呂李飛，吳俊松，茍江騰，趙成周，孫勝男，李忠寬，賈守寧，祁永福*

1.青海大學 青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點實驗室，青海 西寧 810016

2.生物芯片北京國家工程研究中心（博奧生物），北京 102266

3.青海大學藏醫(yī)學院，青海 西寧 810001

4.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指各種心臟結構或功能異常，致使心室充盈或射血功能受損，心排血量不能滿足機體組織代謝需要而引起的一組綜合征，是多種心血管疾病主要死因。也是各種心血管系統(tǒng)疾病的最終轉歸，目前臨床主要以神經內分泌調節(jié)治療為主，如血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（angiotensin receptor neprilysin inhibitor，ARNI）類藥物，可抑制血管緊張素受體表達和增強利鈉肽系統(tǒng)作用[1]。但究其根本為對癥治療，長期使用會產生耐藥現象。目前CHF的病死率和復發(fā)率一直逐年增長，隨著人口老齡化不斷加劇，已成為我國主要的公共衛(wèi)生問題，給社會經濟造成嚴重負擔[2]。

祖國醫(yī)學將心衰歸為“心水”“怔忡”范疇。西晉王叔和《脈經》提出“肝著其根，心氣因起，陽行四肢，肺氣亭亭，喘息則安?！逼洳±硇再|屬本虛標實，本虛為心之氣血陰陽虛衰，臟腑功能失調；標實為痰濁、瘀血、水飲、氣滯。心氣虛是病理基礎，血瘀是中心環(huán)節(jié)，痰飲和水濕是主要的病理產物。據此，治以溫陽益氣活血法，方用溫陽益氣活血方治療。

溫陽益氣活血方是青海省中醫(yī)院名老中醫(yī)自擬驗方，由制附子、桂枝、黃芪、人參、熟地黃、當歸、白芍、赤芍、川芎、桃仁、紅花11味中藥組成，具有溫陽益氣、活血化瘀之功效，使機體正存邪祛、陰陽乃固，故臨床多用于心血管疾病，青海省中醫(yī)院心腎科前期將溫陽益氣活血方進行臨床研究，有明顯臨床療效，后將其制成顆粒劑，目前對在院CHF患者應用廣泛[3]。但中藥復方是一種混合物，療效的整體性體現在對人體全方位多靶點方面，因此從分子水平闡述溫陽益氣活血方防治CHF的作用機制是中藥藥理學亟待解決的重要問題，也是基礎實驗、臨床研究獲取理論依據的必經之路。網絡藥理學可整合中藥成分與靶標間相互作用關系、靶標與靶標間相互作用關系；分子對接是預測受體與配體相互作用和反應機制的模擬化手段，二者聯合應用有助于發(fā)現中藥的潛在機制[4]。

目前溫陽益氣活血方改善CHF的效應機制尚不明確，本研究從外周血真核細胞基因表達譜的研究角度，采用芯片檢測2種方法干預后，化學藥組與中西藥組外周血的差異表達基因，結合RNA的差異表達分析，初步判斷基因表達的關鍵變化可能改變相關基因功能，為溫陽益氣活血方治療CHF的作用機制提供研究資料和方向。

1 網絡藥理學實驗

1.1 資料與方法

1.1.1 溫陽益氣活血方的潛在活性化學成分及靶點收集和篩選 從TCMSP數據庫，依次檢索白芍、赤芍、川芎等11味中藥的化學成分，名稱按《中國藥典》2020年版的植物名稱進行規(guī)范，根據化學成分的藥動學參數進行篩選，參考TCMSP自設定意見的篩選條件[5]，通過篩選得到符合條件的潛在活性成分。另外，結合中國知網、維普、萬方、PubMed等數據庫及相關文獻對未納入的潛在化學成分進行補充。

1.1.2 CHF潛在作用靶點預測及篩選 從NCBI平臺下的基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）以“chronic heart failure”為關鍵詞，選擇物種為“homo sapiens”，研究類型為“expression profiling by array”，檢索CHF的基因芯片。選取基因芯片GSE9128（包含3個正常樣本，樣本編號為GSM231003、GSM231003、GSM231005；8個CHF樣本，樣本編號為（GS-M231006～GSM231013）及其平臺數據GPL96下載后使用R軟件包，設定P＜0.05和|log2（fold change，FC）|＞0.5，分別繪制熱圖與火山圖。

1.1.3 “中藥-成分-交集靶點-疾病”網絡的構建 根據以上預測結果，使用Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-靶點-疾病”關系網絡模型，節(jié)點（node）代表單味藥種類、潛在活性化合物、共同作用靶點與疾?。–HF）；邊（edge）用于連接中藥與化合物、化合物與交集靶點、靶點與疾病（CHF）、疾?。–HF）與中藥，展現“中藥-化合物-交集靶點-疾病”之間的聯系，尋找發(fā)揮重要作用的活性成分[6]。

1.1.4 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建 PPI網絡是指從生物化學、信號轉導和遺傳網絡的角度研究化合物和疾病相關蛋白分子之間的相關性。將溫陽益氣活血方治療CHF的潛在作用靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/），限定研究物種為“homo sapiens”，獲得PPI關系，導出保存為TSV格式文件。將該文件中包含node1、node2和combined score的信息導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網絡[7]，設置節(jié)點的大小代表度（degree）值，節(jié)點越大，表示其度值越大，最終獲得PPI網絡圖。

1.1.5 基因本體論（genetic ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 GO功能富集分析是對差異基因的生物途徑進行注釋及分類并進行富集統(tǒng)計學分析；KEGG通路富集分析是東京大學和京都大學共同研制的數據庫，可查詢通路[8]。將溫陽益氣活血方治療CHF的潛在作用靶點導入David數據庫，限定研究物種為“homo sapiens”，選擇GO下的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）3個部分進行GO富集分析[9]，選擇pathway分析下的KEGG pathway，設定顯著性為P＜0.05，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能與體內通路。然后導出文件，對P值取負對數（-lgP），P值越小，-lgP越大，富集程度越大，反之亦然。利用R語言的Cluster Profiler工具包對GO分析和KEGG通路富集分析中的通路繪制條形圖。

根據上述所得到的核心靶點、GO通路富集程度前15、5、13的信息以及KEGG富集程度前20的通路導入Cytoscape3.7.2，得到“靶點-BP-CC-MF- KEGG”網絡。

1.1.6 核心活性成分-靶點分子對接驗證 從RCSB蛋白質數據庫（http://www.pdb.org/）下載5個核心靶標的晶體結構，去除水分子、加氫后使用Autodock Tool 4.2（ADT）保存為pdbqt格式。從TCMSP數據庫下載6個核心成分的MOL2，并使用ChemDraw 3D軟件將其能量最小化，再導入ADT后保存為pdbqt格式。采用Autodock Vina對6個核心成分與5個核心靶點進行分子對接驗證[10]。用結合能來評估分子與靶點的結合能力，結合能＜0表明能自發(fā)結合，結合能≤-5 kJ/mol表明結合良好。

1.2 結果

1.2.1 溫陽益氣活血方潛在活性化合物篩選 從TCMSP數據庫，在口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[5]條件下，獲取11味中藥的138個有效成分（表1），包括并篩選得到有效成分所對應的236個靶點（剔除重復項后）。

表1 溫陽益氣活血方主要活性化合物篩選結果Table 1 Screening results of main active compounds in Wenyang Yiqi Huoxue Recipe

續(xù)表1

1.2.2 CHF潛在作用靶點 從GSE9128中獲得395個差異基因（176個上調、219個下調），選擇上調基因和下調基因各20個繪制熱圖（圖1），其中C代表正常組，T代表CHF組。所有差異基因繪制火山圖（圖2），紅色代表上調基因，綠色代表下調基因，黑色代表無顯著性差異的基因。

1.2.3 交集靶點的獲取 通過venny在線平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/toosls/venny/index2.0.2html），在sheet1輸入成分靶點，sheet2輸入CHF的差異基因，獲取中藥治療CHF的17個交集靶點。將中藥、成分、交集靶點及疾病導入Cytoscape進行“中藥-成分-交集靶點-疾病”網絡的構建。并通過Cytoscape分析得到編號為MOL000098、MOL000358、MOL000422、MOL000006、MOL000449、MOL002714的成分度值最大，為核心成分（圖3），分別是槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（stigmasterol）、黃芩素（baicalein），為溫陽益氣活血方篩選出的6個改善CHF的潛在核心活性成分。

圖1 差異基因熱圖Fig.1 Thermal maps of differential genes

圖2 差異基因火山圖Fig.2 Volcanic maps of differential genes

1.2.4 PPI網絡的構建 將交集靶點輸入STRING數據庫，構建PPI網絡，再將結果以TSV格式導入Cytoscape進行分析。Cytoscape分析得到磷酸化原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、白細胞介素1β（recombinant human interleukin-1 beta，IL1B）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、Fos原癌基因（Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit，FOS)、髓細胞增生蛋白（myelocytomatosisproteins，MYC）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）等靶點的度值較大，是核心靶點（圖4）。

圖3 “中藥-成分-交集靶點-疾病”網絡圖Fig.3 Network diagram of “TCM-component-intersection target-disease”

圖4 PPI網絡Fig.4 PPI Networks

1.2.5 GO和KEGG富集分析 利用R語言的Cluster Profiler工具包，設置P＜0.05、q＜0.05進行GO和KEGG富集分析，根據矯正后P值篩選前20條進行作圖。將前20條通路及通路所對應的靶點導入Cytoscape進行作圖。

GO通路分析結果顯示，BP富集基因程度包括：生熱、對肌肉拉伸的反應、細胞對機械刺激的反應等；CC富集基因程度包括：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、蛋白激酶復合物、核染色質等；MF富集基因程度包括：R-Smad結合、E-box結合、RNA聚合酶II激活轉錄因子結合等（圖5）。

KEGG富集分析共富集89條通路，結果顯示溫陽益氣活血方治療CHF的17個潛在作用靶點主要參與的關鍵通路是癌癥的通路、C型凝集素受體信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）信號通路、催產素信號通路、慢性粒細胞性白血病、百日咳、軍團菌病、人巨細胞病毒感染等[11]（圖6、7）。

圖5 GO分析“BP-CC-MF”圖Fig.5 GO Analysis “BP-CC-MF”

圖6 KEGG富集分析氣泡圖Fig.6 KEGG Air bubbles before enrichment analysis

1.2.6 分子對接驗證 在“中藥-成分-交集靶點-疾病”網絡的構建分析中，通過Cytoscape分析得到排名前6的核心化合物是MOL000098（槲皮素）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000422（山柰酚）、MOL000006（木犀草素）、MOL000449（豆甾醇）、MOL002714（黃芩素）。分子對接驗證通過匹配原則算法模擬蛋白質與小分子受體相互作用。實驗結果用結合能來評估分子與靶點的結合能力，配體與 受體結合能量越低，結合構象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大，表明黃芩素與FOS的結合親和力（binding affinity）為-38.49 kJ/mol，黃芩素與PTGS2為-38.49 kJ/mol，山柰酚與FOS為-40.17 kJ/mol，木犀草素與PTGS2為-38.91 kJ/mol。本研究結果顯示溫陽益氣活血方的核心化合物與CHF共同靶點結合能均＜0，表明化合物與受體能自發(fā)結合，結合能≤-5 kJ/mol表明結合良好，小于-9 kJ/mol有較強的結合活性。分子對接的結合能結果見圖8，其中活性化合物與受體分子有強烈結合的對接模式，見圖9。結果證實溫陽益氣活血方與CHF的交集靶點蛋白有較好的結合活性。

圖7 靶點-通路作用圖Fig.7 Target-pathway action diagram

圖8 分子對接能量圖Fig.8 Energy of molecular docking

2 外周血真核細胞基因表達譜的試驗研究

2.1 試劑與材料

2.1.1 試劑 真核生物多ARNA控制試劑盒（批號900433，100 rxns，Affymetrix，-20 ℃），擴增試劑盒（批號1792，100 rxns，Ambion，-20 ℃），真核生物雜交控制試劑盒（批號900454，30 rxns，Affymetrix，-20 ℃），雜交、洗滌、染色試劑盒（批號900720，30 rxns，Affymetrix，4 ℃）。

2.1.2 藥物 鹽酸貝那普利片（洛汀新片，批號H20054771，深圳信立泰藥業(yè)公司），螺內酯片（批 號H42020343，武漢中聯四藥藥業(yè)公司），氫氯噻嗪片（批號H20058629，山西云鵬制藥公司），琥珀酸美托洛爾緩釋片（批號H20100167，阿斯利康制藥公司），地高辛片（批號AHG0335，杭州賽諾菲安萬特公司），5%葡萄糖注射液（批號H1098300，江西科倫藥業(yè)有限公司），溫陽益氣活血方顆粒劑（批號20010902，青海九康中藥飲片有限公司）。

圖9 分子對接模式圖Fig.9 Molecular docking pattern

2.1.3 儀器 超凈工作臺（CJT-16，北京長城有限公司），微量臺式離心機（5415D，Eppendorf公司），渦旋混合器（TDX-1，TonDa公司），移液器（P-2、P-20、P-200、P-1000，Eppendorf公司），離心管架（0.2 mL、0.5～1.5 mL，江蘇三和金冠公司），冰箱（BCD-223N，美菱公司），制冰機（SIM-F124，三洋公司），PCR儀（PTC-225，MJ公司），Magnetic Stand-96（AM10027，Ambion公司），紫外分光光度計（ND-1000，NanoDrop公司），凝膠成像儀（GDS-7600，UVP公司），恒溫金屬?。–HB-202，BIOER公司）；Hybridization Oven 640、Fluidics Station 450、GeneChip?Scanner 3000，均為Affymetrix公司。

2.2 方法

2.2.1 資料及臨床研究 2018年11月—2020年5月，從青海省中醫(yī)院招募的90名志愿者，分為對照組和試驗組。對照組為青海省中醫(yī)院治未病中心選取的30名健康人，安靜狀態(tài)下，采用抗凝管收集前臂靜脈血，后隨機抽取10例外周血用于有核細胞基因表達譜的差異檢測。試驗組為青海省中醫(yī)院住部心腎科選取的60名符合《2018中國心力衰竭診斷和治療指南》的患者（相應納入、排除、脫落標準均參照該指南）[12]。將試驗組60例CHF患者按隨機數字表法分成化學藥組和中西藥組，2組各30例患者。臨床研究經青海省中醫(yī)院倫理委員會批準（編號為qhszyy1102201601），所有參與者在研究之前均簽署知情同意書。

2.2.2 干預方法、標本采集及檢測指標 對照組：為青海省中醫(yī)院治未病中心選取的30名健康人，均經常規(guī)體檢后在安靜狀態(tài)下，采用抗凝管收集前臂靜脈血，后隨機抽取10例外周血用于有核細胞基因表達譜的差異檢測?；瘜W藥組：采用洛丁新片（10 mg/d）、氫氯噻嗪片（50 mg/d）、螺內酯片（40 mg/d）、倍他樂克片（23.75 mg/d）及地高辛片（0.125 mg/d）聯合用藥，每日1次，療程為15 d；中西藥組：在常規(guī)化學藥口服治療的基礎上聯合溫陽益氣活血方顆粒劑，6 g/次，2次/d，飯后30 min溫服，療程為15 d。藥物干預前后對所有患者進行臨床中醫(yī)癥狀積分評估、紐約心功能分級、心臟彩超檢查左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）[12-13]。安靜狀態(tài)下，采用抗凝管收集患者前臂靜脈血，并

將標本分為2份，1份采用全自動化學發(fā)光測定儀檢測血清腦鈉肽前體（brain natriuretic peptide，BNP），另1份標記后存放在-80 ℃冰箱，最后隨機抽取化學藥組和中西藥組中各5例治療前后的外周血用于有核細胞基因表達譜的差異檢測。

2.2.3 有效率分析 有效率評價標準參照國家藥品監(jiān)督管理局最新版《中藥新藥臨床研究指導原則》[14]，將中醫(yī)癥狀評分的“改善率”納為“有效率”，，改善率＞67%、改善率介于25%～67%、改善率＜25%，分別定義為顯效、好轉及無效。

改善率＝(治療前總分－治療后總分)/治療前總分

有效率=(顯著＋好轉) 例數/總例數

2.2.4 基因芯片表達檢測 CHF患者在入院后次日清晨安靜空腹狀態(tài)下，健康對照組在清晨安靜空腹狀態(tài)下，采用抗凝管收集患者前臂靜脈血，為減少樣本的污染，優(yōu)先采用其他采血管收集排出前1 mL血液。采用Affymetrix mRNA表達譜芯片檢測樣品的總RNA為起始，進行體外擴增和生物素標記，標記后進行芯片雜交、清洗、染色、掃描，使用AGCC軟件分析芯片的熒光圖像，結合生物信息學的轉錄組學及RNA技術分析溫陽益氣活血方的差異表達基因，本部分由北京博奧晶典生物技術有限公司完成。標記過程采用Ambion #1792 cRNA擴增標記試劑盒。實驗流程主要包括以下步驟。（1）反轉錄合成First strand cDNA：以Total RNA起始，含有T7啟動子序列的T7 Oligo（dT）Primer為引物，使用First Strand Enzyme Mix合成First strand cDNA。（2）合成Second strand DNA：用Second Strand Enzyme Mix將DNA-RNA雜合體中的RNA鏈轉化為Second Strand cDNA，合成雙鏈 DNA。（3）體外轉錄合成cRNA：以Second Strand cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，摻入生物素biotin。（4）cRNA純化：使用磁珠純化cRNA，除去鹽、酶等雜質，并對cRNA進行定量。（5）cRNA片段化：將cRNA片段化成適宜雜交的大小。（6）芯片雜交、清洗、染色、掃描。

2.2.5 差異基因的生物信息學分析 表達譜芯片分析溫陽益氣活血方的差異基因。使用KOBAS軟件進行KEGG通路富集分析，差異表達基因分析設定P＜0.05和|log2FC|＞1.2為篩選條件。log2FC＞1.2表明基因表達上調；log2FC＜-1.2表明基因表達下調。

2.2.6 RNA差異表達分析 主要使用AGCC軟件進行芯片清洗染色，后分析芯片的熒光圖像，進行RNA差異表達分析，比較中西藥組與化學藥組治療后的差異表達基因。P值取對數再取負值（-lgP），-lgP值越大說明miRNA顯著性水平越高。

繼新醫(yī)療改革政策的不斷推進，醫(yī)院財務管理的難度也逐漸增強，新醫(yī)改是對醫(yī)院財務人員一次嚴格的考驗與磨礪，在“時間緊、任務重”的情況下直接反映出財務人員的業(yè)務素質水平與工作效率。在這個重要的時刻，財務人員除了要全面掌握新會計制度的內容，更要用心去理解相關業(yè)務的原理，財務會計和預算會計對同一經濟事項該如何按新規(guī)定進行會計處理，涉及面之廣變化之多光靠死記硬背是不行的，要從根本原理上去理解型記憶。例如：在平行記賬法下，判斷一筆經濟業(yè)務對預算會計來說是否需要記賬，關鍵是要辨別該項業(yè)務在收付實現制下能否確認收入，如果它的結余會影響到當年的收支，那么就要確認收入，反之不確認。

差異LncRNA與差異mRNA的篩選：比較中西藥組與化學藥組治療后二者的差異表達。采用R語言包進行差異分析，獲得差異倍數并取對數（log2FC）。差異LncRNA與差異mRNA的定義為：|log2FC|＞1.2且P＜0.05，將log2FC＞1.2定義為表達上調，log2FC＜-1.2定義為表達下調。

2.2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，描述數據如年齡大小、病程長短等符合正態(tài)分布的數據均采用±s表示，各組治療前后采用配對t檢驗，組間比較采用成組t檢驗。計數資料如男女比列、心功能分級采用χ2檢驗。若不符合正態(tài)分布，則采用非參數檢驗。檢驗水平α＝0.05，P＜0.05認為有顯著性統(tǒng)計學差異，P＜0.01認為有極顯著性差異。

2.3 基因芯片實驗結果

2.3.1 一般臨床資料比較 2組患者男女總數屬正態(tài)分布，采用χ2檢驗，P＝0.432＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義；2組患者年齡大小，屬正態(tài)分布，使用獨立樣本t檢驗，P＝0.759＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義；2組患者病程長短屬正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗，P＝0.883＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義；試驗組2組患者藥物干預前心臟彩超LVEF值，使用獨立樣本t檢驗，P＝0.932＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義。2組患者入院心功能分級采用χ2檢驗，P＝0.432＞0.05，2組差異無統(tǒng)計學意義。以上指標均具有可比性（表2）。

表2 兩組患者一般資料比較 ( ±s)Table 2 Comparison of general data between two groups ( ±s)

表2 兩組患者一般資料比較 ( ±s)Table 2 Comparison of general data between two groups ( ±s)

n/例 心功能/例 組別 男 女 年齡/歲 病程/年 治療前LVEF/% II級 III級 化學藥 14 16 77.00±8.92 7.83±3.79 60.73±9.62 14 16 中西藥 11 19 76.30±8.66 7.97±3.16 60.93±8.55 11 19

2.3.2 血清BNP水平 試驗組2組患者藥物干預前后血清BNP水平均在正態(tài)分布范圍內，治療前采用獨立樣本t檢驗，P＝0.891＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義；2組治療后采用成組t檢驗，治療前后t值不同，P＜0.01，表明差異有統(tǒng)計學意義，且15 d療程后，血清BNP水平均下降，表明治療有效。2組患者經15 d治療后，血清BNP水平差異采用獨立樣本t檢驗，P＝0.041＜0.05，表明治療后2組患者血清BNP水平有明顯差異，且中西藥組治療效果優(yōu)于化學藥組（表3）。

2.3.3 中醫(yī)癥狀積分 2組患者入院前中醫(yī)癥狀積分比較采用獨立樣本t檢驗，P＝0.408＞0.05，兩組差異無統(tǒng)計學意義；2組經15 d治療后，治療前后及組間中醫(yī)癥狀積分療效評價采用秩和檢驗，P＝0.037＜0.05，表明2組患者藥物治療后中醫(yī)癥狀積分差異有統(tǒng)計學意義，且中西藥組治療效果優(yōu)于化學藥組（表4）。

2.3.4 心功能分級 2組患者經15 d治療后，評價治療前后心功能分級，療效標準參考紐約心功能評價[14]。心功能療效比較采用秩和檢驗，中西藥組有效率為87%，化學藥組為77%，P＝0.027＜0.05，表明2組患者藥物治療后心功能療效差異有統(tǒng)計學意義，且中西藥組治療效果優(yōu)于化學藥組（表5）。

2.3.6 芯片雜交結果分析 2組不同藥物干預后，外周血基因表達譜中15 886個基因表達上調（主要上調表達基因為ZNF331、TRAPPC10、SMAD7、MYC、RORA），26 754個基因表達下調（主要下調表達基因為RHOB、LRRN3）。結合網絡藥理學預測和|log2FC|，關鍵基因見表7。主要基因參與的富集信號通路見圖10。初步證實Th17細胞分化、B細胞受體信號通路、AMPK信號通路是關鍵通路，與芯片上調基因相關，可揭示溫陽益氣活血方治療CHF的作用機制。與網絡預測的結果相符合。

表3 血清BNP水平 ( ±s)Table 3 Levels of serum BNP ( ±s)

表3 血清BNP水平 ( ±s)Table 3 Levels of serum BNP ( ±s)

與同組治療前比較：**P＜0.01；與化學藥組治療后比較：#P＜0.05**P ＜ 0.01 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs chemical medicine group after treatment

組別 n/例 觀察時間 BNP/(pg·mL-1) 30 治療前 1 030.16±286.73 化學藥 治療后 572.01±180.14** 30 治療前 1 041.76±359.59 中西藥 治療后 470.92±194.77**#

表4 中醫(yī)癥狀積分比較 ( ±s)Table 4 Comparison of TCM symptom scores ( ±s)

表4 中醫(yī)癥狀積分比較 ( ±s)Table 4 Comparison of TCM symptom scores ( ±s)

與同組治療前比較：*P＜0.05；與化學藥組治療后比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs chemical medicine group after treatment

組別 n/例 觀察時間 中醫(yī)癥狀積分 30 治療前 24.90±2.48 化學藥 治療后 13.57±4.22* 30 治療前 25.57±3.61 中西藥 治療后 11.03±4.94*#

表5 心功能療效比較Table 5 Comparison of cardiac function and curative effect

表6 兩種藥物干預后有效率比較Table 6 Comparison of efficacy of two drugs after intervention

2.3.7 RNA差異表達分析結果 Cluater采用歸一化后的數據，聚類使用amap包的hcluster（method＝LinkMethod），繪圖采用heatmap.2?；瘜W藥組、中西藥組對比，繪制2組關鍵基因的mRNA、LncRNA熱圖（圖11）。由圖11表明，2組不同藥物（化學藥與中西藥）干預后與關鍵基因（表7中的基因）的差異表達密切相關。

表7 關鍵基因的芯片驗證Table 7 Microarray validation of key genes

構建ceRNA（LncRNA-miRNA-mRNA）網絡：通過mircode數據庫尋求差異LncRNA的靶基因miRNA，與自制芯片的miRNA取交集，再通過miRDB、miRTarBase、TargetScan數據庫尋求相應的mRNA，與自制芯片的mRNA取交集，最后Cytoscape繪制網絡圖。miRNA富集度分析，若P值相同，miRNA富集度越大，表明該miRNA受到實驗的影響越大；P＜0.01表示miRNA具有顯著性差異。lncRNA的|log2FC|≥2及mRNA的|log2FC|≥2。

采用桑基圖（圖12）展示以miRNA為聯系的LncRNA上游基因調控和mRNA下游基因調控。預測LncRNA干預CHF的主要基因包括：真核翻譯延伸因子1α1（EEF1A1P25）、干擾素誘導酶1（GVINP1）、嗅覺受體家族（OR2A9P）。OR2A9P是G蛋白偶聯受體成員，與鼻中氣味分子相互作用，啟動神經遞質-激素受體反應，作用于心血管系統(tǒng)。預測的相關miRNA與芯片驗證的關鍵基因相關：RHOB基因相關的miR-27a-3p可抑制血管內皮細胞的增殖、遷移，對血管重構具有保護作用；ZNF331的啟動子區(qū)甲基化可誘導miR-140-5p對脂多糖介導的血管內皮細胞增殖及分化具有濃度依賴性，是心血管疾病早期效應標志物；MYC基因與血清miR-129-5p水平密切相關，血清miR-129-5p水平可預判CHF患者預后，與LVEF相關。因此，上述預測的miRNA和基因也可用于溫陽益氣活血方的質量控制及疾病標志物篩選，為CHF的治療提供參考。

圖10 治療后化學藥組與中西藥組芯片上調基因信號通路富集分析Fig.10 Enrichment analysis of up-regulated gene signaling pathway in western medicine group and Chinese and western medicine group after treatment

3 討論

傳統(tǒng)溫陽益氣活血方為歷朝經驗集方，雖配伍各異，作用卻殊途同歸。其配伍原則如下：方中以附子、桂枝為君，附子善溫腎中命門之火，張景岳（擅長用附子）也稱之大能引火歸元，可見附子溫走三焦，其溫性用之中的，便可妙不盡言。桂枝可認為是不典型的“補陽藥”，又能入血分起溫陽活血通滯之用。人參、黃芪、熟地黃為臣。人參規(guī)格繁多，本方最適合配伍紅參，參經火制則陽氣增，徐靈胎曾認為民生、醫(yī)者皆濫用人參，但人參功效不可質疑，人參在培補元氣之余又能扶正祛邪；佐配伍黃芪，一者助參治氣虛之功，再者黃芪養(yǎng)血利水行滯助桂附益氣化瘀；熟地補精填髓，為陽氣化氣提供能源物質基礎。當歸、白芍、川芎為佐。川芎乃血中氣藥，在活血同時兼理氣作用，氣行則血行；當歸補血活血，一防血虛留瘀，二防行血傷血，另外防年高羸弱之人大便難；白芍使肝氣柔和調暢，不亢盛，惡血不歸于心，且兼酸甘化陰血之性。桃仁、紅花、赤芍為使。桃仁性平，行血但不耗血，同時佐當歸潤腸通便；紅花、赤芍一溫一涼，互相制約，共奏活血之效。

圖11 治療后化學藥組vs中西藥組熱圖Fig.11 Heat map of western medicine group vs Chinese medicine group after treatment

圖12 外周血基因芯片?；鶊DFig.12 Sankey map of peripheral blood gene microarray

基因芯片技術分析表明，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、AMPK通路是關鍵基因所富集的通路，三磷酸腺苷結合能是芯片GO差異分析的主要生物過程。腺苷酸活化蛋白激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶在進化過程中的一種高度保守狀態(tài)[15]，能啟動人體線粒體開始產能代謝，有“能量代謝總開關”之稱。其同源蛋白能參與真核生物細胞核的轉錄，也在介導的凋亡過程中被激活，因此被認為是凋亡的調節(jié)劑[16]。GO富集分析結果表明，溫陽益氣活血方的作用靶點在多種細胞組分中存在，并且以細胞質分布為主，以擴散-運輸的結合方式參與多種經典生物進程。MAPK信號轉導通路是一細胞內的經典通路（細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）[17]，其存在于大多數細胞內，從低等原核細胞至高等哺乳動物，在生物進化過程中有高度保守性，其將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并在引起細胞生物學反應（如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等）的過程中具有至關重要的作用。有實驗研究證實CHF可通過激活MAPK和PI3K/Akt信號通路[18-19]，使肺動脈平滑肌細胞大量增殖，最終導致肺動脈高壓[20]。

脂多糖是CHF的重要毒力因子，可誘導心肌細胞肥大，使心肌細胞體積增大[21]，心肌細胞骨架微絲密度增大，排列紊亂，其機制可能與Toll樣受體4/核因子κB（Toll-like receptor4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB）信號通路相關的炎癥反應有關[22]。提示溫陽益氣活血方”能通過多靶點、多通路，在CHF中起到關鍵治療作用。

Gui等[23]研究證實可通過AMPK信號通路上調自噬，抑制游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）的游離脂代謝，降低低氧環(huán)境下肺動脈平滑肌細胞誘導增殖的可能。有實驗數據顯示，在24 h缺氧密閉的大鼠肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)液中，添加高濃度FFA液，AMPK在內質網中翻譯的活性被抑制，而抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）能促進FFA被攝取利用，降低FFA在培養(yǎng)液中的濃度，而APS能降低CHF死亡風險，已被廣泛證實，CHF患者晚期不僅存在高FFA上限水平，而且也存在FFA融合利用障礙。CHF的血液循環(huán)多瘀，導致心肌細胞內FFA蓄積、ATP減少。

楊冬花等[24]研究發(fā)現，溫陽益氣活血方能通過抑制β3-腎上腺素受體（β3-adrenoceptor agonists，β3-AR）的表達減少I型前膠原羧基端原肽（type I procollagen carboxyl terminal propeptide，PICP）和III型前膠原氨基端肽（procollagen IIIN-termi，PIIINP）含量，逆轉心室重塑，從而改善心臟功能。李春陵等[25]探討溫陽益氣活血方通過抑制GATA結合蛋白4（GATA binding protein4，GATA4）的表達減少I型膠原含量，降低I型/III型膠原值，逆轉心室重塑，改善心臟功能。綜上所述，溫陽益氣活血方對CHF心室重塑是通過調控β3-AR、血清I型、III型膠原含量來控制LVEF、左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LEVDD）等主要效果指標，并且觀察組與對照組治療前后的實驗結果發(fā)現，觀察組總有效率明顯高于對照組（P＜0.05）；治療后，觀察組的LVEF指標顯著高于對照組，觀察組的LVESD、LVEDD均低于對照組（P＜0.05）。張聰聰等[26]探討溫陽益氣活血方通過化痰作用將轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/ Smads信號通路與肺動脈壓力相聯系并且起到調控的作用。

脂肪酶移位酶（fatty acid translocase，FAT）/ CD36T和肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1（carnitine palmitoyl transterase-1，CPT-1）是2個參與FFA轉運的關鍵酶[27]，與心肌、骨骼肌產能也密切相關。CD36是多種組織細胞膜上的糖蛋白，也是心臟FAT的主要形式。另外，分布于胞漿中的是FAT/CD36，CPT-1主要在線粒體膜上分布，其表達增加可促使FFA的跨膜運輸，進而線粒體氧化ATP增加，而CD36類似一種跨膜運輸反應的媒介催化劑，可加速FFA的攝取。但研究發(fā)現CHF時，上述2種關鍵酶均減少或者活性被抑制而降低，最終致使FFA的攝取和利用率障礙[28]。

可見APS在充分能抑制AMPK通路活性的情況下，FAT/CD36T和CPT-1的膜轉位表達，也受抑制，因此AMPK與2個關鍵酶存在共線關系，彼此間的活化或抑制是一種充分必要條件。因此改善APS成為CHF一種有前景的治療手段，APS催化CD36跨膜反應使心肌加大對FFA的攝取，從而心肌代謝底物的結構被改造，可能是“胚胎化”代謝底物的一種同分異構體，最終底物逆向化狀態(tài)被打破，進而改善CHF相關癥狀。

而研究者通過提取具有益氣活血功效的中藥化學成分作用AMPK信號通路時[29]，發(fā)現心肌細胞對FFA的利用率提高，心肌細胞的ATP代謝從最初的糖酵解和乳酸氧化反應逐漸轉變?yōu)橐灾舅嵫趸x為主導。這就是“逆向化狀態(tài)被打破”，同時其對肺動脈平滑肌細胞的大量增殖有逆轉作用，使肺動脈壓力降低，延緩肺血管重構。細胞增殖的中斷對低氧性肺動脈高壓有扭轉作用，甚至使病理機制改變，減輕肺血管阻力[20]。

又有研究者證實，紅景天聯合溫陽益氣活血方對低氧環(huán)境下心衰大鼠模型的肺動脈血管平滑肌細胞的誘導增殖有保護作用，溫陽益氣活血方類似于AMPK信號通路活化劑[30]。結果表明，紅景天單方、溫陽益氣活血方、加味紅景天方皆可通過AMPK通路逆轉肺動脈平滑肌細胞的增殖和胰島素抵抗，減少胰島細胞的損傷凋亡，加速心肌細胞對葡萄糖的利用[31]。最終證實紅景天單方、溫陽益氣活血方、加味紅景天方對CHF有治療作用。

miRNA是單鏈的非編碼小RNA，通過堿基互補配對原則將mRNA的3’或5’UTR區(qū)與特定靶基相結合，可直接降解mRNA或抑制相關蛋白質的翻譯過程，因此miRNA與疾病的發(fā)生、發(fā)展是密切相關的[32-33]。是多種生物過程的重要調控因子，如細胞重編程、增殖、凋亡、遷移等過程，miRNA在心肌細胞炎癥反應中參與重要調節(jié)功能。筆者通過自制Affymetrix mRNA芯片進行差異性分析，關鍵miRNA的篩選，并將LncRNA最具功能性的基因對溫陽益氣活血方治療CHF的mRNA核心基因進行調控。芯片篩選出的miR-140-5p表達隨脂多糖濃度的增高而降低[34]，脂多糖介導的KCNQ1重疊轉錄物1（KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1）參與血管內皮細胞遷移的調控，KCNQ1OT1通過競爭內源RNA抑制蛋白絡氨酸磷酸酶IVA型成員3（proteintyrosine phosphatase type IVA,member 3，PTP4A3）所介導的MAPK、PI3K/Akt信號通路[35]，這與芯片所富集出的通路相一致，miR-140-5p可作為CHF早期干預治療的效應標志物；miR-27a-3p抑制血管內皮細胞HUVECs，進而抑制主動脈中膜彈力纖維和膠原纖維的生成，影響血管重構，對CHF具有保護作用[36]；miR-129-5p可通過Wnt5a信號通路調節(jié)血管平滑肌[37]，而Wnt5a信號通路在自制芯片中參與差異改變，miR-129-5p可介導Wnt5a通路調節(jié)血清骨橋蛋白對炎癥的反應，誘導心肌細胞IL-17大量聚集[38]，減少脂蛋白受體攝取脂質，這也證實了網絡藥理學富集的IL-17通路是重要通路。CHF的心功能惡化癥狀與心肌細胞炎癥反應密切相關，進而減少炎癥反應發(fā)生。

綜上所述，可通過多層次、多通路、多靶點導致CHF的發(fā)生、發(fā)展，因此對于CHF的治療需要通過中藥組合的協(xié)同靶向作用，即多成分-多途徑-多靶點的發(fā)揮聯合治療作用。大數據的挖掘可節(jié)約科研成本，課題組將對關鍵基因、通路進行RT-PCR及Western blotting實驗驗證?，F從網絡藥理學理論出發(fā)將溫陽益氣活血方的藥物作用趨向與CHF靶標加以聯系分析，同時經CHF患者外周血基因芯片驗證，以期能進一步挖掘對CHF治療的潛在干預靶標與作用機制[39]，為中醫(yī)藥治療疑難疾病的臨床研究和新藥研制開發(fā)提供堅實理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突