熊 高，王 勇，胡永媛，黃天衛(wèi)，魏富剛，高麗芳，陳中堅*

1.文山學(xué)院文山三七研究院，云南 文山 663099

2.文山苗鄉(xiāng)三七股份有限公司，云南 文山 663099

花色苷屬于類黃酮化合物，是植物的主要次級代謝產(chǎn)物之一，它不僅可保護植物免受生物和非生物脅迫[1-2]，還對人類的腦健康、抗氧化及抗炎抗癌等方面發(fā)揮作用[3-5]。因此，培育花色苷含量高的品種一直是植物育種工作中的方向之一?；ㄉ帐怯苫ㄉ赵吞擒战Y(jié)合而成的糖苷合成物，其生物合成涉及一系列負責(zé)編碼花色苷合成關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)基因的表達參與，這些結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成了一條植物經(jīng)典的花色苷代謝路徑，是花色苷生物合成的基礎(chǔ)[6]。在該代謝路徑[7]中：首先，以丙二酰CoA和香豆酰CoA為原料，在查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）和查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）催化下形成4’5’7’-三羥基黃烷酮，然后經(jīng)黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）作用下形成二氫山柰酚（dihydrokaempferol，DHK）；此時，DHK可作為中間產(chǎn)物在類黃酮3’-羥化酶（flavonoid 3’-hyroxylase，F(xiàn)3’H）和類黃酮3’,5’-羥化酶（flavonoid 3’，5’-hyroxylase，F(xiàn)3’5’H）催化下進入不同的分支途徑，分別形成二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM）；其次，3個分支形成的物質(zhì)在DFR基因編碼的二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reduetase，DFR）催化下形成原花色素，再經(jīng)花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）作用轉(zhuǎn)化成花色苷元，由此形成了花色苷的基本骨架。最后，經(jīng)過尿苷二磷酸-葡萄糖-類黃酮-3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose 3-O-flavonoid glucosyltransferase，UFGT）催化生成花色苷元3-O-葡萄糖苷，再由一系列的修飾反應(yīng)形成穩(wěn)定的花色苷物質(zhì)。

植物中花色苷合成結(jié)構(gòu)基因表達水平的改變可以直接影響花色苷的合成。以模式植物擬南芥為代表，通過對CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR等基因座位進行突變，能影響種皮及莖、葉組織中紫色花色苷的累積[8-10]；同樣，基于RNAi的基因沉默或CRISPR/Cas9的基因敲除技術(shù)在水稻、大豆、草莓、牽?；ㄖ袑@些基因進行功能研究，也顯示了結(jié)構(gòu)基因的表達水平與花色苷合成的相關(guān)性[11-16]；此外，在玫瑰花中，UFGT基因在各組織中的表達模式與花色苷累積一致，該基因的高量表達是玫瑰花顏色鮮艷的基礎(chǔ)[17]?？傊参锘ㄉ蘸铣傻幕A(chǔ)是代謝路徑中結(jié)構(gòu)基因表達的結(jié)果，這些基因的改變可以調(diào)節(jié)花色苷的含量而影響植物組織或器官的顏色。

三七作為我國著名的中藥材，除含有眾所周知的皂苷成分外，也具有花色苷；花色苷含量在三七根部累積可形成紫色塊根，紫根三七在生態(tài)適應(yīng)和藥效方面均優(yōu)于普通三七[18]，高花色苷含量特性的紫根三七一直是優(yōu)質(zhì)三七新品種的選育目標(biāo)。然而，參與三七花色苷合成的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因并未被克隆報道，尚缺乏關(guān)于對三七花色苷合成分子基礎(chǔ)的認識。本研究通過生物信息學(xué)分析及同源克隆技術(shù)獲得三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因，利用qRT-PCR方法研究這些基因的時空表達模式及與紫根三七表型的關(guān)聯(lián)性，以期明確參與該性狀形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，為進一步探究該類基因的功能機制奠定基礎(chǔ)，對深入理解三七花色苷合成的遺傳本質(zhì)及相關(guān)種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料與試劑

供試三七（2年生）采集于文山三七研究院和文山苗鄉(xiāng)三七科技公司建立的三七種質(zhì)資源圃內(nèi)（文山州丘北縣境內(nèi)），包括花蕾期（8月初）三七的花和開花期（8月中）三七的花、花軸、葉、莖、剪口、主根、須根等各組織，以及結(jié)果期（10月）三七的紫根（文院紫七1號）和黃白根。以上組織經(jīng)去離子水清洗后，立即放于液氮中冷凍，-80 ℃保存。

2 方法

2.1 引物設(shè)計與合成

下載擬南芥、水稻、棉花等物種中已鑒定的花色苷合成結(jié)構(gòu)基因序列，使用BLAST在三七基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的預(yù)測序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物（表1），由北京擎科生物公司合成。

表1 基因克隆和定量引物信息Table 1 Primers of gene cloning and quantitative PCR

2.2 基因克隆

嚴格按照試劑盒說明書操作，分別采用植物DNA提取試劑盒提取三七葉片DNA，利用百泰克RNA提取試劑盒提取三七各組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠迷O(shè)計的特異性引物分別擴增三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因（PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H、PnF3’H1、PnF3’H2、PnANS、PnUFGT）ORF的全長序列，將PCR產(chǎn)物進行檢測和膠回收，與載體pMD19-T進行連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性單克隆測序。測序由北京擎科生物公司合成。

2.3 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因結(jié)構(gòu)；使用SMART（http://smart.embl- heidelberg.de/）和CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）確定保守結(jié)構(gòu)域。在三七基因組數(shù)據(jù)庫中截取克隆獲得的花色苷基因翻譯起始位點（ATG）上游2000 bp的啟動子序列，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psbugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動子反應(yīng)調(diào)控元件。采用MEGA7.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）程序?qū)Σ煌锓N的花色苷基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 總花色苷提取和含量測定

參考Fuleki等[19]的方法進行花色苷含量的提取和測定，略有改動。取0.5 g新鮮三七的根組織，用液氮研磨成粉末，加入5 mL鹽酸-甲醇提取液（pH 3.0），30 ℃條件下溫和震蕩抽提2 h，然后7000 r/min離心10 min，吸取上清液作為花色苷提取液，在4 ℃下避光保存?zhèn)溆?。? mL花色苷提取液，分別加pH 1.0緩沖溶液和pH 4.5的緩沖溶液9 mL，室溫條件下平衡40 min，以蒸餾水為空白對照，分別在波長530 nm[20]和700 nm波長處測定吸光度A530、A700。按以下公式進行計算：

M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的平均摩爾消光系數(shù)；L為比色皿的寬度，取1 cm；mf為取樣量。

2.5 熒光定量表達分析

根據(jù)三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因克隆序列設(shè)計qRT-PCR引物（表1），分別以三七各組織cDNA為模板，以三七Actin 2為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測這些基因在不用組織中的表達水平，3次重復(fù)，基因表達水平歸一化處理，使用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。熱圖和柱形圖分別使用R包（pheatmap）和Graphpad Prism 6進行繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 三七花色苷結(jié)構(gòu)基因的克隆及生物信息學(xué)分析

基于植物經(jīng)典的花色苷代謝路徑，利用其他物種中鑒定的花色苷合成結(jié)構(gòu)基因序列，在三七全基因組數(shù)據(jù)中進行BLAST檢索，除F3’5’H基因未檢索到，其他類型的花色苷基因均鑒定到相應(yīng)的同源基因。根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計引物，分別以三七的DNA以及花或根的cDNA為模板，克隆獲得6類共8個三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因，分別命名為PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H、PnF3’H1、PnF3’H2、PnANS和PnUFGT（GenBank登錄號MN520443-MN520450），僅DFR基因未克隆到，圖1-A為克隆擴增產(chǎn)物電泳圖。這8個基因的外顯子數(shù)在1～4個，其中PnCHS2為單外顯子，PnCHI外顯子數(shù)多達4個；ORF長度在600～1500 bp，最長的PnF3’H1達1575 bp，最短的PnCHI為672 bp（圖1-B）。

保守功能域分析顯示，PnCHS1/2具有查耳酮/二苯乙烯合成酶N端和C端（Chal_sti_synt_N，Chalconeand stilbene synthases，N-terminal domain；Chal_sti_synt_C，chalcone and stilbene synthases，C-terminal domain）結(jié)構(gòu)域，PnCHI含有一個查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase）家族結(jié)構(gòu)域，PnF3H和PnANS包含一個嗎啡合成N端的非血紅素加氧酶家族（DIOX_N，non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal）結(jié)構(gòu)域和一個2-酮戊二酸和二價鐵離子依賴型的加氧酶家族[2OG-Fe(Ⅱ) Oxygenase superfamily，2OG-FeII_Oxy]結(jié)構(gòu)域，PnF3’H1/2具有細胞色素P450結(jié)構(gòu)域，PnUFGT含有一個UDPGT結(jié)構(gòu)域（圖1-B）?？傊?，本實驗鑒定到的8個三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因均包含有植物花色苷合成相關(guān)功能域。

圖1 三七花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的克隆與分析Fig.1 Cloning and analysis of structure gene of anthocyanin biosynthesis in Panax notoginseng

3.2 三七花色苷結(jié)構(gòu)基因系統(tǒng)進化分析

采用MEGA7.0軟件對三七、擬南芥、水稻、棉花、煙草和馬鈴薯等物種的花色苷合成結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示每一類型的基因都各自聚在一起，由于F3H與ANS關(guān)系最近，聚為同一支，最終形成5個分支，且每一類型的基因同源性較高（圖2），說明三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因與各物種之間具有較高保守性，這表明它們在進化過程中可能功能保守。

不是嗎，無限無知的宇宙，似乎天然就內(nèi)在具有一種毫不猶豫的“生命指向”，在一切可能的極度艱辛中一旦有縫隙，就會“石上開花”、生命問世。沒有生命的宇宙無法證明其自身的“在”與“不在”，因此，從植物到微生物到昆蟲到動物等等，生命以它層層遞進的宏大與渺小，讓這不被思索的無限廣宇在知與不知的替換中，得到思索追溯。

圖2 三七花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of structure gene of anthocyanin biosynthesis in P.notoginseng

3.3 三七花色苷結(jié)構(gòu)基因啟動子順式作用元件分析

采用PlantCARE在線軟件分析顯示，8個三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的啟動子序列含有多種類型的順式調(diào)控元件，其中光響應(yīng)順式元件和轉(zhuǎn)錄因子MYB/MYC響應(yīng)元件均存在于這些基因的啟動子區(qū)域中，且數(shù)量最多，說明這些基因的轉(zhuǎn)錄表達主要受光照和調(diào)控因子MYB/MYC的影響；另外，激素響應(yīng)元件（脫落酸、生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、水楊酸和乙烯）、抗逆性相關(guān)調(diào)控元件（防御、干旱、厭氧）和種子特異性元件呈不同情況分布于不同基因上游序列中（表2）。

表2 啟動子重要順式作用元件數(shù)量分析Table 2 Analysis on number of important cis regulatory elements of promoter

3.4 三七花色苷結(jié)構(gòu)基因的組織表達模式

利用qRT-PCR技術(shù)，分析三七開花期（8月）7個不同組織中8個基因的表達模式，結(jié)果顯示，這些基因的表達特征可分為2類，一是主要在花中高量表達的基因，為PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H和PnF3’H2；二是主要在根部高量表達的基因，為PnF3’H1、PnANS、PnUFGT，其中剪口中主要是PnANS和PnUFGT，主根中則以PnF3’H1為主；此外，PnF3H和PnANS在莖中以及PnF3’H2在葉中存在少量表達（圖3）。

為了解5個花特異性高表達基因在花期不同階段的表達情況，對這些基因在三七的花蕾期和開花期進行表達水平檢測，結(jié)果顯示，PnCHS1、PnCHI、PnF3H和PnF3’H24個基因主要在花蕾期中顯著高表達，而PnCHS2基因表現(xiàn)為在開花期顯著高表達（圖4）。

圖3 三七花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因在多組織中的表達譜分析Fig.3 Expression profiling of the structure gene of anthocyanin biosynthesis in different tissues of P.notoginseng

圖4 PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H、PnF3’H2在不同花期的相對表達量Fig.4 Relative expressions of PnCHS1,PnCHS2,PnCHI,PnF3H and PnF3’H2 at different flowering stages

3.5 三七花色苷結(jié)構(gòu)基因在紫根三七中的表達分析

對系統(tǒng)選育法選育的“文院紫1號”（根部紫色）品種[21]，和普通型黃白根三七（圖5-A）的總花色苷分析發(fā)現(xiàn)，文院紫七1號材料的總花色苷顯著增加，約有3倍（圖5-B），說明三七根系紫色主要是花色苷累積形成，這與前人的研究結(jié)果相似[20]。為了研究參與紫根性狀形成的關(guān)鍵花色苷合成結(jié)構(gòu)基因，通過qRT-PCR檢測3個根部表達基因在三七紫根和黃白根中的表達，結(jié)果顯示PnF3’H1和PnUFGT在紫根中顯著上調(diào)表達（圖5-C），說明三七紫根中花色苷累積與它們的表達水平相關(guān)，PnF3’H1和PnUFGT可能是參與該性狀形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。

4 討論

圖5 紫根與黃白根三七表型 (A)、總花色苷含量 (B) 及基因PnF3’H1、PnANS、PnUFGT表達量 (C) 的分析Fig.5 Analysis of P.notoginseng (A),total anthocyanin content (B) and expression (C) of PnF3’H1,PnANS,and PnUFGT in purple root and yellow-white root

本研究以中藥材三七為材料，克隆鑒定了6類共8個三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因，其中三七CHS和F3’H各2個，這與其他物種中該類型基因可分 離出多個基因的情況相似[22-24]。對未克隆成功的三七DFR基因預(yù)測序列分析發(fā)現(xiàn)，其翻譯起始位點區(qū)域的GC含量高，推測可能會形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致該基因ORF序列較難克隆。另外，在對三七全基因組數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索時，未發(fā)現(xiàn)可催化二氫山奈酚為二氫楊梅素的3’,5’-羥化酶編碼基因F3’5’H的三七同源基因，暗示三七的花色苷合成可能不涉及以二氫楊梅素為底物的途徑。

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)行使功能的重要區(qū)域，被稱作蛋白質(zhì)功能單元。植物中，CHS蛋白的查耳酮/二苯乙烯合成酶結(jié)構(gòu)域，具有將3分子丙二酰CoA和1分子的4-對香豆酰-CoA縮合形成柚皮素查耳酮的功能[25]。CHI的查耳酮異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域，行使催化雙環(huán)柚皮素查耳酮為三環(huán)2S-二氫基黃烷酮的作用[26]。而2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域主要以亞鐵離子為活性位點輔因子，2OG為共底物，行使將二氫基黃烷酮氧化為二氫黃酮類的功能[27-28]。此外，細胞色素P450結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于含亞鐵血紅素的單加氧酶超家族中，類黃酮合成途徑里主要具有將二氫山柰酚羥基化形成二氫槲皮素[29-30]，以及UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域行使了糖苷化作用[31]。通過結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的三七花色苷相關(guān)基因，均含有參與植物花色苷合成的相關(guān)蛋白質(zhì)功能單元（圖1-B）；同時，進化分析顯示這些基因的氨基酸序列與其他物種的保守性高（圖2）。以上說明三七花色苷結(jié)構(gòu)基因極有可能與其他物種的已知基因具有類似功能。

在分析啟動子順式作用元件時發(fā)現(xiàn)，三七花色苷結(jié)構(gòu)基因上游存在多種環(huán)境因子的作用元件，其中光信號結(jié)合元件數(shù)量最多。前人的研究顯示，在擬南芥、紫蘇、矮牽牛、葡萄等多種植物中花色苷結(jié)構(gòu)基因都受到光的調(diào)控[32-35]；另外，GA、JA、ABA等激素及干旱條件下也有關(guān)于對相關(guān)結(jié)構(gòu)基因誘導(dǎo)表達，繼而影響花色苷合成的研究[36-37]。因此，筆者推測三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因可受外界環(huán)境信號調(diào)控來影響花色苷的合成，而光信號是最重要的環(huán)境因子之一。此外，三七花色苷結(jié)構(gòu)基因啟動子中均鑒定到轉(zhuǎn)錄因子MYB/MYC結(jié)合的順式作用元件。MYB轉(zhuǎn)錄因子含有1～4個重復(fù)單元的MYB結(jié)構(gòu)域，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一；MYC轉(zhuǎn)錄因子屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族，含有bHLH保守結(jié)構(gòu)域。目前，MYB蛋白和bHLH蛋白作為主要的調(diào)節(jié)基因參與類黃酮物質(zhì)的生物合成已在多種植物中得到研究[11,38]。說明三七中轉(zhuǎn)錄因子MYB/MYC可能會通過結(jié)合相應(yīng)的順式元件來對花色苷相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，潛在的作用機制是未來研究的重點。

花色苷合成基因的表達特性往往與其功能密切關(guān)聯(lián)[9,11-13,15]。根據(jù)三七花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的表達模式，推測它們主要參與了三七在花和根中花色苷的合成；同時對花不同發(fā)育時期的表達檢測發(fā)現(xiàn)，相關(guān)結(jié)構(gòu)基因主要在花蕾期高量表達，暗示三七花的花色苷合成主要在前期階段，與滇牡丹的情況類似[23]。另外，PnF3H和PnANS在莖中也有表達，很可能是三七紫莖（花色苷含量高）形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，不過仍需進一步研究確認。值得注意的是，同一類基因PnF3’H1與PnF3’H2具有相反的表達模式，PnF3’H1主要參與了根部花色苷合成，而PnF3’H2在花和葉中起作用，這與葡萄中4個F3’H表現(xiàn)出不同表達模式類似[22]，暗示這些基因可能經(jīng)歷基因復(fù)制事件后發(fā)生了功能分化。此外，基因表達關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)PnF3’H1和PnUFGT在高花色苷特性的紫根中高量表達，推測它們可能是紫根中花色苷形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，這可為進一步明確紫根中高花色苷形成的分子基礎(chǔ)提供了理論支撐，也為針對這2個基因開發(fā)基因特異性分子標(biāo)記開展紫根性狀的分子輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突