呂李飛，吳俊松，茍江騰，趙成周，孫勝男，李忠寬，賈守寧，祁永福*

1.青海大學(xué) 青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016

2.生物芯片北京國(guó)家工程研究中心（博奧生物），北京 102266

3.青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001

4.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指各種心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，致使心室充盈或射血功能受損，心排血量不能滿足機(jī)體組織代謝需要而引起的一組綜合征，是多種心血管疾病主要死因。也是各種心血管系統(tǒng)疾病的最終轉(zhuǎn)歸，目前臨床主要以神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)治療為主，如血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（angiotensin receptor neprilysin inhibitor，ARNI）類藥物，可抑制血管緊張素受體表達(dá)和增強(qiáng)利鈉肽系統(tǒng)作用[1]。但究其根本為對(duì)癥治療，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。目前CHF的病死率和復(fù)發(fā)率一直逐年增長(zhǎng)，隨著人口老齡化不斷加劇，已成為我國(guó)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[2]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)將心衰歸為“心水”“怔忡”范疇。西晉王叔和《脈經(jīng)》提出“肝著其根，心氣因起，陽(yáng)行四肢，肺氣亭亭，喘息則安?！逼洳±硇再|(zhì)屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛為心之氣血陰陽(yáng)虛衰，臟腑功能失調(diào)；標(biāo)實(shí)為痰濁、瘀血、水飲、氣滯。心氣虛是病理基礎(chǔ)，血瘀是中心環(huán)節(jié)，痰飲和水濕是主要的病理產(chǎn)物。據(jù)此，治以溫陽(yáng)益氣活血法，方用溫陽(yáng)益氣活血方治療。

溫陽(yáng)益氣活血方是青海省中醫(yī)院名老中醫(yī)自擬驗(yàn)方，由制附子、桂枝、黃芪、人參、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、赤芍、川芎、桃仁、紅花11味中藥組成，具有溫陽(yáng)益氣、活血化瘀之功效，使機(jī)體正存邪祛、陰陽(yáng)乃固，故臨床多用于心血管疾病，青海省中醫(yī)院心腎科前期將溫陽(yáng)益氣活血方進(jìn)行臨床研究，有明顯臨床療效，后將其制成顆粒劑，目前對(duì)在院CHF患者應(yīng)用廣泛[3]。但中藥復(fù)方是一種混合物，療效的整體性體現(xiàn)在對(duì)人體全方位多靶點(diǎn)方面，因此從分子水平闡述溫陽(yáng)益氣活血方防治CHF的作用機(jī)制是中藥藥理學(xué)亟待解決的重要問(wèn)題，也是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)、臨床研究獲取理論依據(jù)的必經(jīng)之路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可整合中藥成分與靶標(biāo)間相互作用關(guān)系、靶標(biāo)與靶標(biāo)間相互作用關(guān)系；分子對(duì)接是預(yù)測(cè)受體與配體相互作用和反應(yīng)機(jī)制的模擬化手段，二者聯(lián)合應(yīng)用有助于發(fā)現(xiàn)中藥的潛在機(jī)制[4]。

目前溫陽(yáng)益氣活血方改善CHF的效應(yīng)機(jī)制尚不明確，本研究從外周血真核細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究角度，采用芯片檢測(cè)2種方法干預(yù)后，化學(xué)藥組與中西藥組外周血的差異表達(dá)基因，結(jié)合RNA的差異表達(dá)分析，初步判斷基因表達(dá)的關(guān)鍵變化可能改變相關(guān)基因功能，為溫陽(yáng)益氣活血方治療CHF的作用機(jī)制提供研究資料和方向。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.1 資料與方法

1.1.1 溫陽(yáng)益氣活血方的潛在活性化學(xué)成分及靶點(diǎn)收集和篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，依次檢索白芍、赤芍、川芎等11味中藥的化學(xué)成分，名稱按《中國(guó)藥典》2020年版的植物名稱進(jìn)行規(guī)范，根據(jù)化學(xué)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行篩選，參考TCMSP自設(shè)定意見(jiàn)的篩選條件[5]，通過(guò)篩選得到符合條件的潛在活性成分。另外，結(jié)合中國(guó)知網(wǎng)、維普、萬(wàn)方、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)未納入的潛在化學(xué)成分進(jìn)行補(bǔ)充。

1.1.2 CHF潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及篩選 從NCBI平臺(tái)下的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）以“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞，選擇物種為“homo sapiens”，研究類型為“expression profiling by array”，檢索CHF的基因芯片。選取基因芯片GSE9128（包含3個(gè)正常樣本，樣本編號(hào)為GSM231003、GSM231003、GSM231005；8個(gè)CHF樣本，樣本編號(hào)為（GS-M231006～GSM231013）及其平臺(tái)數(shù)據(jù)GPL96下載后使用R軟件包，設(shè)定P＜0.05和|log2（fold change，F(xiàn)C）|＞0.5，分別繪制熱圖與火山圖。

1.1.3 “中藥-成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)以上預(yù)測(cè)結(jié)果，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)模型，節(jié)點(diǎn)（node）代表單味藥種類、潛在活性化合物、共同作用靶點(diǎn)與疾?。–HF）；邊（edge）用于連接中藥與化合物、化合物與交集靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾?。–HF）、疾病（CHF）與中藥，展現(xiàn)“中藥-化合物-交集靶點(diǎn)-疾病”之間的聯(lián)系，尋找發(fā)揮重要作用的活性成分[6]。

1.1.4 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)是指從生物化學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳網(wǎng)絡(luò)的角度研究化合物和疾病相關(guān)蛋白分子之間的相關(guān)性。將溫陽(yáng)益氣活血方治療CHF的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），限定研究物種為“homo sapiens”，獲得PPI關(guān)系，導(dǎo)出保存為TSV格式文件。將該文件中包含node1、node2和combined score的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)[7]，設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小代表度（degree）值，節(jié)點(diǎn)越大，表示其度值越大，最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 基因本體論（genetic ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 GO功能富集分析是對(duì)差異基因的生物途徑進(jìn)行注釋及分類并進(jìn)行富集統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；KEGG通路富集分析是東京大學(xué)和京都大學(xué)共同研制的數(shù)據(jù)庫(kù)，可查詢通路[8]。將溫陽(yáng)益氣活血方治療CHF的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)，限定研究物種為“homo sapiens”，選擇GO下的分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）3個(gè)部分進(jìn)行GO富集分析[9]，選擇pathway分析下的KEGG pathway，設(shè)定顯著性為P＜0.05，進(jìn)一步尋找活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的主要功能與體內(nèi)通路。然后導(dǎo)出文件，對(duì)P值取負(fù)對(duì)數(shù)（-lgP），P值越小，-lgP越大，富集程度越大，反之亦然。利用R語(yǔ)言的Cluster Profiler工具包對(duì)GO分析和KEGG通路富集分析中的通路繪制條形圖。

根據(jù)上述所得到的核心靶點(diǎn)、GO通路富集程度前15、5、13的信息以及KEGG富集程度前20的通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，得到“靶點(diǎn)-BP-CC-MF- KEGG”網(wǎng)絡(luò)。

1.1.6 核心活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.pdb.org/）下載5個(gè)核心靶標(biāo)的晶體結(jié)構(gòu)，去除水分子、加氫后使用Autodock Tool 4.2（ADT）保存為pdbqt格式。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載6個(gè)核心成分的MOL2，并使用ChemDraw 3D軟件將其能量最小化，再導(dǎo)入ADT后保存為pdbqt格式。采用Autodock Vina對(duì)6個(gè)核心成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證[10]。用結(jié)合能來(lái)評(píng)估分子與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，結(jié)合能＜0表明能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5 kJ/mol表明結(jié)合良好。

1.2 結(jié)果

1.2.1 溫陽(yáng)益氣活血方潛在活性化合物篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，在口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[5]條件下，獲取11味中藥的138個(gè)有效成分（表1），包括并篩選得到有效成分所對(duì)應(yīng)的236個(gè)靶點(diǎn)（剔除重復(fù)項(xiàng)后）。

表1 溫陽(yáng)益氣活血方主要活性化合物篩選結(jié)果Table 1 Screening results of main active compounds in Wenyang Yiqi Huoxue Recipe

續(xù)表1

1.2.2 CHF潛在作用靶點(diǎn) 從GSE9128中獲得395個(gè)差異基因（176個(gè)上調(diào)、219個(gè)下調(diào)），選擇上調(diào)基因和下調(diào)基因各20個(gè)繪制熱圖（圖1），其中C代表正常組，T代表CHF組。所有差異基因繪制火山圖（圖2），紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，黑色代表無(wú)顯著性差異的基因。

1.2.3 交集靶點(diǎn)的獲取 通過(guò)venny在線平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/toosls/venny/index2.0.2html），在sheet1輸入成分靶點(diǎn)，sheet2輸入CHF的差異基因，獲取中藥治療CHF的17個(gè)交集靶點(diǎn)。將中藥、成分、交集靶點(diǎn)及疾病導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行“中藥-成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。并通過(guò)Cytoscape分析得到編號(hào)為MOL000098、MOL000358、MOL000422、MOL000006、MOL000449、MOL002714的成分度值最大，為核心成分（圖3），分別是槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（stigmasterol）、黃芩素（baicalein），為溫陽(yáng)益氣活血方篩選出的6個(gè)改善CHF的潛在核心活性成分。

圖1 差異基因熱圖Fig.1 Thermal maps of differential genes

圖2 差異基因火山圖Fig.2 Volcanic maps of differential genes

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行分析。Cytoscape分析得到磷酸化原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、白細(xì)胞介素1β（recombinant human interleukin-1 beta，IL1B）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、Fos原癌基因（Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit，F(xiàn)OS)、髓細(xì)胞增生蛋白（myelocytomatosisproteins，MYC）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）等靶點(diǎn)的度值較大，是核心靶點(diǎn)（圖4）。

圖3 “中藥-成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of “TCM-component-intersection target-disease”

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI Networks

1.2.5 GO和KEGG富集分析 利用R語(yǔ)言的Cluster Profiler工具包，設(shè)置P＜0.05、q＜0.05進(jìn)行GO和KEGG富集分析，根據(jù)矯正后P值篩選前20條進(jìn)行作圖。將前20條通路及通路所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行作圖。

GO通路分析結(jié)果顯示，BP富集基因程度包括：生熱、對(duì)肌肉拉伸的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)等；CC富集基因程度包括：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物、核染色質(zhì)等；MF富集基因程度包括：R-Smad結(jié)合、E-box結(jié)合、RNA聚合酶II激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等（圖5）。

KEGG富集分析共富集89條通路，結(jié)果顯示溫陽(yáng)益氣活血方治療CHF的17個(gè)潛在作用靶點(diǎn)主要參與的關(guān)鍵通路是癌癥的通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、慢性粒細(xì)胞性白血病、百日咳、軍團(tuán)菌病、人巨細(xì)胞病毒感染等[11]（圖6、7）。

圖5 GO分析“BP-CC-MF”圖Fig.5 GO Analysis “BP-CC-MF”

圖6 KEGG富集分析氣泡圖Fig.6 KEGG Air bubbles before enrichment analysis

1.2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 在“中藥-成分-交集靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析中，通過(guò)Cytoscape分析得到排名前6的核心化合物是MOL000098（槲皮素）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000422（山柰酚）、MOL000006（木犀草素）、MOL000449（豆甾醇）、MOL002714（黃芩素）。分子對(duì)接驗(yàn)證通過(guò)匹配原則算法模擬蛋白質(zhì)與小分子受體相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用結(jié)合能來(lái)評(píng)估分子與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，配體與 受體結(jié)合能量越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大，表明黃芩素與FOS的結(jié)合親和力（binding affinity）為-38.49 kJ/mol，黃芩素與PTGS2為-38.49 kJ/mol，山柰酚與FOS為-40.17 kJ/mol，木犀草素與PTGS2為-38.91 kJ/mol。本研究結(jié)果顯示溫陽(yáng)益氣活血方的核心化合物與CHF共同靶點(diǎn)結(jié)合能均＜0，表明化合物與受體能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5 kJ/mol表明結(jié)合良好，小于-9 kJ/mol有較強(qiáng)的結(jié)合活性。分子對(duì)接的結(jié)合能結(jié)果見(jiàn)圖8，其中活性化合物與受體分子有強(qiáng)烈結(jié)合的對(duì)接模式，見(jiàn)圖9。結(jié)果證實(shí)溫陽(yáng)益氣活血方與CHF的交集靶點(diǎn)蛋白有較好的結(jié)合活性。

圖7 靶點(diǎn)-通路作用圖Fig.7 Target-pathway action diagram

圖8 分子對(duì)接能量圖Fig.8 Energy of molecular docking

2 外周血真核細(xì)胞基因表達(dá)譜的試驗(yàn)研究

2.1 試劑與材料

2.1.1 試劑 真核生物多ARNA控制試劑盒（批號(hào)900433，100 rxns，Affymetrix，-20 ℃），擴(kuò)增試劑盒（批號(hào)1792，100 rxns，Ambion，-20 ℃），真核生物雜交控制試劑盒（批號(hào)900454，30 rxns，Affymetrix，-20 ℃），雜交、洗滌、染色試劑盒（批號(hào)900720，30 rxns，Affymetrix，4 ℃）。

2.1.2 藥物 鹽酸貝那普利片（洛汀新片，批號(hào)H20054771，深圳信立泰藥業(yè)公司），螺內(nèi)酯片（批 號(hào)H42020343，武漢中聯(lián)四藥藥業(yè)公司），氫氯噻嗪片（批號(hào)H20058629，山西云鵬制藥公司），琥珀酸美托洛爾緩釋片（批號(hào)H20100167，阿斯利康制藥公司），地高辛片（批號(hào)AHG0335，杭州賽諾菲安萬(wàn)特公司），5%葡萄糖注射液（批號(hào)H1098300，江西科倫藥業(yè)有限公司），溫陽(yáng)益氣活血方顆粒劑（批號(hào)20010902，青海九康中藥飲片有限公司）。

圖9 分子對(duì)接模式圖Fig.9 Molecular docking pattern

2.1.3 儀器 超凈工作臺(tái)（CJT-16，北京長(zhǎng)城有限公司），微量臺(tái)式離心機(jī)（5415D，Eppendorf公司），渦旋混合器（TDX-1，TonDa公司），移液器（P-2、P-20、P-200、P-1000，Eppendorf公司），離心管架（0.2 mL、0.5～1.5 mL，江蘇三和金冠公司），冰箱（BCD-223N，美菱公司），制冰機(jī)（SIM-F124，三洋公司），PCR儀（PTC-225，MJ公司），Magnetic Stand-96（AM10027，Ambion公司），紫外分光光度計(jì)（ND-1000，NanoDrop公司），凝膠成像儀（GDS-7600，UVP公司），恒溫金屬?。–HB-202，BIOER公司）；Hybridization Oven 640、Fluidics Station 450、GeneChip?Scanner 3000，均為Affymetrix公司。

2.2 方法

2.2.1 資料及臨床研究 2018年11月—2020年5月，從青海省中醫(yī)院招募的90名志愿者，分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組為青海省中醫(yī)院治未病中心選取的30名健康人，安靜狀態(tài)下，采用抗凝管收集前臂靜脈血，后隨機(jī)抽取10例外周血用于有核細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異檢測(cè)。試驗(yàn)組為青海省中醫(yī)院住部心腎科選取的60名符合《2018中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南》的患者（相應(yīng)納入、排除、脫落標(biāo)準(zhǔn)均參照該指南）[12]。將試驗(yàn)組60例CHF患者按隨機(jī)數(shù)字表法分成化學(xué)藥組和中西藥組，2組各30例患者。臨床研究經(jīng)青海省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)為qhszyy1102201601），所有參與者在研究之前均簽署知情同意書。

2.2.2 干預(yù)方法、標(biāo)本采集及檢測(cè)指標(biāo) 對(duì)照組：為青海省中醫(yī)院治未病中心選取的30名健康人，均經(jīng)常規(guī)體檢后在安靜狀態(tài)下，采用抗凝管收集前臂靜脈血，后隨機(jī)抽取10例外周血用于有核細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異檢測(cè)?；瘜W(xué)藥組：采用洛丁新片（10 mg/d）、氫氯噻嗪片（50 mg/d）、螺內(nèi)酯片（40 mg/d）、倍他樂(lè)克片（23.75 mg/d）及地高辛片（0.125 mg/d）聯(lián)合用藥，每日1次，療程為15 d；中西藥組：在常規(guī)化學(xué)藥口服治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合溫陽(yáng)益氣活血方顆粒劑，6 g/次，2次/d，飯后30 min溫服，療程為15 d。藥物干預(yù)前后對(duì)所有患者進(jìn)行臨床中醫(yī)癥狀積分評(píng)估、紐約心功能分級(jí)、心臟彩超檢查左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）[12-13]。安靜狀態(tài)下，采用抗凝管收集患者前臂靜脈血，并

將標(biāo)本分為2份，1份采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀檢測(cè)血清腦鈉肽前體（brain natriuretic peptide，BNP），另1份標(biāo)記后存放在-80 ℃冰箱，最后隨機(jī)抽取化學(xué)藥組和中西藥組中各5例治療前后的外周血用于有核細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異檢測(cè)。

2.2.3 有效率分析 有效率評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局最新版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[14]，將中醫(yī)癥狀評(píng)分的“改善率”納為“有效率”，，改善率＞67%、改善率介于25%～67%、改善率＜25%，分別定義為顯效、好轉(zhuǎn)及無(wú)效。

改善率＝(治療前總分－治療后總分)/治療前總分

有效率=(顯著＋好轉(zhuǎn)) 例數(shù)/總例數(shù)

2.2.4 基因芯片表達(dá)檢測(cè) CHF患者在入院后次日清晨安靜空腹?fàn)顟B(tài)下，健康對(duì)照組在清晨安靜空腹?fàn)顟B(tài)下，采用抗凝管收集患者前臂靜脈血，為減少樣本的污染，優(yōu)先采用其他采血管收集排出前1 mL血液。采用Affymetrix mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)樣品的總RNA為起始，進(jìn)行體外擴(kuò)增和生物素標(biāo)記，標(biāo)記后進(jìn)行芯片雜交、清洗、染色、掃描，使用AGCC軟件分析芯片的熒光圖像，結(jié)合生物信息學(xué)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及RNA技術(shù)分析溫陽(yáng)益氣活血方的差異表達(dá)基因，本部分由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。標(biāo)記過(guò)程采用Ambion #1792 cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒。實(shí)驗(yàn)流程主要包括以下步驟。（1）反轉(zhuǎn)錄合成First strand cDNA：以Total RNA起始，含有T7啟動(dòng)子序列的T7 Oligo（dT）Primer為引物，使用First Strand Enzyme Mix合成First strand cDNA。（2）合成Second strand DNA：用Second Strand Enzyme Mix將DNA-RNA雜合體中的RNA鏈轉(zhuǎn)化為Second Strand cDNA，合成雙鏈 DNA。（3）體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA：以Second Strand cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，摻入生物素biotin。（4）cRNA純化：使用磁珠純化cRNA，除去鹽、酶等雜質(zhì)，并對(duì)cRNA進(jìn)行定量。（5）cRNA片段化：將cRNA片段化成適宜雜交的大小。（6）芯片雜交、清洗、染色、掃描。

2.2.5 差異基因的生物信息學(xué)分析 表達(dá)譜芯片分析溫陽(yáng)益氣活血方的差異基因。使用KOBAS軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析，差異表達(dá)基因分析設(shè)定P＜0.05和|log2FC|＞1.2為篩選條件。log2FC＞1.2表明基因表達(dá)上調(diào)；log2FC＜-1.2表明基因表達(dá)下調(diào)。

2.2.6 RNA差異表達(dá)分析 主要使用AGCC軟件進(jìn)行芯片清洗染色，后分析芯片的熒光圖像，進(jìn)行RNA差異表達(dá)分析，比較中西藥組與化學(xué)藥組治療后的差異表達(dá)基因。P值取對(duì)數(shù)再取負(fù)值（-lgP），-lgP值越大說(shuō)明miRNA顯著性水平越高。

繼新醫(yī)療改革政策的不斷推進(jìn)，醫(yī)院財(cái)務(wù)管理的難度也逐漸增強(qiáng)，新醫(yī)改是對(duì)醫(yī)院財(cái)務(wù)人員一次嚴(yán)格的考驗(yàn)與磨礪，在“時(shí)間緊、任務(wù)重”的情況下直接反映出財(cái)務(wù)人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)水平與工作效率。在這個(gè)重要的時(shí)刻，財(cái)務(wù)人員除了要全面掌握新會(huì)計(jì)制度的內(nèi)容，更要用心去理解相關(guān)業(yè)務(wù)的原理，財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)和預(yù)算會(huì)計(jì)對(duì)同一經(jīng)濟(jì)事項(xiàng)該如何按新規(guī)定進(jìn)行會(huì)計(jì)處理，涉及面之廣變化之多光靠死記硬背是不行的，要從根本原理上去理解型記憶。例如：在平行記賬法下，判斷一筆經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)對(duì)預(yù)算會(huì)計(jì)來(lái)說(shuō)是否需要記賬，關(guān)鍵是要辨別該項(xiàng)業(yè)務(wù)在收付實(shí)現(xiàn)制下能否確認(rèn)收入，如果它的結(jié)余會(huì)影響到當(dāng)年的收支，那么就要確認(rèn)收入，反之不確認(rèn)。

差異LncRNA與差異mRNA的篩選：比較中西藥組與化學(xué)藥組治療后二者的差異表達(dá)。采用R語(yǔ)言包進(jìn)行差異分析，獲得差異倍數(shù)并取對(duì)數(shù)（log2FC）。差異LncRNA與差異mRNA的定義為：|log2FC|＞1.2且P＜0.05，將log2FC＞1.2定義為表達(dá)上調(diào)，log2FC＜-1.2定義為表達(dá)下調(diào)。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，描述數(shù)據(jù)如年齡大小、病程長(zhǎng)短等符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均采用±s表示，各組治療前后采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料如男女比列、心功能分級(jí)采用χ2檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平α＝0.05，P＜0.05認(rèn)為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01認(rèn)為有極顯著性差異。

2.3 基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 一般臨床資料比較 2組患者男女總數(shù)屬正態(tài)分布，采用χ2檢驗(yàn)，P＝0.432＞0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2組患者年齡大小，屬正態(tài)分布，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＝0.759＞0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2組患者病程長(zhǎng)短屬正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＝0.883＞0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)組2組患者藥物干預(yù)前心臟彩超LVEF值，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＝0.932＞0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組患者入院心功能分級(jí)采用χ2檢驗(yàn)，P＝0.432＞0.05，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上指標(biāo)均具有可比性（表2）。

表2 兩組患者一般資料比較 ( ±s)Table 2 Comparison of general data between two groups ( ±s)

表2 兩組患者一般資料比較 ( ±s)Table 2 Comparison of general data between two groups ( ±s)

n/例 心功能/例 組別 男 女 年齡/歲 病程/年 治療前LVEF/% II級(jí) III級(jí) 化學(xué)藥 14 16 77.00±8.92 7.83±3.79 60.73±9.62 14 16 中西藥 11 19 76.30±8.66 7.97±3.16 60.93±8.55 11 19

2.3.2 血清BNP水平 試驗(yàn)組2組患者藥物干預(yù)前后血清BNP水平均在正態(tài)分布范圍內(nèi)，治療前采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＝0.891＞0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2組治療后采用成組t檢驗(yàn)，治療前后t值不同，P＜0.01，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且15 d療程后，血清BNP水平均下降，表明治療有效。2組患者經(jīng)15 d治療后，血清BNP水平差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＝0.041＜0.05，表明治療后2組患者血清BNP水平有明顯差異，且中西藥組治療效果優(yōu)于化學(xué)藥組（表3）。

2.3.3 中醫(yī)癥狀積分 2組患者入院前中醫(yī)癥狀積分比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＝0.408＞0.05，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2組經(jīng)15 d治療后，治療前后及組間中醫(yī)癥狀積分療效評(píng)價(jià)采用秩和檢驗(yàn)，P＝0.037＜0.05，表明2組患者藥物治療后中醫(yī)癥狀積分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中西藥組治療效果優(yōu)于化學(xué)藥組（表4）。

2.3.4 心功能分級(jí) 2組患者經(jīng)15 d治療后，評(píng)價(jià)治療前后心功能分級(jí)，療效標(biāo)準(zhǔn)參考紐約心功能評(píng)價(jià)[14]。心功能療效比較采用秩和檢驗(yàn)，中西藥組有效率為87%，化學(xué)藥組為77%，P＝0.027＜0.05，表明2組患者藥物治療后心功能療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中西藥組治療效果優(yōu)于化學(xué)藥組（表5）。

2.3.6 芯片雜交結(jié)果分析 2組不同藥物干預(yù)后，外周血基因表達(dá)譜中15 886個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（主要上調(diào)表達(dá)基因?yàn)閆NF331、TRAPPC10、SMAD7、MYC、RORA），26 754個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（主要下調(diào)表達(dá)基因?yàn)镽HOB、LRRN3）。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和|log2FC|，關(guān)鍵基因見(jiàn)表7。主要基因參與的富集信號(hào)通路見(jiàn)圖10。初步證實(shí)Th17細(xì)胞分化、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路是關(guān)鍵通路，與芯片上調(diào)基因相關(guān)，可揭示溫陽(yáng)益氣活血方治療CHF的作用機(jī)制。與網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的結(jié)果相符合。

表3 血清BNP水平 ( ±s)Table 3 Levels of serum BNP ( ±s)

表3 血清BNP水平 ( ±s)Table 3 Levels of serum BNP ( ±s)

與同組治療前比較：**P＜0.01；與化學(xué)藥組治療后比較：#P＜0.05**P ＜ 0.01 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs chemical medicine group after treatment

組別 n/例 觀察時(shí)間 BNP/(pg·mL-1) 30 治療前 1 030.16±286.73 化學(xué)藥 治療后 572.01±180.14** 30 治療前 1 041.76±359.59 中西藥 治療后 470.92±194.77**#

表4 中醫(yī)癥狀積分比較 ( ±s)Table 4 Comparison of TCM symptom scores ( ±s)

表4 中醫(yī)癥狀積分比較 ( ±s)Table 4 Comparison of TCM symptom scores ( ±s)

與同組治療前比較：*P＜0.05；與化學(xué)藥組治療后比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs chemical medicine group after treatment

組別 n/例 觀察時(shí)間 中醫(yī)癥狀積分 30 治療前 24.90±2.48 化學(xué)藥 治療后 13.57±4.22* 30 治療前 25.57±3.61 中西藥 治療后 11.03±4.94*#

表5 心功能療效比較Table 5 Comparison of cardiac function and curative effect

表6 兩種藥物干預(yù)后有效率比較Table 6 Comparison of efficacy of two drugs after intervention

2.3.7 RNA差異表達(dá)分析結(jié)果 Cluater采用歸一化后的數(shù)據(jù)，聚類使用amap包的hcluster（method＝LinkMethod），繪圖采用heatmap.2。化學(xué)藥組、中西藥組對(duì)比，繪制2組關(guān)鍵基因的mRNA、LncRNA熱圖（圖11）。由圖11表明，2組不同藥物（化學(xué)藥與中西藥）干預(yù)后與關(guān)鍵基因（表7中的基因）的差異表達(dá)密切相關(guān)。

表7 關(guān)鍵基因的芯片驗(yàn)證Table 7 Microarray validation of key genes

構(gòu)建ceRNA（LncRNA-miRNA-mRNA）網(wǎng)絡(luò)：通過(guò)mircode數(shù)據(jù)庫(kù)尋求差異LncRNA的靶基因miRNA，與自制芯片的miRNA取交集，再通過(guò)miRDB、miRTarBase、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)尋求相應(yīng)的mRNA，與自制芯片的mRNA取交集，最后Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖。miRNA富集度分析，若P值相同，miRNA富集度越大，表明該miRNA受到實(shí)驗(yàn)的影響越大；P＜0.01表示miRNA具有顯著性差異。lncRNA的|log2FC|≥2及mRNA的|log2FC|≥2。

采用?；鶊D（圖12）展示以miRNA為聯(lián)系的LncRNA上游基因調(diào)控和mRNA下游基因調(diào)控。預(yù)測(cè)LncRNA干預(yù)CHF的主要基因包括：真核翻譯延伸因子1α1（EEF1A1P25）、干擾素誘導(dǎo)酶1（GVINP1）、嗅覺(jué)受體家族（OR2A9P）。OR2A9P是G蛋白偶聯(lián)受體成員，與鼻中氣味分子相互作用，啟動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)-激素受體反應(yīng)，作用于心血管系統(tǒng)。預(yù)測(cè)的相關(guān)miRNA與芯片驗(yàn)證的關(guān)鍵基因相關(guān)：RHOB基因相關(guān)的miR-27a-3p可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，對(duì)血管重構(gòu)具有保護(hù)作用；ZNF331的啟動(dòng)子區(qū)甲基化可誘導(dǎo)miR-140-5p對(duì)脂多糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及分化具有濃度依賴性，是心血管疾病早期效應(yīng)標(biāo)志物；MYC基因與血清miR-129-5p水平密切相關(guān)，血清miR-129-5p水平可預(yù)判CHF患者預(yù)后，與LVEF相關(guān)。因此，上述預(yù)測(cè)的miRNA和基因也可用于溫陽(yáng)益氣活血方的質(zhì)量控制及疾病標(biāo)志物篩選，為CHF的治療提供參考。

圖10 治療后化學(xué)藥組與中西藥組芯片上調(diào)基因信號(hào)通路富集分析Fig.10 Enrichment analysis of up-regulated gene signaling pathway in western medicine group and Chinese and western medicine group after treatment

3 討論

傳統(tǒng)溫陽(yáng)益氣活血方為歷朝經(jīng)驗(yàn)集方，雖配伍各異，作用卻殊途同歸。其配伍原則如下：方中以附子、桂枝為君，附子善溫腎中命門之火，張景岳（擅長(zhǎng)用附子）也稱之大能引火歸元，可見(jiàn)附子溫走三焦，其溫性用之中的，便可妙不盡言。桂枝可認(rèn)為是不典型的“補(bǔ)陽(yáng)藥”，又能入血分起溫陽(yáng)活血通滯之用。人參、黃芪、熟地黃為臣。人參規(guī)格繁多，本方最適合配伍紅參，參經(jīng)火制則陽(yáng)氣增，徐靈胎曾認(rèn)為民生、醫(yī)者皆濫用人參，但人參功效不可質(zhì)疑，人參在培補(bǔ)元?dú)庵嘤帜芊稣钚?；佐配伍黃芪，一者助參治氣虛之功，再者黃芪養(yǎng)血利水行滯助桂附益氣化瘀；熟地補(bǔ)精填髓，為陽(yáng)氣化氣提供能源物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)歸、白芍、川芎為佐。川芎乃血中氣藥，在活血同時(shí)兼理氣作用，氣行則血行；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，一防血虛留瘀，二防行血傷血，另外防年高羸弱之人大便難；白芍使肝氣柔和調(diào)暢，不亢盛，惡血不歸于心，且兼酸甘化陰血之性。桃仁、紅花、赤芍為使。桃仁性平，行血但不耗血，同時(shí)佐當(dāng)歸潤(rùn)腸通便；紅花、赤芍一溫一涼，互相制約，共奏活血之效。

圖11 治療后化學(xué)藥組vs中西藥組熱圖Fig.11 Heat map of western medicine group vs Chinese medicine group after treatment

圖12 外周血基因芯片?；鶊DFig.12 Sankey map of peripheral blood gene microarray

基因芯片技術(shù)分析表明，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、AMPK通路是關(guān)鍵基因所富集的通路，三磷酸腺苷結(jié)合能是芯片GO差異分析的主要生物過(guò)程。腺苷酸活化蛋白激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶在進(jìn)化過(guò)程中的一種高度保守狀態(tài)[15]，能啟動(dòng)人體線粒體開(kāi)始產(chǎn)能代謝，有“能量代謝總開(kāi)關(guān)”之稱。其同源蛋白能參與真核生物細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄，也在介導(dǎo)的凋亡過(guò)程中被激活，因此被認(rèn)為是凋亡的調(diào)節(jié)劑[16]。GO富集分析結(jié)果表明，溫陽(yáng)益氣活血方的作用靶點(diǎn)在多種細(xì)胞組分中存在，并且以細(xì)胞質(zhì)分布為主，以擴(kuò)散-運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)合方式參與多種經(jīng)典生物進(jìn)程。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典通路（細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）[17]，其存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，從低等原核細(xì)胞至高等哺乳動(dòng)物，在生物進(jìn)化過(guò)程中有高度保守性，其將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并在引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)（如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用。有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)CHF可通過(guò)激活MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路[18-19]，使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大量增殖，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[20]。

脂多糖是CHF的重要毒力因子，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，使心肌細(xì)胞體積增大[21]，心肌細(xì)胞骨架微絲密度增大，排列紊亂，其機(jī)制可能與Toll樣受體4/核因子κB（Toll-like receptor4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)的炎癥反應(yīng)有關(guān)[22]。提示溫陽(yáng)益氣活血方”能通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路，在CHF中起到關(guān)鍵治療作用。

Gui等[23]研究證實(shí)可通過(guò)AMPK信號(hào)通路上調(diào)自噬，抑制游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的游離脂代謝，降低低氧環(huán)境下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)增殖的可能。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在24 h缺氧密閉的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，添加高濃度FFA液，AMPK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯的活性被抑制，而抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）能促進(jìn)FFA被攝取利用，降低FFA在培養(yǎng)液中的濃度，而APS能降低CHF死亡風(fēng)險(xiǎn)，已被廣泛證實(shí)，CHF患者晚期不僅存在高FFA上限水平，而且也存在FFA融合利用障礙。CHF的血液循環(huán)多瘀，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)FFA蓄積、ATP減少。

楊冬花等[24]研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)益氣活血方能通過(guò)抑制β3-腎上腺素受體（β3-adrenoceptor agonists，β3-AR）的表達(dá)減少I型前膠原羧基端原肽（type I procollagen carboxyl terminal propeptide，PICP）和III型前膠原氨基端肽（procollagen IIIN-termi，PIIINP）含量，逆轉(zhuǎn)心室重塑，從而改善心臟功能。李春陵等[25]探討溫陽(yáng)益氣活血方通過(guò)抑制GATA結(jié)合蛋白4（GATA binding protein4，GATA4）的表達(dá)減少I型膠原含量，降低I型/III型膠原值，逆轉(zhuǎn)心室重塑，改善心臟功能。綜上所述，溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)CHF心室重塑是通過(guò)調(diào)控β3-AR、血清I型、III型膠原含量來(lái)控制LVEF、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LEVDD）等主要效果指標(biāo)，并且觀察組與對(duì)照組治療前后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組總有效率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；治療后，觀察組的LVEF指標(biāo)顯著高于對(duì)照組，觀察組的LVESD、LVEDD均低于對(duì)照組（P＜0.05）。張聰聰?shù)萚26]探討溫陽(yáng)益氣活血方通過(guò)化痰作用將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/ Smads信號(hào)通路與肺動(dòng)脈壓力相聯(lián)系并且起到調(diào)控的作用。

脂肪酶移位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT）/ CD36T和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyl transterase-1，CPT-1）是2個(gè)參與FFA轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶[27]，與心肌、骨骼肌產(chǎn)能也密切相關(guān)。CD36是多種組織細(xì)胞膜上的糖蛋白，也是心臟FAT的主要形式。另外，分布于胞漿中的是FAT/CD36，CPT-1主要在線粒體膜上分布，其表達(dá)增加可促使FFA的跨膜運(yùn)輸，進(jìn)而線粒體氧化ATP增加，而CD36類似一種跨膜運(yùn)輸反應(yīng)的媒介催化劑，可加速FFA的攝取。但研究發(fā)現(xiàn)CHF時(shí)，上述2種關(guān)鍵酶均減少或者活性被抑制而降低，最終致使FFA的攝取和利用率障礙[28]。

可見(jiàn)APS在充分能抑制AMPK通路活性的情況下，F(xiàn)AT/CD36T和CPT-1的膜轉(zhuǎn)位表達(dá)，也受抑制，因此AMPK與2個(gè)關(guān)鍵酶存在共線關(guān)系，彼此間的活化或抑制是一種充分必要條件。因此改善APS成為CHF一種有前景的治療手段，APS催化CD36跨膜反應(yīng)使心肌加大對(duì)FFA的攝取，從而心肌代謝底物的結(jié)構(gòu)被改造，可能是“胚胎化”代謝底物的一種同分異構(gòu)體，最終底物逆向化狀態(tài)被打破，進(jìn)而改善CHF相關(guān)癥狀。

而研究者通過(guò)提取具有益氣活血功效的中藥化學(xué)成分作用AMPK信號(hào)通路時(shí)[29]，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞對(duì)FFA的利用率提高，心肌細(xì)胞的ATP代謝從最初的糖酵解和乳酸氧化反應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐灾舅嵫趸x為主導(dǎo)。這就是“逆向化狀態(tài)被打破”，同時(shí)其對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的大量增殖有逆轉(zhuǎn)作用，使肺動(dòng)脈壓力降低，延緩肺血管重構(gòu)。細(xì)胞增殖的中斷對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓有扭轉(zhuǎn)作用，甚至使病理機(jī)制改變，減輕肺血管阻力[20]。

又有研究者證實(shí)，紅景天聯(lián)合溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)低氧環(huán)境下心衰大鼠模型的肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖有保護(hù)作用，溫陽(yáng)益氣活血方類似于AMPK信號(hào)通路活化劑[30]。結(jié)果表明，紅景天單方、溫陽(yáng)益氣活血方、加味紅景天方皆可通過(guò)AMPK通路逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和胰島素抵抗，減少胰島細(xì)胞的損傷凋亡，加速心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用[31]。最終證實(shí)紅景天單方、溫陽(yáng)益氣活血方、加味紅景天方對(duì)CHF有治療作用。

miRNA是單鏈的非編碼小RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將mRNA的3’或5’UTR區(qū)與特定靶基相結(jié)合，可直接降解mRNA或抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，因此miRNA與疾病的發(fā)生、發(fā)展是密切相關(guān)的[32-33]。是多種生物過(guò)程的重要調(diào)控因子，如細(xì)胞重編程、增殖、凋亡、遷移等過(guò)程，miRNA在心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中參與重要調(diào)節(jié)功能。筆者通過(guò)自制Affymetrix mRNA芯片進(jìn)行差異性分析，關(guān)鍵miRNA的篩選，并將LncRNA最具功能性的基因?qū)仃?yáng)益氣活血方治療CHF的mRNA核心基因進(jìn)行調(diào)控。芯片篩選出的miR-140-5p表達(dá)隨脂多糖濃度的增高而降低[34]，脂多糖介導(dǎo)的KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1（KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1）參與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)控，KCNQ1OT1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA抑制蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶IVA型成員3（proteintyrosine phosphatase type IVA,member 3，PTP4A3）所介導(dǎo)的MAPK、PI3K/Akt信號(hào)通路[35]，這與芯片所富集出的通路相一致，miR-140-5p可作為CHF早期干預(yù)治療的效應(yīng)標(biāo)志物；miR-27a-3p抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，進(jìn)而抑制主動(dòng)脈中膜彈力纖維和膠原纖維的生成，影響血管重構(gòu)，對(duì)CHF具有保護(hù)作用[36]；miR-129-5p可通過(guò)Wnt5a信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管平滑肌[37]，而Wnt5a信號(hào)通路在自制芯片中參與差異改變，miR-129-5p可介導(dǎo)Wnt5a通路調(diào)節(jié)血清骨橋蛋白對(duì)炎癥的反應(yīng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞IL-17大量聚集[38]，減少脂蛋白受體攝取脂質(zhì)，這也證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)富集的IL-17通路是重要通路。CHF的心功能惡化癥狀與心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，進(jìn)而減少炎癥反應(yīng)發(fā)生。

綜上所述，可通過(guò)多層次、多通路、多靶點(diǎn)導(dǎo)致CHF的發(fā)生、發(fā)展，因此對(duì)于CHF的治療需要通過(guò)中藥組合的協(xié)同靶向作用，即多成分-多途徑-多靶點(diǎn)的發(fā)揮聯(lián)合治療作用。大數(shù)據(jù)的挖掘可節(jié)約科研成本，課題組將對(duì)關(guān)鍵基因、通路進(jìn)行RT-PCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。現(xiàn)從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論出發(fā)將溫陽(yáng)益氣活血方的藥物作用趨向與CHF靶標(biāo)加以聯(lián)系分析，同時(shí)經(jīng)CHF患者外周血基因芯片驗(yàn)證，以期能進(jìn)一步挖掘?qū)HF治療的潛在干預(yù)靶標(biāo)與作用機(jī)制[39]，為中醫(yī)藥治療疑難疾病的臨床研究和新藥研制開(kāi)發(fā)提供堅(jiān)實(shí)理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突