陳 蓉，余佳文，徐瑞超，唐 卓

1.成都中醫(yī)藥大學 民族醫(yī)藥學院，四川 成都 611137

2.太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000

3.中國科學院成都生物研究所 天然產物中心，四川 成都 610041

虎掌南星又名掌葉半夏，是天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisectaSchott的干燥塊莖，具有燥濕化痰、祛風止痙、散結消腫等功效[1]?；⒄颇闲悄壳盀榉撬幍淦贩N，但是被部分省地方標準收載品種[2-3]。半夏是一味常用中藥材，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效。《中國藥典》2020年版規(guī)定半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit的干燥塊莖。由于半夏的市場需求量較大，價格高，市場上半夏藥材的摻偽現(xiàn)象比較常見，其中最常見的偽品為虎掌南星[4]。個小的虎掌南星與半夏在形態(tài)上極為相似，經過加工炮制之后更加難以區(qū)分。所以建立虎掌南星特異性的鑒別方法對虎掌南星藥材和半夏藥材的質量評價以及2種藥材的臨床使用都具有十分重要的意義。

利用DNA分子鑒定技術可以實現(xiàn)對中藥材及其成藥當中原料藥的真?zhèn)舞b定[5-9]，從2010年至今，歷版《中國藥典》先后收載了包括烏梢蛇[10]、蘄蛇[10]、霍山石斛[11]、金錢白花蛇[11]在內的多個中藥材的聚合酶鏈式反應鑒別法?！吨袊幍洹?020年版還新增了《聚合酶鏈式反應（PCR）法》[12]和《DNA測序技術指導原則》[12]，為DNA分子鑒定技術應用于中藥材真?zhèn)舞b定的推廣應用奠定了基礎。實時熒光PCR（Real-time PCR）技術是在PCR擴增過程當中，通過熒光信號，對PCR過程進行實時監(jiān)測的一種技術。該技術的整個過程不需要開蓋，在最大程度上避免了PCR擴增產物的污染，同時由于該技術是一種實時監(jiān)測技術，相比于傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳的終點檢測可以節(jié)約大量的人力成本和時間成本，非常適用于大量樣本的快速檢測，目前已經廣泛應用于臨床病原微生物[13]、轉基因產品[14]、肉類產品[15]的真?zhèn)舞b定等多個領域，2019年底爆發(fā)至今的新型冠狀病毒的核酸檢測也大都采用此法。

目前常規(guī)的RT-PCR操作采用PCR傳統(tǒng)的三步法或兩步法，整個擴增檢測時間約為1 h，本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，PCR過程中的變性、退火、延伸3個步驟不是一定要在傳統(tǒng)的3個溫度點且保持一定時間才能完成，而是可以在一個動態(tài)的變溫過程中實現(xiàn)，即體系的溫度只需要在2個溫度點之間來回變化，就可以實現(xiàn)核酸的快速擴增[16]。由于該快速核酸擴增方法省略掉了在3個溫度點的停留時間，整個核酸擴增的時間將大幅度縮短，同時由于該體系中溫度對時間的曲線圖會呈現(xiàn)多個重復的“V”字型，因此將上述快速核酸擴增方法取名為“VPCR”。前期研究還證明了VPCR技術可以應用于實時熒光監(jiān)測的聚合酶鏈式反應，取名為“Real-time VPCR”。使用Real-time VPCR技術同樣可以將核酸擴增檢測的時間從1 h以上縮短至20 min左右。所以，本實驗采用Real-time VPCR技術，建立了虎掌南星特異性的快速鑒別方法，可以在24 min內完成擴增檢測，以期為虎掌南星以及半夏藥材的質量控制提供參考。

1 材料和儀器

1.1 材料

特異性研究使用的虎掌南星P.pedatisecta、半夏P.ternata、水半夏Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume和天南星Arisaema erubescens(Wall.) Schott由太極集團提供，經太極集團余佳文總工程師鑒定以及ITS序列測序鑒定無誤；用于盲測的7批藥材采集自甘肅西和（編號1）、甘肅清水（編號2、3）、河北安國（編號4）、四川成都（編號5、6）、江西贛州（編號7），每批8個樣本（a～h）。Easy Taq DNA聚合酶（貨號AP111）、Trans2K DNA Marker（貨號BM111-01）、dNTPs（貨號AD101-12）均購自北京全式金生物技術有限公司；GELVIEW（貨號EP1501）購于北京百泰克公司；瓊脂糖粉（貨號TSJ001）購于北京擎科新業(yè)生物技術有限公司；引物（HAP純化)、熒光探針（HPLC純化）均訂自生工生物（上海）技術有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒（貨號DE-06113）購自成都福際生物技術有限公司；基于拓撲異構酶的超快速克隆試劑盒（貨號C601-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器

Thermo Shaker恒溫儀（杭州博日公司）；Legend Micro 21R離心機（美國Thermo公司）；熒光定量PCR儀（Thermo Scientific PikoReal Real-Time PCR System）；電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；Typhoon FLA 7000 IP瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（GE公司），ND5000超微量紫外可見分光光度計（百泰克公司）。

2 方法

2.1 DNA提取

采取商品化的植物DNA提取試劑盒（柱式）對樣本的DNA進行提?。喝訒r采用一次性刀片切去樣品表面部分，刮取中間部分5～10 mg置于1.5 mL離心管中，按照植物DNA提取試劑盒說明書操作步驟進行DNA提取。所提取的DNA經超微量紫外可見分光光度計測量純度和濃度，除特殊說明外，DNA模板均稀釋至10 ng/μL進行使用。

2.2 Real-time VPCR擴增

以“2.1”項下制備的DNA作為模板，采用虎掌南星特異性引物HP1（5’-GGGAGAC- TCCTGACGATCGGC-3’），HRP1（5’-CCACGCAG- GCCATCACTTGAT-3’），以及TaqMan探針HP（5’-FAM-CGTGGGCCGGCGGGACGAC-3’-BHQ1）進行擴增和檢測。反應體系：10×Taq buffer 2.5 μL；EasyTaq酶2個單位；正反向引物各0.6 μmol/L；TaqMan探針0.3 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L；MgCl22 mmol/L；DNA提取液1 μL；加滅菌水補足20 μL。擴增程序為95 ℃解鏈30 s；94 ℃變性0 s，60 ℃ 0 s，F(xiàn)AM通道熒光采集，循環(huán)40次。

2.3 ITS序列擴增與測序

以“2.1”項下制備的DNA作為模板，采用ITS通用引物ITS 5a fwd（5’-CCTTATCATTTAG- AGGAAGGAG-3’），ITS 4 rev（5’-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3’）進行擴增和檢測。反應體系為：10×Taq buffer 2.5 μL；EasyTaq酶2個單位；正反向引物各0.1 mmol/L；dNTPs 0.2 mmol/L；DNA提取液1 μL；加滅菌水補足20 μL。擴增程序為95 ℃解鏈30 s；94 ℃變性5 s，50℃ 5 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。擴增產物送至生物公司采用上述通用引物進行雙向測序。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

PCR或者Real-time VPCR擴增結束后，取擴增產物5 μL與1 μL上樣緩沖液進行混合，將混合液加至經GELVIEW染色的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，分離電壓150 V，電泳時間10 min；電泳結束后，將該凝膠置于瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)進行觀察并拍照。

2.5 Real-time VPCR擴增產物的測序和比對分析

利用“基于拓撲異構酶的超快速克隆試劑盒”，按照試劑盒操作說明：將Real-time VPCR擴增產物連接至載體，并將該載體轉化至感受態(tài)細胞，再將感受態(tài)細胞進行放大培養(yǎng)后涂板，待肉眼可見克隆長出時，挑取單克隆交由生物公司采用M13通用引物M13F（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’）進行測序。所測得序列在Genbank BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網站進行比對分析。

2.6 真實樣本測序鑒定

真實樣本檢測中，將在Real-time VPCR快速擴增體系中顯示陽性結果的擴增產物送至生物公司，利用虎掌南星特異性引物HP1（5’-GGGAGACT- CCTGACGATCGGC-3’）直接進行測序，測序序列在Genbank BLAST網站進行比對分析，測序結果與數(shù)據(jù)庫中虎掌南星序列（AF469040.1）一致者判斷為虎掌南星樣本；對于在Real-time VPCR快速擴增體系中顯示陰性結果的樣本，取其DNA提取液，按照已報道文獻所述方法[17]進行擴增，擴增結束后將擴增產物送至生物公司，利用文中所報道半夏特異性引物BP3（5’-GGGAGACTCCCGACGATCG- CA-3’）直接進行測序，測序序列在Genbank BLAST網站進行比對分析，測序結果與數(shù)據(jù)庫中半夏序列（AF469036.1）一致者判斷為半夏樣本。

3 結果與分析

3.1 序列分析以及引物和探針的設計

通過對ITS序列部分進行擴增和測序的方式得到虎掌南星、半夏、天南星以及水半夏的ITS序列，并將所獲得的序列與Genbank中已知序列相對比，發(fā)現(xiàn)所測得序列與Genbank中所登記序列一致（虎掌南星序列登記號為AF469040.1，半夏序列登記號為AF469036.1，水半夏序列登記號為AM777883.1，天南星序列登記號為JF975897.1。）采用序列比對軟件將四者的序列進行比對，比對結果發(fā)現(xiàn)虎掌南星與天南星和水半夏的序列差異較大，相似度約為78%；虎掌南星與半夏由于屬于同科同屬植物，序列相似性高達92%。根據(jù)前期的研究經驗以及引物和TaqMan探針設計原則，將差異堿基放至引物和探針的3’端，設計出核酸擴增所需要的引物和探針（圖1）。

圖1 虎掌南星及其近緣品種ITS序列分析Fig.1 Sequence alignments of ITS (partial sequence) from P.pedatisecta and its closely related species

3.2 Real-time VPCR體系的建立和優(yōu)化

按照Real-time VPCR的操作[19]，分別對引物濃度和探針濃度進行了優(yōu)化，如圖2-A所示，引物濃度在0.2～0.6 μmol/L，隨著引物濃度增加，Ct值從26.12降至20.99，但是當引物濃度從0.6 μmol/L升至1 μmol/L的過程中，Ct值變化不大，同時由于過高的引物濃度可能導致非特異性擴增的產生，故將引物濃度設定為0.6 μmol/L。在探針濃度方面，如圖2-B所示，當探針濃度從0.1μmol/L升至0.3 μmol/L的過程中，Ct值從21.66降低至20.85，但是當探針濃度從0.3 μmol/L升至0.5 μmol/L的過程中，Ct值變化不大，所以將探針濃度設定為0.3 μmol/L。所以最終確定在20 μL的反應體系中，優(yōu)化后引物濃度為0.6 μmol/L；探針濃度為0.3 μmol/L，反應程序為95 ℃解鏈30 s；94 ℃、0 s，60℃、0 s，F(xiàn)AM通道熒光采集，循環(huán)40次?？偡磻獣r間為24 min。

圖2 引物 (A) 和探針 (B) 濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of primers (A) and probes concentration (B)

3.3 虎掌南星Real-time VPCR體系特異性和準確性考察

利用虎掌南星Real-time VPCR檢測體系對虎掌南星、半夏、水半夏以及天南星的基因組DNA進行擴增和檢測，從而考察所建立體系的特異性，熒光擴增結果如圖3-A所示，僅虎掌南星樣本顯示有明顯的擴增曲線，Ct值在20個循環(huán)左右，而其他3個品種在40個循環(huán)以內均無明顯擴增，將該擴增產物取出經瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳檢測結果與熒光PCR結果一致：僅虎掌南星樣本中有特異性的目的DNA條帶產生，在其他樣品中均沒有特異性擴增條帶產生（圖3-B）。上述結果表示該方法具有良好的特異性。將該擴增產物制作成單克隆后送測序公司測序，測序結果顯示該序列與Genbank中虎掌南星序列（AF469040.1）百分之百一致；表示該方法具有高度的準確性（圖3-C）。

圖3 特異性和準確性考察結果Fig.3 Specificity and accuracy studies

3.4 虎掌南星Real-time VPCR體系靈敏度考察

利用虎掌南星的引物和探針分別對質量濃度為0.1～1×104pg/μL的虎掌南星基因組DNA進行實時熒光VPCR擴增檢測，熒光擴增曲線和標準曲線見圖4。由試驗結果可知（圖4-A），當待檢測模板濃度在0.1 pg/μL時，在熒光擴增曲線上就可以看到明顯的擴增曲線，說明該體系可以檢測到低至0.1 pg/μL的DNA模板。與此同時，從標準曲線中還可以看出（圖4-B），當待檢測模板質量濃度在0.1～10 ng/μL內，Ct值與DNA濃度的lg值之間的相關系數(shù)（R2）為0.999 6，表明二者之間存在良好的線性關系，說明該體系條件良好，適合實時熒光PCR的擴增分析。

圖4 靈敏度研究Fig.4 Sensitivity analysis

3.5 真實樣本檢測結果

如前所述，由于虎掌南星常被當做半夏使用，本課題組嘗試利用上述虎掌南星Real-time VPCR快速擴增體系對課題組所采購的“半夏”藥材進行檢測。首先利用“2.2”項中所述的DNA提取方法對所購7個批次共56個樣本的DNA進行提取，并對所提取的DNA質量進行分析和控制；再利用Real-time VPCR擴增方法對上述DNA進行擴增和檢測。檢測結果顯示，第1批次和第3批次共16個樣本在虎掌南星的快速鑒別體系中產生了典型的擴增曲線，且Ct值均在20左右（圖5-A、B），提示上述16個樣本為虎掌南星而非半夏，擴增產物經測序進一步驗證無誤，確定為虎掌南星品種；其余40個樣本無明顯擴增曲線，通過DNA測序確定為半夏正品（圖5-C）。因此，通過以上結果證明所建立的虎掌南星快速檢測方法具有高度的準確性和實用性。

4 討論

從藥材圖片可以看出，半夏藥材大小不一，形態(tài)各異，由于栽培變種等原因，半夏與虎掌南星在形態(tài)學上的差異已經變得比較模糊，而從DNA分子水平可以有效的對藥材的真?zhèn)芜M行準確的鑒定。中藥材的真?zhèn)舞b定除了正品的鑒定，也包括偽品的識別，前期已有文獻報道了半夏藥材的真?zhèn)舞b定方法[20]，本實驗報道了虎掌南星的快速鑒別法，二者聯(lián)用可以互為補充，全面的實現(xiàn)半夏藥材以及虎掌南星藥材的質量評價。另一方面，中藥的質量控制除了定性鑒別還包括定量分析，大量研究證明以DNA為基礎的分子鑒定方法可以有效的應用于中藥材的定性鑒別；在定量分析上，由于DNA含量受采收時間、藥材儲存時間等因素影響較大，利用藥材DNA含量來對藥材重質量進行定量分析的研究較少，但是根據(jù)本研究結果，如要實現(xiàn)定量分析，可以對一批藥材采取抽樣分析，如抽取一定量數(shù)目的單個藥材，并對每一顆藥材都進行鑒別，最后進行統(tǒng)計學計算，得出本批藥材的定量分析結果。如要實現(xiàn)對大量樣本的真?zhèn)舞b定，這就要求該檢測方法能夠快速、便捷、高通量地處理大量樣本。

圖5 樣本照片和檢測結果Fig.5 Sample photos and analysis results

Real-time PCR法由于其具有閉管、實時監(jiān)測、可以有效降低污染等優(yōu)點，目前在臨床病原微生物的檢測方面應用較為廣泛，但在中藥材的真?zhèn)舞b定領域報道較少，本實驗在Real-time PCR法的基礎上，建立了更加快速的Real-time VPCR檢測方法，使得該技術的應用變得更加簡單和快捷，目前實現(xiàn)了在24 min之內完成對虎掌南星特異性DNA的快速擴增和實時檢測，避免了開蓋檢測和容易污染等問題，方法本身在高效快速的基礎上還兼具有靈敏、特異和準確等優(yōu)點，對7個批次56個盲測樣本的準確鑒定也證明了方法的準確性和實用性。隨著新型冠狀病毒疫情的爆發(fā)，各類新型核酸檢測儀器和核酸擴增技術迅速發(fā)展，推動著整個核酸檢測技術朝著更高通量、更加快速的方向前進。核酸檢測主要包括核酸提取、核酸擴增和擴增產物的檢測3個步驟，本實驗應用快速核酸擴增技術解決了虎掌南星藥材核酸的快速擴增和擴增產物檢測的問題，在今后的應用中，如果可以結合DNA自動提取工作站，就可以實現(xiàn)虎掌南星藥材的自動化、高通量、快速檢測，有效解決中藥基因檢測實際應用過程中的科學問題、推動中藥基因檢測技術在中藥質量控制上的實際應用。同時，本實驗所用的方法也可以推廣到其他中藥品種，為其他中藥的質量評價提供新的選擇和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突