馬小毛，寧書(shū)菊，葉 齊，胡永樂(lè),3，蔡國(guó)倩，魏道智*

1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

2.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

3.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300

馬藍(lán)Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek，爵床科馬藍(lán)屬的雙子葉多年生草本植物[1]，是我國(guó)南方常見(jiàn)藥用植物。其莖葉炮制而成的青黛，以福建產(chǎn)品質(zhì)最佳，因此被稱(chēng)為建青黛，是福建道地藥材之一[2]。馬藍(lán)化學(xué)成分研究報(bào)道，馬藍(lán)中含有生物堿、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂苷等多種植物次生代謝產(chǎn)物[3]，其中吲哚類(lèi)生物堿被認(rèn)為是馬藍(lán)中主要的藥效成分，分子藥理實(shí)驗(yàn)表明，靛藍(lán)、靛玉紅在人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮著顯著的藥理作用。近年來(lái)，禽流感、甲型流感、新型病毒等流行病肆虐頻發(fā)，推高了市場(chǎng)上以馬藍(lán)為基源的中藥材的價(jià)格和需求，因此加強(qiáng)對(duì)藥用植物馬藍(lán)的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義[4]。

目前，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究相應(yīng)的生物合成途徑，克隆和分析關(guān)鍵酶基因是植物生物工程研究中提高特定代謝產(chǎn)物累積的重要手段之一[5]。本研究中，主要藥效成分靛藍(lán)、靛玉紅的積累基于馬藍(lán)吲哚類(lèi)生物堿合成途徑，一般認(rèn)為，吲哚生物合成途徑包括2方面：一是莽草酸途徑，二是色氨酸途徑[6]。莽草酸和色氨酸在分支酸合成酶（chorismate synthase，CS）、鄰氨基苯甲酸合成酶（anthranilate synthase，AS）、色氨酸合成酶（tryptophan synthase，TS）、細(xì)胞色素CYP450單氧氧化酶（cytphrome P450 monooxygenase，CYP450）、尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）等一系列關(guān)鍵酶的作用下，最終加氧聚合合成靛藍(lán)、靛玉紅等吲哚類(lèi)生物堿或衍生為其他吲哚類(lèi)物質(zhì)，因此，鄰氨基苯甲酸合成酶也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)色氨酸以及次生代謝產(chǎn)物積累的關(guān)鍵酶之一。

鄰氨基苯甲酸合成酶大多存在于植物細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)，是由α亞基和β亞基組成的復(fù)合酶[7]，α亞基是關(guān)鍵的催化亞基，而β亞基為α亞基的催化反應(yīng)提供氨基[8]。早在1992年，Niyogi等[9]首次從模式植物擬南芥中克隆出編碼ASα亞基的基因。隨后，于1995年，Bohlmann等[10]從蕓香中克隆出編碼ASα亞基的基因。此后陸續(xù)有科學(xué)家從水稻[11]、煙草[12]、長(zhǎng)春花[13]、喜樹(shù)[14]等植物中分離克隆出編碼ASα亞基的基因。與ASα亞基相比，有關(guān)ASβ亞基的研究相對(duì)較少，但近年來(lái)，也有研究者從水稻中分離獲得了編碼ASβ亞基的基因[15]，且表明了2個(gè)β亞基之間在酰胺基轉(zhuǎn)移酶活性方面的功能差異。前期，課題組已從馬藍(lán)中分離克隆了鄰氨基苯甲酸合成酶ASα亞基編碼的BcASA基因（GenBank登錄號(hào)MH976794），本實(shí)驗(yàn)則對(duì)ASβ亞基編碼的BcASB基因進(jìn)行研究。目前，在馬藍(lán)生物堿合成途徑的研究中，尚未見(jiàn)鄰氨基苯甲酸合成酶ASβ亞基的相關(guān)報(bào)道，因此，要闡釋馬藍(lán)藥效物質(zhì)合成途徑，沒(méi)有BcASB基因的克隆和生物學(xué)信息的挖掘和分析是不完整的。

因此，本實(shí)驗(yàn)在前期馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)從馬藍(lán)鄰氨基苯甲酸合成酶中分離克隆了ASβ亞基編碼的基因，獲得完整的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），命名為BcASB。通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，最后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）對(duì)BcASB基因在馬藍(lán)不同部位的表達(dá)進(jìn)行分析以及檢測(cè)馬藍(lán)葉在不同外源誘導(dǎo)子處理下的表達(dá)情況和馬藍(lán)有效成分靛藍(lán)、靛玉紅積累量的變化情況，為今后研究該基因的功能以及馬藍(lán)吲哚類(lèi)生物堿合成途徑的研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

樣品采自福建農(nóng)林大學(xué)藥植園，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏道智教授鑒定為馬藍(lán)Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek，于-80 ℃保存，用于后期RNA的提取。

克隆載體pENTR/D-TOPO為本實(shí)驗(yàn)保存，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、2×TransTaq PCR Mix均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；茉莉酸甲酯（methyl-jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、乙烯利（ethylene，ETH）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；色譜甲醇、色譜乙腈、色譜甲酸均購(gòu)自默克股份兩合公司；靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)內(nèi)分析純。引物合成和樣品測(cè)序由福州鉑尚生物有限公司完成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因克隆和熒光定量PCR引物Table 1 Sequences of primers designed for gene clone and real-time PCR

2 方法

2.1 馬藍(lán)總RNA的提取和cDNA的合成

使用RNA提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit）提取馬藍(lán)總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000檢測(cè)RNA的完整性、濃度和純度。當(dāng)28 S是18 S的1.5～2倍時(shí)，說(shuō)明提取的RNA完整性較好，A260/A280為1.9～2.0，RNA濃度≥400 ng/mL時(shí)，說(shuō)明純度和濃度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser），以提取到的馬藍(lán)總RNA為模板合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 BcASB基因的克隆及鑒定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組前期建立的馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)BcASB基因ORF序列的特異性引物（BcASB-F，BcASB-R），以“2.1”項(xiàng)中合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為30 μL：2×Taq PCR Master Mix 15 μL，正反向引物各1 μL，模板cDNA 3 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min[16]。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用試劑盒回收和純化目的片段，將純化后的產(chǎn)物與與入門(mén)載體pENTR/D-TOPO連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布在含有卡那霉素（Kan）抗性的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，并將陽(yáng)性克隆送至福州鉑尚生物有限公司測(cè)序。

2.3 BcASB基因的生物信息學(xué)分析

使用NCBI-ORF Finder平臺(tái)查找和分析基因的ORF，并將ORF翻譯成氨基酸序列。利用ExPASy-ProtParam tool軟件預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的分子式、理論相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等各種理化性質(zhì)；通過(guò)Plant-PLoc在線分析軟件初步預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；利用NetPhos 3.1 Server和NetOGlyc 4.0 Server分別對(duì)蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；通過(guò)SignalP 4.1 Server對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；分別使用在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)；通過(guò)Blast對(duì)馬藍(lán)ASB基因與芝麻、煙草、丹參、陸地棉等15種植物的同源序列進(jìn)行分析，使用DNAMAN軟件進(jìn)行同源序列的比對(duì)；利用MEGA 6.0軟件對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列與GenBank上的其他序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用NJ法（neighbor-joining）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrapping參數(shù)為1000個(gè)重復(fù)。

2.4 BcASB基因在馬藍(lán)中的誘導(dǎo)表達(dá)

采取馬藍(lán)的根、莖、葉，按照“2.1”項(xiàng)方法提取總RNA，以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，測(cè)定BcASB基因在馬藍(lán)不同器官中的表達(dá)模式。以β-actin為內(nèi)參基因[17]，根據(jù)克隆獲得的BcASB基因序列，通過(guò)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表1）。分別用100 μmol/L的MeJA、SA、ABA、ETH 4種不同外源激素對(duì)馬藍(lán)植株進(jìn)行脅迫處理，對(duì)處理后不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、4、6、8、12、24、36、72 h）BcASB基因表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR表達(dá)分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，正反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、20 s；72 ℃、20 s；40個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3次技術(shù)重復(fù)，每個(gè)樣品3次重復(fù)，擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR儀軟件自動(dòng)生成。反應(yīng)結(jié)束后采用2-△△Ct方法[18-19]計(jì)算分析BcASB基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 激素誘導(dǎo)下吲哚類(lèi)生物堿靛藍(lán)、靛玉紅含量的測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為YMC C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.04%甲酸水溶液（B）（0.04%甲酸水溶液的制備：移液槍吸取400 μL甲酸置于含200 mL蒸餾水的容量為1000 mL藍(lán)蓋瓶中，加蒸餾水至1000 mL，搖勻后，超聲脫氣20 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)為289 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫過(guò)程：0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～15 min，25%～30% A；15～20 min，30%～35% A；20～25 min，35%～15% A。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品混合溶液 (A) 和供試品溶液 (B) 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed solution (A) and test solution (B)

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取靛藍(lán)對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定15 mg，置于10 mL量瓶中，精密加入含50%N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的甲醇溶液（超聲溶解30 min），配制成質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的溶液，用0.45 μm和0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。稱(chēng)取靛玉紅對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定10 mg，置于10 mL量瓶中，精密加入含50% DMF的甲醇溶液（超聲溶解5 min），配制成1.0 mg/mL的溶液，用0.45 μm和0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取經(jīng)80 ℃烘干至恒定質(zhì)量的馬藍(lán)葉片（不同激素、不同時(shí)間處理），粉碎機(jī)粉碎過(guò)40目篩，精密稱(chēng)取粉末10 mg，置于10 mL量瓶中，加入50% DMF的甲醇溶液，45 ℃超聲溶解后定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混標(biāo)對(duì)照品溶液適量，加入甲醇進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e得到對(duì)照品系列濃度。0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后，依據(jù)“2.5.1”項(xiàng)色譜條件，取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到各對(duì)照品的回歸方程，靛藍(lán)Y＝0.697 3X＋3.805 3，R2＝0.999 6，線性范圍為15.0～320.0 μg/mL；靛玉紅Y＝22.372 6X－6.805 3，R2＝0.999 7，線性范圍為5.0～50.0 μg/mL。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按樣品測(cè)定方法對(duì)同一批號(hào)6份供試品樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算靛藍(lán)、靛玉紅RSD分別為1.47%、1.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（記錄配制日期）依樣品測(cè)定色譜條件，分別于0、2、4、24 h注入液相色譜測(cè)定，計(jì)算靛藍(lán)、靛玉紅含量的RSD分別為1.59%、1.99。

2.5.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，考察日內(nèi)精密度，測(cè)得靛藍(lán)、靛玉紅的RSD分別為1.77%、2.74%。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同一批號(hào)樣品6份，各約0.5 g，分別精密加入靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品溶液，制備成加樣供試品溶液，并分別測(cè)定和計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，靛藍(lán)、靛玉紅平均加樣回收率分別為97.3%、103.9%，RSD分別為1.17%、1.76%。

3 結(jié)果與分析

3.1 馬藍(lán)BcASB基因的克隆與序列分析

以馬藍(lán)總RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異引物BcASB-F、BcASB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示單一明亮的條帶（圖2），經(jīng)測(cè)序后得到正確的序列，大小為765 bp（命名為BcASB），編碼256個(gè)氨基酸。將該基因的序列信息提交NCBI GenBank，登錄號(hào)為QCF61930.1，BcASB基因核苷酸和氨基酸序列如圖3所示。

圖2 PCR擴(kuò)增BcASB基因Fig.2 PCR amplification of BcASB gene

3.2 馬藍(lán)BcASB蛋白的生物信息學(xué)分析

3.2.1 理化性質(zhì)和細(xì)胞定位分析 通過(guò)ExPASy- ProtParam tool軟件推測(cè)該基因編碼蛋白的分子式為C1256H1956N342O369S9，相對(duì)分子質(zhì)量為28 039.96，理論等電點(diǎn)（pI）為7.22，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為24，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp＋G1u）為24，該蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為45.40，推測(cè)該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為81.84，親水性的平均值（GRAVY）：-0.210，說(shuō)明該蛋白屬于親水性蛋白。通過(guò)NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)該蛋白共包含43個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括絲氨酸（serine）21個(gè)，蘇氨酸（threonine）13個(gè)和酪氨酸（tyrosine）9個(gè)；使用NetOGlyc 4.0 Server軟件預(yù)測(cè)該蛋白包含3個(gè)糖基化位點(diǎn)；通過(guò)Plant-PLoc在線軟件預(yù)測(cè)顯示BcASB蛋白定位于葉綠體。

3.2.2 信號(hào)肽及跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)分析通過(guò)SignalP 4.1預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果顯示無(wú)信號(hào)肽存在，說(shuō)明該蛋白為非分泌型蛋白（圖4-A）；使用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示BcASB蛋白不包含跨膜區(qū)，為非膜蛋白（圖4-B）。

圖3 馬藍(lán)BcASB基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence of BcASB gene in B.cusia

圖4 BcASB蛋白信號(hào)肽 (A) 和跨膜區(qū) (B) 預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of signal peptide (A) and transmembrane domains (B) of BcASB protein

3.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)軟件SOPMA預(yù)測(cè)BcASB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α-螺旋50個(gè)，占19.53%；不規(guī)則卷曲117個(gè)，占45.70%；β-折疊25個(gè)，占9.77%；延伸鏈64條，占25.00%（藍(lán)色代表α-螺旋，紫色代表不規(guī)則卷曲，綠色代表β-折疊；紅色代表延伸鏈），這4個(gè)元件構(gòu)成了BcASB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋和不規(guī)則卷曲為其主要結(jié)構(gòu)元件，散布于整個(gè)蛋白中（圖5-A）。通過(guò)SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以谷氨酰胺酶為模板（SMTL ID：6qur.1.A），在第1～256位氨基酸處建模，三維模型覆蓋率為57.45%，序列相似性為0.48（圖5-B）。

圖5 BcASB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) (A) 和三級(jí)結(jié)構(gòu) (B) 的預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of secondary structure (A) and tertiary (B) structure of BcASB protein

圖6 不同物種BcASB氨基酸序列多重比對(duì)Fig.6 Multiple alignments of amino acid sequence of BcASB form different species

3.2.4 多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 將BcASB基因編碼的蛋白序列提交至NCBI-Blastp，與其他植物ASB蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果顯示馬藍(lán)BcASB與上百種NCBI上登錄的植物有相似性，挑選其中15種與馬藍(lán)相似度較高的植物蛋白序列，利用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖6）。分析結(jié)果顯示馬藍(lán)Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek（QCF61930.1）與芝麻Sesamum indicumLinn.（XP_011070537.2）、丹參Salvia splendensBunge（TEY57190.1）、三果楊Populus trichocarpaCarr（XP_002314761.1）、胡楊Populus euphraticaOliv（XP_011024607.1）、月季Rosa chinensisJacp （XP_024193401.1）、陸地棉Gossypium hirsutumLinn（XP_016703097.1）等植物同源性達(dá)到72%～88%，總相似度達(dá)72.01%。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7），結(jié)果顯示馬藍(lán)BcASB蛋白與茄科一年或有限多年生草本植物辣椒的親緣關(guān)系最近，可聚為一支，與錦葵科陸地棉和海綿ASB蛋白親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3.3 BcASB基因的時(shí)空表達(dá)分析

3.3.1 BcASB基因在不同器官中的表達(dá)模式分析分別提取馬藍(lán)根、莖、葉的總RNA，qRT-PCR法測(cè)定BcASB基因在馬藍(lán)不同組織的表達(dá)模式，結(jié)果表明，BcASB在3種不同的器官中均有表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在一定差異，在葉和莖中表達(dá)量顯著高于根，表達(dá)量從高到低呈現(xiàn)出葉＞莖＞根，BcASB在葉中的表達(dá)量是莖的2.01倍，根的5.08倍（圖8）。

圖7 不同物種BcASB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of BcASB proteins from different species

圖8 BcASB基因在各器官中的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of BcASB gene in various organs

3.3.2 不同外源激素對(duì)BcASB基因誘導(dǎo)表達(dá)的影響 對(duì)馬藍(lán)葉片進(jìn)行了MeJA、SA、ABA、ETH 4種不同外源誘導(dǎo)物的脅迫處理，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)BcASB表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，用MeJA處理后，馬藍(lán)BcASB基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在4、6、8、12 h時(shí)表達(dá)量顯著高于其他檢測(cè)點(diǎn)，在6 h達(dá)到峰值，與0 h處理點(diǎn)存在顯著差異，為0 h的5.89倍，隨后逐漸下降，在24、36、72 h相對(duì)表達(dá)量水平接近（圖9-A）。用SA處理后，BcASB基因表達(dá)量呈現(xiàn)先穩(wěn)定后迅速上升的趨勢(shì)，在24 h達(dá)到峰值，表達(dá)量為0 h的3.2倍，而在24、36、72 h時(shí)BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他檢測(cè)點(diǎn)，說(shuō)明SA對(duì)基因的調(diào)節(jié)更為持久，對(duì)植物代謝影響顯著（圖9-B）。用ABA處理后，BcASB基因表達(dá)量在8、12、24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他檢測(cè)點(diǎn)，在0～4 h趨于穩(wěn)定，在6 h小幅度上升，為0 h的1.5倍，8 h達(dá)到峰值，為0 h的4倍，隨后表達(dá)量逐漸下降，但在72 h表達(dá)量仍然高于0 h（圖9-C）。而用ETH處理后，BcASB基因表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，顯著高于其他檢測(cè)點(diǎn)，為0 h的1.58倍，24、36、72 h時(shí)基因的表達(dá)量水平與其他檢測(cè)點(diǎn)基本持平，沒(méi)有顯著性的差異，說(shuō)明基因的相對(duì)表達(dá)量受ETH的影響較?。▓D9-D）。上述結(jié)果說(shuō)明BcASB基因可以響應(yīng)多種外源誘導(dǎo)子處理。

3.4 激素誘導(dǎo)下靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定分析

3.4.1 馬藍(lán)不同組織中靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定 對(duì)馬藍(lán)不同器官根、莖、葉中的吲哚類(lèi)生物堿靛藍(lán)和靛玉紅含量進(jìn)行了測(cè)定（圖10），研究結(jié)果顯示，靛藍(lán)、靛玉紅含量在馬藍(lán)葉、莖中的含量相差較大，靛藍(lán)在葉中的含量達(dá)到400.98 μg/g，是靛玉紅含量的10.1倍，靛藍(lán)在莖中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為650.58 μg/g，是靛玉紅含量的14倍，而在根中，兩者含量沒(méi)有顯著性差異；且靛藍(lán)在葉和莖中的含量顯著高于根，而靛玉紅在不同組織中的含量沒(méi)有顯著性差異。

3.4.2 不同激素處理的馬藍(lán)葉片中靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定 用MeJA處理馬藍(lán)葉片，采取處理后不同時(shí)間點(diǎn)的葉片，測(cè)定其含量的變化（圖11-A），HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，葉片中靛藍(lán)、靛玉紅的含量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，靛藍(lán)在4、6、8、12 h時(shí)含量顯著高于其他檢測(cè)點(diǎn)，在6 h達(dá)到最大值，為786.35 μg/g，為0 h的1.96倍，在72 h下降到初始水平。靛玉紅的含量在6 h也達(dá)到最大值， 為66.38 μg/g，為0 h的2倍，在36 h下降到初始水平，但靛玉紅含量在各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)沒(méi)有顯著性差異。

圖9 MeJA (A)、SA (B)、ABA (C)、ETH (D) 脅迫下BcASB基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)Fig.9 Expression of BcASB gene at different time points under stress of MeJA(A),SA(B),ABA (C),and ETH (D)

圖10 馬藍(lán)不同組織中靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定Fig.10 Determination of indigo and indirubin in different tissues of B.cusia

用SA處理后（圖11-B），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靛藍(lán)含量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)先穩(wěn)定后上升，再下降而后維持穩(wěn)定的趨勢(shì)，在0～2 h靛藍(lán)含量維持穩(wěn)定，4 h開(kāi)始小幅上升，8 h含量達(dá)到最大值653.36 μg/g，且顯著高于其他檢測(cè)點(diǎn)，為0 h的1.69倍，8 h后，靛藍(lán)含量下降，并于24 h維持穩(wěn)定水平，和初始含量一致。而靛玉紅含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，沒(méi)有顯著的變化，在6 h出現(xiàn)了小幅上升，但整體變化趨勢(shì)處于穩(wěn)定水平，表明SA處理對(duì)馬藍(lán)葉片中靛玉紅含量的影響不大。

在ABA的處理下（圖11-C），靛藍(lán)含量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨，在0～2 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，4～12 h相對(duì)于2 h有下降的趨勢(shì)，但含量仍高于初始水平，24 h靛藍(lán)含量達(dá)到最大值600.58 μg/g，36、72 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但含量為0 h的1.25倍。而靛玉紅含量隨著時(shí)間變化沒(méi)有顯著差異，在24 h達(dá)到最大值60.36 μg/g，在72 h含量下降到初始水平。

在ETH處理下（圖11-D），靛藍(lán)含量在0～4 h呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在4 h含量達(dá)到750.68 μg/g，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在12 h含量又持續(xù)上升，在72 h達(dá)到最大值790.69 μg/g。靛玉紅含量同樣呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在0～4 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在4 h含量達(dá)到最大值80.69 μg/g，在6 h之后，含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但在72 h含量上升至70.36 μg/g，為初始水平的1.5倍，總體上含量在各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)沒(méi)有顯著性差異。

綜上所述，通過(guò)檢測(cè)不同外源誘導(dǎo)子處理下，不同時(shí)間點(diǎn)靛藍(lán)、靛玉紅積累量的變化，發(fā)現(xiàn)在某個(gè)時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)靛藍(lán)、靛玉紅含量與0 h相比，均發(fā)生了顯著的上調(diào)，這與BcASB基因的表達(dá)量相一致，說(shuō)明馬藍(lán)有效成分靛藍(lán)、靛玉紅積累量受基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步說(shuō)明基因表達(dá)在馬藍(lán)有效成分的合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

4 討論

圖11 MeJA (A)、SA (B)、ABA (C)、ETH (D) 處理下馬藍(lán)葉片中靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定Fig.11 Determination of indigo and indirubin in leaves of B.cusia under MeJA (A),SA (B),ABA (C),and ETH (D) treatment

吲哚類(lèi)生物堿（靛藍(lán)、靛玉紅等）作為植物次生代謝的重要產(chǎn)物之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等顯著藥理活性[20]。ASB是植物體內(nèi)吲哚類(lèi)生物堿合成途徑的關(guān)鍵酶之一，具有重 要的研究?jī)r(jià)值。近幾年，ASB的研究多集中在擬南芥、煙草這樣的模式植物中，在藥用植物的研究中鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究立足于前期建立的馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，克隆了馬藍(lán)BcASB基因，ORF區(qū)長(zhǎng)為765 bp，編碼256個(gè)氨基酸，與芝麻的ASB同源性最高，可達(dá)88%。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，BcASB蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為28 039.96，理論等電點(diǎn)為7.22，為非分泌型蛋白，因此不具有識(shí)別信號(hào)的功能。BcASB蛋白定位于葉綠體，這與一般報(bào)道的ASB蛋白的定位結(jié)果一致。同時(shí)對(duì)蛋白的親疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)作了詳細(xì)的分析，為馬藍(lán)BcASB基因提供了更多更詳盡的信息。

組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，BcASB基因在馬藍(lán)不同的器官中均有表達(dá)，佐證了馬藍(lán)根、莖、葉均可入藥一說(shuō)，且在葉中的表達(dá)量高于根和莖，這與已經(jīng)報(bào)道的喜樹(shù)[14]的研究結(jié)果具有一致性，喜樹(shù)中AS亞基編碼的基因在其不同器官中均有表達(dá)，且在幼苗的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量迅速升高。在水稻[11]中，AS亞基編碼的基因在各組織中的表達(dá)模式卻有所不同，ASA1在花序中的表達(dá)量高于根和葉，而ASA2在各組織的表達(dá)量差異不大，這說(shuō)明同源蛋白之間組織表達(dá)也具有一定的差異，可能與蛋白參與的功能相關(guān)。MeJA、ABA、SA、ETH在植物的代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[21-22]。本研究對(duì)馬藍(lán)葉片進(jìn)行了MeJA、ABA、SA、ETH這4種不同外源激素的脅迫處理，ASB表達(dá)量和馬藍(lán)有效成分靛藍(lán)、靛玉紅積累量均呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，說(shuō)明BcASB基因響應(yīng)并介導(dǎo)外源誘導(dǎo)子對(duì)代謝的調(diào)控。這與擬南芥、水稻的表達(dá)情況相近。前期，Sun等[23]就在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)MeJA會(huì)刺激鄰氨基苯甲酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)擬南芥芽和根的生長(zhǎng)。在水稻中也發(fā)現(xiàn)ASβ亞基編碼的基因也具有可誘導(dǎo)性[15]。同時(shí)，也有很多研究驗(yàn)證了不同的信號(hào)誘導(dǎo)可以促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[24-25]。在馬藍(lán)等藥用植物中，其生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶活性高低也會(huì)影響藥效成分的產(chǎn)量，因此，提高關(guān)鍵酶基因在植物中的表達(dá)也是提高藥用活性成分產(chǎn)量、提高中藥材品質(zhì)的有效手段之一[26]。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)的藥用植物已經(jīng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，最活躍的研究領(lǐng)域就是與藥用活性成分形成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因的克隆研究[27]。因此，本研究通過(guò)克隆馬藍(lán)鄰氨基苯甲酸合成酶BcASB基因，以及對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、時(shí)空表達(dá)分析，并檢測(cè)有效成分積累量的變化，為后續(xù)構(gòu)建基因超表達(dá)載體以及對(duì)該基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)馬藍(lán)有效成分含量的提高具有積極作用，有助于更深入的闡釋馬藍(lán)吲哚類(lèi)生物堿合成途徑和調(diào)控機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突