楊晶晶，沈宗姮，何沛原，劉玉萍*

1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610000

2.四川省人民醫(yī)院 健康管理中心，四川 成都 610000

糖尿病腎病是糖尿病常見并發(fā)癥之一，屬于慢性微血管病變，可導致終末期腎病。研究表明，足細胞數量減少可影響腎小球濾過屏障結構，進而影響腎功能；足細胞凋亡與氧化應激、炎性反應密切相關，減輕足細胞損傷可保護腎功能[1]。許多中藥提取物及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用，可減輕高糖誘導的足細胞損傷[2-4]。小檗堿具有抗炎、抗氧化等作用，可抑制神經退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展，并可通過作用于轉化生長因子-β1（thansforming growth factor-β1，TGF-β1）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）途徑減輕高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷[5]。miR-1290在糖尿病患者中表達升高，可能參與糖尿病的發(fā)生[6]。本研究采用高糖誘導足細胞建立細胞損傷模型，探討小檗堿對高糖誘導的足細胞凋亡、炎性反應的影響，并探究及其對miR-1290的調控作用。

1 材料

1.1 細胞

小鼠腎足細胞MPC5購自上海通派生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

小檗堿（質量分數≥96%，批號HR1502）購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（批號12100046）、胎牛血清（批號10099）購自美國Gibco公司；Trizol試劑（批號15596018）購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑（批號4368813）、qRT-PCR試劑（批號11736051）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectamine 2000（批號20181213）、細胞凋亡試劑盒（批號20181116）購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號20181003）購自上海臻科生物科技有限公司；IL-1β ELISA試劑盒（批號20181006）購自上海瑞番生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號20180906）購自南京森貝伽生物科技有限公司；陰性對照（miR-NC）、miR-1290模擬物（miR-1290 mimics）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；兔抗鼠B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號sc-7382）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體（批號sc-7480）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號20181017）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 儀器

FACS Calibur流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；StepOnePlus qRT-PCR儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

MPC5細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%進行傳代培養(yǎng)。

2.2 小檗堿對MPC5細胞存活率的影響

取處于對數生長期的MPC5細胞，以2.5×105/mL接種于96孔板，培養(yǎng)12 h。設置對照組和小檗堿（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L）組，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。加入100 μL MTT溶液孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩至結晶完全溶解，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（A），計算細胞存活率。

細胞存活率＝A給藥/A對照

2.3 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響

取處于對數生長期的MPC5細胞，以2.5×105/mL接種于6孔板，培養(yǎng)12 h。設置對照組、模型組和小檗堿（1.0、2.5、5.0 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，各給藥組再加入相應藥物，對照組加入含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h[7-8]。收集細胞，加入預冷的PBS溶液洗滌，棄上清，加入500 μL Binding Buffer，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），充分混勻，室溫避光孵育10 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.4 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞凋亡相關蛋白表達的影響

按“2.3”項下方法分組并處理細胞，收集細胞，加入RIPA裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，加入上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，室溫封閉2 h，分別加入Bcl-2、Bax和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶2000），室溫孵育1 h，以TBST溶液洗滌，加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.5 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響

按“2.3”項下方法分組并處理細胞，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.6 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞miR-1290 mRNA表達的影響

按“2.3”項下方法分組并處理細胞，收集細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。將U6作為內參，引物序列：miR-1290上游引物5’-TGGATTTTTGGATCAG- GGA-3’，下游引物5’-CGCGTGGATTTTTGGATC- AGGGA-3’；U6上游引物5’-ATTGGAACGATAC- AGAGAAGATT-3’，下游引物5’-GGAACGCTTCA- CGAATTTG-3’。

2.7 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響

取處于對數生長期的MPC5細胞，以2.5×105/mL接種于6孔板。設置小檗堿（5 μmol/L）＋miR-NC組、小檗堿（5 μmol/L）＋miR-1290 mimics組，待細胞分化成熟后，分別將miR-NC和miR-1290 mimics轉染至細胞內，轉染6 h后將培養(yǎng)基更換為含5 μmol/L小檗堿、30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細胞，按“2.3”項下方法檢測細胞凋亡情況。

2.8 miR-1290對小檗堿調控高糖誘導的MPC5細胞凋亡相關蛋白表達的影響

按“2.7”項下方法分組并處理細胞，按“2.4”項下方法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達情況。

2.9 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響

按“2.7”項下方法分組并處理細胞，按“2.5”項下方法檢測上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.10 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 21.0軟件分析數據，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 小檗堿對MPC5細胞存活率的影響

如表1所示，與對照組比較，小檗堿（10.0、20.0 μmol/L）組細胞存活率顯著降低（P＜0.05），因此選擇1.0、2.5、5.0 μmol/L小檗堿進行后續(xù)實驗。

表1 小檗堿對MPC5細胞存活率的影響 ( ±s,n = 9)Table 1 Effect of berberine on survival rate of MPC5 cells ( ±s,n = 9)

表1 小檗堿對MPC5細胞存活率的影響 ( ±s,n = 9)Table 1 Effect of berberine on survival rate of MPC5 cells ( ±s,n = 9)

與對照組比較：*P＜0.05*P < 0.05 vs control group

組別 劑量/(μmol·L-1) 存活率/% 對照 — 100.00±4.09 小檗堿 1.0 98.76±4.82 2.5 99.75±5.14 5.0 94.63±5.47 10.0 86.28±2.54* 20.0 74.47±2.64*

3.2 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響

如圖1和表2所示，與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿（2.5、5.0 μmol/L）組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

3.3 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿（2.5、5.0 μmol/L）組上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。

圖1 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of berberine on apoptosis in MPC5 cells induced by high glucose

表2 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響 ( ±s,n = 3)Table 2 Effect of berberine on apoptosis in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表2 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響 ( ±s,n = 3)Table 2 Effect of berberine on apoptosis in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05，表3、4同*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group,same as tables 3,4

組別 劑量/(μmol·L-1) 凋亡率/% Bcl-2蛋白相對表達量 Bax蛋白相對表達量 對照 — 3.61±0.54 0.77±0.04 0.22±0.02 模型 — 25.17±2.10* 0.28±0.02* 0.69±0.03* 小檗堿 1.0 22.94±1.88 0.33±0.03 0.61±0.03 2.5 14.25±1.22# 0.52±0.04# 0.47±0.02# 5.0 7.14±0.69# 0.61±0.03# 0.35±0.02#

表3 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of berberine on IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表3 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of berberine on IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

組別 劑量/(μmol·L-1) IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1) 對照 — 72.63±2.81 61.49±2.46 56.13±2.98 模型 — 227.34±8.77* 217.14±9.76* 265.74±12.62* 小檗堿 1.0 201.38±6.26 195.41±6.19 228.39±12.47 2.5 141.45±5.91# 136.43±2.03# 146.78±5.89# 5.0 104.28±3.49# 91.21±3.26# 85.34±3.32#

3.4 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞miR-1290 mRNA表達的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組細胞miR-1290mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿（2.5、5.0 μmol/L）組細胞miR-1290mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。

3.5 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響

如圖2和表5所示，與小檗堿＋miR-NC組比較，小檗堿＋miR-1290 mimics組細胞miR-1290mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。

表4 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞miR-1290 mRNA表達的影響 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of berberine on miR-1290 mRNA expression in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表4 小檗堿對高糖誘導的MPC5細胞miR-1290 mRNA表達的影響 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of berberine on miR-1290 mRNA expression in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

組別 劑量/(μmol·L-1) miR-1290 mRNA相對表達量 對照 — 1.01±0.06 模型 — 3.09±0.21* 小檗堿 1.0 2.83±0.15 2.5 2.13±0.12# 5.0 1.55±0.07#

3.6 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響

圖2 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting apoptosis of MPC5 cells induced by high glucose

表5 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting apoptosis of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表5 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞凋亡的影響 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting apoptosis of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

與小檗堿＋miR-NC組比較：*P＜0.05，下表同*P < 0.05 vs berberine + miR-NC group,same as below table

組別 miR-1290 mRNA相對表達量 凋亡率/% Bcl-2蛋白相對表達量 Bax蛋白相對表達量 小檗堿＋miR-NC 1.01±0.06 6.41±0.49 0.61±0.04 0.33±0.01 小檗堿＋miR-1290 mimics 2.45±0.09* 17.69±0.96* 0.38±0.03* 0.57±0.03*

表6 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響 ( ±s,n = 3)Table 6 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表6 miR-1290對小檗堿抑制高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響 ( ±s,n = 3)Table 6 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

組別 IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1) 小檗堿＋miR-NC 109.44±3.43 86.65±3.82 92.72±2.86 小檗堿＋miR-1290 mimics 188.86±8.70* 169.67±6.26* 197.25±8.45*

如表6所示，與小檗堿＋miR-NC組比較，小 檗堿＋miR-1290 mimics組細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

足細胞損傷在糖尿病腎病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過監(jiān)測足細胞數量與形態(tài)的變化可預測糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展。目前尚缺乏有效防治足細胞損傷的手段，研究發(fā)現，中藥的活性成分具有減輕足細胞損傷的作用[9]。紅景天苷能夠通過上調血紅素加氧酶-1的表達從而抑制高糖誘導的足細胞凋亡及氧化應激[10]；藏紅花素能夠通過抑制核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，從而抑制高糖誘導的足細胞氧化應激及炎性反應[11]；小檗堿可減輕6-羥基多巴胺誘導的神經細胞損傷[12]；小檗堿可通過抑制炎性反應，有效改善腎臟缺血再灌注大鼠的腎功能[13]；小檗堿可抑制脂多糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞自噬，從而減輕細胞損傷[14]。本研究結果顯示，經高糖誘導的MPC5細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，與文獻報道一致[15]，提示足細胞損傷模型制備成功；小檗堿顯著降低高糖誘導的MPC5細胞凋亡率，上調Bcl-2蛋白表達水平，下調Bax蛋白表達水平，提示小檗堿可抑制高糖誘導的足細胞凋亡；經高糖誘導的MPC5細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，與文獻報道一致[16]；小檗堿顯著降低上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，提示小檗堿可抑制高糖誘導的足細胞炎性反應。

本研究發(fā)現，高糖誘導的MPC5細胞miR-1290mRNA表達水平升高，小檗堿可顯著降低miR-1290mRNA表達水平，提示小檗堿可能通過下調miR-1290表達從而減輕足細胞損傷。研究表明，miR-1290在糖尿病腎病患者中的表達升高，可能作為糖尿病腎病臨床診斷的潛在生物學標記物[17]。為進一步探究小檗堿對高糖誘導的足細胞損傷的作用機制，采用過表達miR-1290聯合小檗堿作用于高糖誘導的MPC5細胞，結果顯示，MPC5細胞凋亡率升高，上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，提示過表達miR-1290可明顯逆轉小檗堿對高糖誘導的足細胞凋亡及炎性反應的作用。

綜上所述，小檗堿能夠通過下調miR-1290表達，從而抑制高糖誘導的足細胞凋亡及炎性反應。miR-1290可作為小檗堿治療糖尿病腎病的潛在靶點，但其具體作用機制尚需進一步探究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突