劉 煒，羅會(huì)盛，鄒愷平，王 娜，劉 順，施 敏

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種與絕經(jīng)有關(guān)的全身代謝性骨病，以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞繼而骨脆性增高和易發(fā)生骨折為特征[1-2]。我國(guó)是PMOP高發(fā)地區(qū)，女性絕經(jīng)后10年內(nèi)骨流失速度較快，60歲以上患有PMOP的女性中，30%～50%將經(jīng)歷PMOP相關(guān)骨折，且這種趨勢(shì)逐年增高[3]。目前臨床上常用雌激素類、促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收等藥物治療PMOP相關(guān)骨折[4]。中醫(yī)理論認(rèn)為腎生骨髓[5]。健骨丸為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，其處方基本組成為鹿角、熟地黃、狗脊、黃柏、阿膠、三七、茯苓和六神曲，具有補(bǔ)腎健脾、填精益髓、活絡(luò)定痛的功效，臨床已使用近20年，其療效確切，常用于治療絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥、男性骨質(zhì)疏松癥等原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。本研究通過(guò)建立大鼠絕經(jīng)模型，研究健骨丸對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)及骨折愈合的影響[6-7]，以期探討健骨丸對(duì)PMOP所致骨折的治療作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雌性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量200～220 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK 2017-0069。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)室，12 h晝夜交替，溫度（21±2）℃，濕度（50±10）%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020DW-34-01）。

1.2 藥品與試劑

健骨丸（質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)JSZBZ20090801Z，批號(hào)1912010）由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供，主要含鹽酸小檗堿和三七皂苷；仙靈骨葆膠囊（批號(hào)191022103）購(gòu)自貴州同濟(jì)堂制藥有限公司；鈣測(cè)定試劑盒（批號(hào)20190111）、血清無(wú)機(jī)磷測(cè)定試劑盒（批號(hào)20190111）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20190106）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；人血清雌二醇（estradiol，E2）放免試劑盒、血清骨鈣素（bone gla protein，BGP）放免試劑盒和降鈣素（calcitonin，CT）放免試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所；其他試劑均為市售分析純。

1.3 儀器

Power wave x340酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Discover W型雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x（美國(guó)Hologic公司）；Eclipse E100型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；5424R型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、仙靈骨葆膠囊（300 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組和健骨丸低、中、高劑量（150、300、450 mg/kg，分別相當(dāng)于臨床最大劑量的0.5、1.0、1.5倍）組，各組再分為給藥15 d以及30 d 2組。除對(duì)照組外，其余各組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，3個(gè)月后右后腿脛骨機(jī)械性骨折，建立去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折模型[7]。骨折手術(shù)當(dāng)天，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)15、30 d。

2.2 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清中E2、CT、BGP、血鈣、血磷水平和AKP活性的影響

分別于給藥15、30 d，大鼠乙醚麻醉后頸總動(dòng)脈采血致死，全血于室溫放置，分層后4000 r/min離心10 min，取上層血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中E2、CT、BGP、血鈣、血磷水平和AKP活性。

2.3 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠脛骨影像學(xué)及骨密度的影響

分別于給藥15、30 d，采用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x對(duì)各組大鼠右脛骨進(jìn)行X-射線掃描，并測(cè)定骨密度。

2.4 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨折處病理變化的影響

取給藥30 d大鼠骨折處及其周圍組織，于10%福爾馬林中固定，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下拍照并觀察骨折周圍修復(fù)情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組間差異使用One way ANOVA法進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清中E2、CT、BGP、血鈣、血磷水平和AKP活性的影響

E2是由卵巢內(nèi)的卵泡細(xì)胞分泌的一種甾體雌激素，雌激素降低是導(dǎo)致PMOP最主要的原因[8-9]。如圖1-A所示，與模型組比較，給藥15 d，健骨丸高劑量組血清E2水平顯著升高（P＜0.01）；給藥30 d，健骨丸各劑量組血清E2水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

CT是一種鈣調(diào)節(jié)激素，能夠通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的增殖并降低破骨細(xì)胞的活性，從而降低骨吸收和骨丟失[10]。如圖1-B所示，與模型組比較，給藥15 d，各給藥組血清CT水平均顯著升高（P＜0.05）；給藥30 d，健骨丸各劑量組血清CT水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

BGP主要由成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞等骨形成性細(xì)胞產(chǎn)生，血中BGP水平可特異性反映成骨細(xì)胞的活性[11]。如圖1-C所示，與模型組比較，給藥15 d，仙靈骨葆膠囊組血清BGP水平顯著升高（P＜0.05）；給藥30 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸低劑量組血清BGP水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

AKP是骨細(xì)胞功能分化的指標(biāo)，其活性可作為成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志。臨床常用AKP活性評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞分泌功能[12]。如圖1-D所示，與模型組比較，給藥15 d，健骨丸低、高劑量組血清AKP活性顯著升高（P＜0.05、0.01）；給藥30 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸低劑量組血清AKP活性顯著升高（P＜0.05、0.001）。

圖1 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清中E2 (A)、CT (B)、BGP (C) 水平、AKP (D) 活性、血鈣 (E) 和血磷 (F) 水平的影響 ( ±s,n = 6)Fig.1 Effect of Jiangu Pill on E2 (A),CT (B),BGP (C) levels,AKP (D) activity,blood calcium (E) and blood phosphorus (F) levels in serum of ovariectomized osteoporotic fracture rats ( ±s,n = 6)

在骨折愈合過(guò)程中，局部環(huán)境的微量元素代謝活躍，其中鈣和磷的沉積是一個(gè)關(guān)鍵步驟，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[13]。如圖1-E、F所示，與模型組比較，給藥15 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸各劑量組血鈣水平均顯著升高（P＜0.05、0.001），健骨丸低、中劑量組血磷水平均顯著升高（P＜0.01、0.001）；給藥30 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸低、中劑量組血鈣水平均顯著升高（P＜0.05），各給藥組血磷水平均顯著升高（P＜0.05）。

3.2 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠脛骨影像學(xué)及骨密度的影響

骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過(guò)程通常包括纖維、軟骨及骨性骨痂的形成。骨痂的形成對(duì)骨折愈合至關(guān)重要，反映了骨組織再生修復(fù)的自然規(guī)律，也是臨床判斷骨折愈合程度的重要依據(jù)[14-15]。如圖2所示，給藥15 d，各給藥組斷面有骨痂生成；給藥30 d后，各給藥組斷面有大量骨痂形成，其中健骨丸中、高劑量組生成骨痂量多于模型組。健骨丸各劑量組骨折愈合情況較模型組有明顯改善。

圖2 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠脛骨影像學(xué)的影響Fig.2 Effect of Jiangu Pill on tibia imaging in ovariectomized osteoporotic fracture rats

骨密度即骨骼礦物質(zhì)密度，反映骨骼強(qiáng)度，也是診斷骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)疏松性骨折以及骨折愈合程度的重要指標(biāo)[16-17]。如圖3所示，給藥15、30 d，與模型組比較，各給藥組骨密度均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

3.3 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨折處病理變化的影響

如圖4所示，與模型組相比，健骨丸各劑量組斷端骨痂中骨性骨痂的成分增多，骨小梁的粗細(xì)及骨髓腔的大小與對(duì)照組相似。

圖3 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨密度的影響 ( ±s,n = 6)Fig.3 Effect of Jiangu Pill on bone density in ovariectomized osteoporotic fracture rats ( ±s,n = 6)

圖4 健骨丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨折處病理變化的影響 (HE,×40)Fig.4 Effect of Jiangu Pill on pathological changes of fractures in ovariectomized osteoporotic fracture rats (HE,× 40)

4 討論

在中醫(yī)理論中，女性絕經(jīng)主要是因腎氣漸衰、沖任不足、天癸將竭、精氣虧虛、陰陽(yáng)失衡所致。中醫(yī)理論認(rèn)為腎與骨有著極其密切的聯(lián)系，《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》曰：“腎生骨髓”，即腎中精氣充足，骨髓得以滋養(yǎng)，骨則強(qiáng)壯[18-19]。

健骨丸為江蘇省中醫(yī)院臨床驗(yàn)方制成的院內(nèi)制劑，其處方基本組成為鹿角、熟地黃、狗脊、黃柏、阿膠、三七、茯苓和六神曲。方中鹿角、狗脊共為君藥，鹿角性溫，歸肝、腎經(jīng)，有溫腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨之效；狗脊性甘、寒，歸肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰脊之功效；熟地黃、阿膠共為臣藥，熟地黃性微溫，歸肝、腎經(jīng)，有填精益髓之效，為補(bǔ)腎陰之要藥；阿膠性平，歸肺、肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)血、滋陰、止血之功效；佐以黃柏苦寒堅(jiān)腎，三七散瘀止痛，茯苓、六神曲健脾寧心，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎健脾、填精益髓、活絡(luò)定痛之功，在臨床上對(duì)絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥有確切療效。

本研究以仙靈骨葆膠囊為陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過(guò)建立去勢(shì)大鼠模型，探討健骨丸對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響。結(jié)果顯示，健骨丸能夠增加去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型大鼠血清E2水平。雌激素降低是導(dǎo)致PMOP的重要原因之一，E2是活性最強(qiáng)的雌激素，E2水平的降低會(huì)抑制成骨細(xì)胞活性并增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致骨密度降低，骨量丟失增多。健骨丸通過(guò)升高E2水平，增加骨密度，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制骨吸收，保護(hù)骨組織，防止骨丟失。在骨折愈合過(guò)程中檢測(cè)AKP具有重要意義，AKP的含量變化可反映骨折區(qū)細(xì)胞增殖的程度以及骨折愈合演進(jìn)的狀況。血中40%～50% AKP來(lái)源于骨，AKP的活性可反映骨細(xì)胞尤其是新形成的成骨細(xì)胞的活性及狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，健骨丸可提高血中AKP活性，提示健骨丸可以提高成骨細(xì)胞活躍度，促進(jìn)骨形成增加。血中CT、BGP水平也是反映成骨細(xì)胞活性的特異性指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，健骨丸可以提高血清CT、BGP水平，促進(jìn)骨形成；此外，健骨丸能夠增加血鈣、血磷水平，促進(jìn)骨基質(zhì)的鈣化，形成骨質(zhì)[6,20-22]。

結(jié)合X-射線掃描、骨密度及病理組織學(xué)結(jié)果可知，健骨丸可以通過(guò)提高骨折端骨密度來(lái)增加骨骼強(qiáng)度，從而促進(jìn)骨折愈合；同時(shí)，骨折斷端已由增生的纖維結(jié)締組織、軟骨、松質(zhì)骨形成的骨痂連接。與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨痂內(nèi)松質(zhì)骨骨髓腔較大，表現(xiàn)為明顯的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象；各給藥組骨髓腔形態(tài)基本正常，由去勢(shì)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥狀明顯緩解；健骨丸各劑量組骨小梁表面可見(jiàn)活躍增生的成骨細(xì)胞，小梁之間已有骨髓腔形成，部分增生的結(jié)締組織內(nèi)尚可見(jiàn)豐富的毛細(xì)血管，骨痂內(nèi)軟骨數(shù)量不等。健骨丸可使機(jī)械損傷的骨折斷端骨痂明顯增多，成骨細(xì)胞增生活躍，骨折愈合良好[8,23]。健骨丸各劑量組未體現(xiàn)明顯的劑量相關(guān)性，這可能是受多組分的藥物代謝影響。本研究結(jié)果提示，健骨丸對(duì)于其他適應(yīng)癥的臨床指導(dǎo)用量（成人10～15 g/d）也可作為修復(fù)絕經(jīng)引起的骨質(zhì)疏松性骨折的臨床使用劑量。

本研究通過(guò)測(cè)定去勢(shì)大鼠血清中E2、CT、BGP、AKP、血鈣、血磷等生化指標(biāo)，結(jié)合X-射線掃描、骨密度檢測(cè)以及病理組織學(xué)方法，表明健骨丸具有促進(jìn)絕經(jīng)引起的骨質(zhì)疏松性骨折的骨形成以及骨折愈合的功效。課題組后續(xù)將深入探究其可能的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突