溶劑的體積為25 mL時(shí)，蓮子心飲片中蓮心堿提取率達(dá)到最高并且穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.4供試品溶液的制備

通過(guò)優(yōu)化蓮子心飲片的提取條件，確定供試品溶液的制備方法：取樣品約0.5 g （過(guò)4號(hào)篩），加入0.08%鹽酸甲醇溶液25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min （功率為250 W，頻率為40 kHz），放冷，稱(chēng)重，用0.08%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，精密取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4專(zhuān)屬性試驗(yàn)

以0.08%鹽酸甲醇溶液為空白溶液，進(jìn)行專(zhuān)屬性試驗(yàn)，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定。結(jié)果說(shuō)明空白溶液對(duì)蓮心堿的含量測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

2.5線(xiàn)性關(guān)系

按照“2.2”項(xiàng)下步驟制備對(duì)照品溶液，分別取對(duì)照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果蓮心堿進(jìn)樣量為36.9 ～ 369.5 ng，線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性回歸方程為y=945.13x-67.854，R2=0.999 9，見(jiàn)圖4。

2.6精密度試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下步驟制備對(duì)照品溶液，取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示RSD為0.75% （n=6），表明儀器精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，取蓮子心飲片，制備樣品溶液，每隔一定時(shí)間，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在24 h范圍內(nèi)，峰面積的穩(wěn)定性較好，RSD為0.32%，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，取蓮子心飲片，平行制備6份樣品溶液，測(cè)定。結(jié)果樣品中蓮心堿的平均含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）為0.984 0 mg/g，RSD為0.39%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性較好，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.9回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取9份蓮子心飲片粉末，分別加入3種不同濃度的蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，各濃度對(duì)照品加入量與所取供試品含有量之比分別為0.5∶1，1∶1，1.5∶1。根據(jù)“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備樣品溶液，測(cè)定。結(jié)果加樣回收率的平均值為99.9%，RSD為1.79%，方法準(zhǔn)確度較高，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.10樣品含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用3種提取方法 （分別為《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)方法（簡(jiǎn)稱(chēng)藥典標(biāo)準(zhǔn)方法），文獻(xiàn)[14]中的方法（簡(jiǎn)稱(chēng)文獻(xiàn)方法），以及前述“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法（簡(jiǎn)稱(chēng)改進(jìn)后的方法），分別對(duì)不同產(chǎn)地的蓮子心樣品進(jìn)行提取，然后根據(jù)不同方法下的色譜條件，分別進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法使部分蓮子心飲片達(dá)到《中國(guó)藥典》中規(guī)定的含量限度，且該方法提取出蓮心堿的量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)方法2.12倍，是文獻(xiàn)方法的1.25倍。因此說(shuō)明，改進(jìn)后的方法使蓮心堿的提取率得到一定程度的提升，見(jiàn)表7。

3討論

1）色譜條件的討論

為了更方便地將樣品續(xù)濾液被流動(dòng)相稀釋?zhuān)谒幍浞椒ǖ幕A(chǔ)上，調(diào)整流動(dòng)相的比例為乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（55∶44∶1），同時(shí)色譜圖峰形保持良好。十二烷基磺酸鈉易溶于熱水，因此在流動(dòng)相配制過(guò)程中，將十二烷基磺酸鈉置于熱水（50 ℃ ）中溶解，制成0.015 mol/L的十二烷基磺酸鈉溶液，冷卻后觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所處環(huán)境溫度低于30 ℃時(shí)，十二烷基磺酸鈉在水中易產(chǎn)生析出現(xiàn)象，因此建議在使用該流動(dòng)相時(shí)，要注意嚴(yán)格控制室內(nèi)的溫度，且確保柱溫不低于30 ℃。

2）提取方法原因分析

采用水浴回流、超聲的提取方式，分別對(duì)蓮子心飲片進(jìn)行提取，結(jié)果2種方式提取出蓮心堿的含量接近，從蓮心堿的提取效率及提取時(shí)間考慮，最終選擇提取方式為超聲提取40 min。蓮心堿易溶于甲醇，選擇甲醇為提取溶劑，同時(shí)蓮心堿又是一種雙芐基四氫異喹啉生物堿，加入適量的鹽酸，能夠提高提取效率。經(jīng)試驗(yàn)條件篩選，當(dāng)提取溶劑為0.08%的鹽酸甲醇溶液時(shí)，蓮心堿的提取效率最高。

3）蓮子心質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)

蓮子心主要活性成分為生物堿類(lèi)，其中蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿在總生物堿中占據(jù)較大比重，并且這3種生物堿都具有明確的藥理活性[16-24]。經(jīng)上述研究發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)后的方法使蓮子心飲片中蓮心堿的提取率得到顯著的提升，但仍有一部分飲片未能達(dá)到《中國(guó)藥典》中蓮子心項(xiàng)下規(guī)定的含量限度，因此僅以蓮心堿作為蓮子心飲片的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)于飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)是較片面的，在后續(xù)蓮子心飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂中，建議將蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿的含量作為蓮子心飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，從而使蓮子心飲片得到更全面的評(píng)價(jià)。

4結(jié)語(yǔ)

采用《中國(guó)藥典》蓮子心含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，測(cè)定市售蓮子心飲片時(shí)，幾乎沒(méi)有合格品，因此以?xún)?yōu)化含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的提取過(guò)程為研究方向，通過(guò)篩選供試品的提取方法、提取溶劑以及提取溶劑體積，確定了蓮子心飲片的最佳提取條件，對(duì)《中國(guó)藥典》中蓮子心含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行了優(yōu)化。采用優(yōu)化后的供試品溶液制備方法，對(duì)蓮子心飲片進(jìn)行提取，根據(jù)調(diào)整后的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果優(yōu)化后的方法使蓮心堿的提取率得到顯著提升，但仍有部分飲片未達(dá)到《中國(guó)藥典》蓮子心項(xiàng)下的含量限度。查閱相關(guān)資料，得知《中國(guó)藥典》中蓮子心項(xiàng)下制定蓮心堿合格指標(biāo)過(guò)高，市售飲片鮮有合格品。因此在后續(xù)對(duì)蓮子心飲片進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，建議測(cè)定蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿的總量，以期使多數(shù)蓮子心飲片能夠符合藥用要求。

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