劉 瑤，李 偉

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250014

高血壓和腎臟病密切相關(guān)，互為病因和加重因素[1]。長(zhǎng)期持續(xù)的原發(fā)性高血壓，可引發(fā)腎小動(dòng)脈肌內(nèi)膜肥厚、管腔狹窄、細(xì)小動(dòng)脈玻璃樣變，繼發(fā)腎實(shí)質(zhì)缺血性損害，進(jìn)一步加劇血壓升高，二者形成惡性循環(huán)。高血壓腎損害是終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和主要病因。因此，探討高血壓腎損害的新型防治策略，有助于降低ESRD及其并發(fā)癥的發(fā)生率。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類進(jìn)化上非常保守、長(zhǎng)度介于21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)其種子序列（5’端的2～8位核苷酸序列）與靶mRNA 3’非翻譯端互補(bǔ)靶序列匹配，介導(dǎo)mRNA的降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅可以通過(guò)影響多種細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移和死亡等生物學(xué)過(guò)程，從而在高血壓發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-3]，也可作為糖尿病腎病、免疫性腎臟疾病、腎細(xì)胞癌等多種腎臟疾病的潛在治療靶點(diǎn)[4-6]。

山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院李偉教授結(jié)合自身多年臨床經(jīng)驗(yàn)，主張氣虛血瘀貫穿高血壓腎損害始終，臨床采用補(bǔ)氣活血法治療，可減少患者尿微量白蛋白的排泄，保護(hù)腎功能。黃芪-丹參作為補(bǔ)氣活血的典型代表藥對(duì)，在調(diào)控血壓、舒張血管、抗凝、抗氧化、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)等方面具有多重功效[7]。本課題組前期研究表明，黃芪-丹參藥對(duì)能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓及雙腎血流阻力指數(shù)（resistance index，RI），提高腎組織一氧化氮（nitric oxide，NO）水平及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，延緩高血壓腎損害的發(fā)展進(jìn)程[8-9]。本研究旨在通過(guò)miRNA測(cè)序技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度探索黃芪-丹參藥對(duì)在自發(fā)性高血壓大鼠腎組織中的直接作用靶點(diǎn)，探討其改善高血壓腎損害的作用機(jī)制，為中藥防治高血壓腎損害提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

24周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠18只，同周齡WKY大鼠9只，體質(zhì)量280～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物于溫度22～24 ℃、濕度50%～70%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)SDUTCM20210305023）。

1.2 藥品與試劑

2 g黃芪中藥配方顆粒（批號(hào)18013991）相當(dāng)于飲片5 g，1 g丹參中藥配方顆粒（批號(hào)18005862）相當(dāng)于飲片10 g，均由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供；QIAseq miRNA Library Kit、miRNeasy Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；MiPure Cell/Tissue miRNA Kit（批號(hào)7E242G8）購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（批號(hào)638313）、TB GreenTMEx TaqTMⅡ Kit（批號(hào)RR820A）購(gòu)自Takara生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

MRBP-RMC大鼠多通道無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)（美國(guó)IITC公司）；Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；Qubit?3.0 Fluorometer（美國(guó)Life Technologies公司）；Nanodrop One分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 2100生物分析儀（美國(guó)Agilent公司）；Hiseq Xten測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）；Light Cycler480 II qRT-PCR儀（德國(guó)Roche公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

取WKY大鼠9只作為對(duì)照組，將自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組和黃芪-丹參藥對(duì)（3.4 g/kg）組，每組9只。根據(jù)本課題組前期研究[10]，黃芪、丹參飲片用量分別為5.09、2.55 g/kg，分別將黃芪、丹參配方顆粒用量定為2.036、0.255 g/kg，藥物以0.9%氯化鈉溶液溶解。各給藥組ig藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)4周。

2.2 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響

每周采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量血壓，記錄每只大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈的收縮壓與舒張壓，連續(xù)測(cè)量3次。

2.3 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎組織病理變化的影響

給藥結(jié)束后，大鼠ip 3%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）過(guò)量麻醉處死，取腎組織，于中性多聚甲醛中固定48 h，切片（厚4 μm）后石蠟包埋，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，以中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 各組大鼠腎組織差異表達(dá)miRNA分析

2.4.1 腎組織RNA的抽提與純化 隨機(jī)選取各組大鼠各3只，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腎組織RNA，用生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，采用Qubit?3.0 Fluorometer和Nanodrop One分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。

2.4.2 文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序 使用QIAseq miRNA Library Kit構(gòu)建雙端測(cè)序文庫(kù)。純化產(chǎn)物合成cDNA文庫(kù)，繼而進(jìn)行定量檢測(cè)，以確認(rèn)插入片段的大小。通過(guò)cBot生成簇，將文庫(kù)稀釋至10 pmol/L，在Illumina Hiseq Xten測(cè)序平臺(tái)上測(cè)序。

2.4.3 基因表達(dá)的數(shù)據(jù)分析 將每個(gè)具有miRNA序列的樣品讀長(zhǎng)與已有miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)和新miRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算miRNA表達(dá)水平，并通過(guò)CPM篩選miRNA。使用DESeq軟件分析樣品miRNA表達(dá)并篩選出P＜0.05、倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）＞1.5或＜0.67的差異表達(dá)miRNA。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA

選擇5個(gè)差異表達(dá)miRNA（miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-125b-1-3p）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用MiPure Cell/Tissue miRNA Kit提取各組大鼠腎組織miRNA，用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄純化的miRNA，合成cDNA。根據(jù)TB GreenTMEx TaqTMⅡ Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR分析。以U6為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 差異表達(dá)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)、差異表達(dá)miRNA與靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用miRanda算法從miRNA-mRNA序列匹配情況及能量穩(wěn)定性方面綜合預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA靶基因。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建差異表達(dá)miRNA與相應(yīng)靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較。

3 結(jié)果

3.1 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠收縮壓和舒張壓顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥后第2周，黃芪-丹參藥對(duì)組大鼠收縮壓顯著降低（P＜0.05），給藥后第3、4周，收縮壓和舒張壓均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

3.2 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎組織病理變化的影響

如圖1所示，對(duì)照組可見(jiàn)腎小球體積正常，系膜區(qū)未見(jiàn)明顯增生，系膜基質(zhì)正常，未見(jiàn)腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常；模型組可見(jiàn)腎小球體積輕度增大，分葉明顯，系膜區(qū)增生，系膜基質(zhì)增多，伴明顯的中性粒細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度腎小管萎縮；黃芪-丹參藥對(duì)組可見(jiàn)腎小球體積輕度增大，分葉不明顯，系膜區(qū)輕度增生，伴輕度中性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

表2 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響 ( ±s,n = 9)Table 2 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on blood pressure of spontaneously hypertensive rats ( ±s,n = 9)

表2 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響 ( ±s,n = 9)Table 2 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on blood pressure of spontaneously hypertensive rats ( ±s,n = 9)

與同組給藥前比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與對(duì)照組同時(shí)間比較：##P＜0.01；與模型組同時(shí)間比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 (1 mm Hg＝133 Pa)*P < 0.05 **P < 0.01 vs same group before administration; ##P < 0.01 vs control group at the same time; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group at the same time (1 mm Hg = 133 Pa)

組別 劑量/(g·kg-1) 血壓類型 血壓/mm Hg 給藥前 給藥后第1周 給藥后第2周 給藥后第3周 給藥后第4周 對(duì)照 — 收縮壓 132.89±11.42 132.17±10.76 131.25±10.12 130.69±9.96 129.45±8.76 舒張壓 109.41±10.17 106.78±11.32 104.65±9.93 102.89±9.57 100.18±10.08 模型 — 收縮壓 198.76±5.72## 196.89±5.98## 194.37±4.97## 192.63±4.68## 191.75±5.05## 舒張壓 171.38±6.64## 169.12±5.43## 166.54±6.12## 164.19±5.36## 163.07±4.91## 藥對(duì) 3.4 收縮壓 199.24±4.46 190.63±3.98 183.92±4.09*△ 179.12±4.14**△△ 173.42±4.96**△△ 舒張壓 170.57±5.48 165.88±7.12 161.77±6.34 158.48±5.96*△ 150.17±6.99**△△

圖1 黃芪-丹參藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.1 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on kidney pathological changes of spontaneously hypertensive rats (HE,× 100)

3.3 各組大鼠腎組織差異表達(dá)miRNA分析

如圖2、3所示，與對(duì)照組比較，模型組篩選得到115個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中68個(gè)miRNA上調(diào)、47個(gè)miRNA下調(diào)，最具顯著性差異的miRNA為miR-219a-2-3p；與模型組比較，黃芪-丹參藥對(duì)組篩選得到91個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中67個(gè)miRNA上調(diào)、24個(gè)miRNA下調(diào)，最具顯著性差異的miRNA為miR-874-5p。

如表3所示，miR-219a-5p、miR-3585-5p、miR-142-5p在模型組表達(dá)上調(diào)，而在黃芪-丹參藥對(duì)組表達(dá)下調(diào)，推測(cè)這3個(gè)基因的表達(dá)可能與黃芪-丹參藥對(duì)的調(diào)控作用相關(guān)，因此將其作為后續(xù)研究的篩選靶點(diǎn)。

3.4 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

如圖4所示，各組大鼠腎組織miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3pmRNA相對(duì)表達(dá)量與miRNA測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致，提示miRNA測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠，可用于進(jìn)一步的深層次數(shù)據(jù)分析。

3.5 差異表達(dá)miRNA的功能分析

miRNA不編碼蛋白質(zhì)，但可通過(guò)調(diào)控mRNA發(fā)揮作用，因此，本研究通過(guò)對(duì)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)，使用基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析分別對(duì)靶基因進(jìn)行富集，以探討miRNA在細(xì)胞內(nèi)的潛在調(diào)控作用。GO功能分析包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process，BP）3個(gè)部分[11]。

如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組GO功能富集程度最高的分別為陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸前、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。與模型組相比，黃芪-丹參藥對(duì)組GO功能富集程度最高的分別為Ras蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡膜、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。

KEGG分析結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組差異表達(dá)miRNA靶基因主要富集在哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、自噬、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路等途徑。與模型組相比，黃芪-丹參藥對(duì)組差異表達(dá)miRNA靶基因主要富集在MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、自噬、AMPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等途徑。

3.6 差異表達(dá)miRNA與靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

構(gòu)建各組間差異表達(dá)miRNA和其靶基因的局部網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖7，以確定2種類型基因間的功能性相互作用，為進(jìn)一步闡明黃芪-丹參藥對(duì)改善高血壓腎損害的作用機(jī)制提供依據(jù)。

圖2 模型組與對(duì)照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對(duì)組與模型組比較 (B) 腎組織差異表達(dá)miRNA的熱圖Fig.2 Heat map of differential expression miRNA of kidney tissue in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

圖3 模型組與對(duì)照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對(duì)組與模型組比較 (B) 腎組織差異表達(dá)miRNA的火山圖Fig.3 Volcano map of differential expression miRNA of kidney tissue in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

表3 各組大鼠腎組織差異表達(dá)miRNATable 3 Analysis of differentially expressed miRNA in kidney of rats in each group

圖4 模型組與對(duì)照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對(duì)組與模型組比較 (B) 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.4 qRT-PCR verification of differentially expressed miRNA in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

圖5 模型組與對(duì)照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對(duì)組與模型組比較 (B) 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO功能富集分析 (前10)Fig.5 GO function enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B) (top 10)

圖6 模型組與對(duì)照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對(duì)組與模型組比較 (B) 差異表達(dá)miRNA靶基因的KEGG通路富集分析 (前30)Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B) (top 30)

圖7 模型組與對(duì)照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對(duì)組與模型組比較 (B) 差異表達(dá)miRNA與靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of differentially expressed miRNA and target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

4 討論

持續(xù)穩(wěn)定的高血壓可誘發(fā)腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變，直接造成腎臟的組織病理變化，使腎小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄，引發(fā)腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化，進(jìn)而影響腎功能，因此，血壓控制的穩(wěn)定在一定程度上影響患者進(jìn)入ESRD的時(shí)間和速度，早期發(fā)現(xiàn)并診斷對(duì)高血壓腎損害患者的治療和預(yù)后起至關(guān)重要的作用。腎活檢雖是診斷疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但不常作為觀察高血壓腎損害患者病情動(dòng)態(tài)變化的直接方法，尋找非創(chuàng)性生物標(biāo)志物是高血壓腎損害等腎臟疾病的研究目標(biāo)。

miRNA作為關(guān)鍵上游基因，在促進(jìn)或抑制高血壓腎損害的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究miRNA高通量測(cè)序結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組的miRNA表達(dá)譜存在差異，在篩選出的115個(gè)差異表達(dá)miRNA中，68個(gè)表達(dá)上調(diào)、47個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中與對(duì)照組比較，模型組miRNA-142-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-3585-5p表達(dá)在miRNA測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證中均上調(diào)。miRNA-142-5p可通過(guò)靶向調(diào)控信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子相關(guān)蛋白（SLAM-associated protein，SAP）、CD84抑制T細(xì)胞過(guò)度活化，間接影響B(tài)細(xì)胞的抗體生成，其表達(dá)水平與狼瘡性腎炎的活動(dòng)性密切相關(guān)[12]。在氧化低密度脂蛋白的刺激下，高表達(dá)的miRNA-142還可促進(jìn)高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程[13]。miRNA-219-5p被證實(shí)可以靶向結(jié)合E-鈣黏蛋白并下調(diào)其表達(dá)水平，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal trasition，EMT），進(jìn)而影響器官纖維化的發(fā)生[14]。目前尚缺乏關(guān)于miRNA-3585-5p的詳盡報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪-丹參藥對(duì)干預(yù)后，模型組大鼠上述3個(gè)基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)，提示miRNA-142-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-3585-5p可能是黃芪-丹參藥對(duì)延緩高血壓腎損害進(jìn)程的直接靶點(diǎn)。

利用GO的結(jié)構(gòu)功能體系，把參與同樣功能或通路的基因進(jìn)行分類，對(duì)研究高血壓腎損害的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有重要意義。本研究GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，與高血壓腎損害相關(guān)的GO條目集中在陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、L-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長(zhǎng)、缺氧應(yīng)答、囊泡膜、細(xì)胞質(zhì)囊泡膜、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、L-氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、小三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）酶結(jié)合等方面，提示由于高血壓引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的紊亂，使細(xì)胞質(zhì)、囊泡膜等成分變化，影響機(jī)體缺氧應(yīng)答、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及電解質(zhì)平衡，致使機(jī)體能量代謝異常。KEGG通路分析顯示，模型組差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集于mTOR、MAPK、自噬、AMPK及TGF-β信號(hào)通路等。mTOR是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其信號(hào)通路的激活可調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞內(nèi)的自噬水平、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，使腎臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）生成增加，促進(jìn)腎臟纖維化[15]；此外，mTOR通路還參與氨基酸、葡萄糖及脂質(zhì)的代謝。MAPK通路是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在慢性腎衰竭模型大鼠中，MAPK信號(hào)通路被激活，p38 MAPK、胞外信號(hào)調(diào)控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、c-Jun-N-末端激酶（c-Jun-N-terminal kinase，JNK）蛋白的磷酸化水平升高，促進(jìn)腎小管上皮EMT，加重腎纖維化的程度[16]。AMPK通路是細(xì)胞內(nèi)能量的開(kāi)關(guān)，高血壓狀態(tài)下局部腎組織的缺血缺氧可使AMPK通路激活，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的能量、糖、脂及蛋白質(zhì)代謝；AMPK通路可抑制mTOR通路，增強(qiáng)細(xì)胞自噬，參與高血壓腎損害病理進(jìn)程的調(diào)控[10]。TGF-β是公認(rèn)的促腎纖維化細(xì)胞因子，可直接增強(qiáng)腎小管上皮EMT，引起ECM異常堆積，使腎小球基底膜增厚，促進(jìn)腎臟纖維化[17-18]。綜合黃芪-丹參藥對(duì)組差異表達(dá)miRNA靶基因的KEGG通路富集分析結(jié)果，推測(cè)黃芪-丹參藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)節(jié)篩選出的差異表達(dá)miRNA，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，從而發(fā)揮延緩高血壓腎損害進(jìn)程的作用。

近年來(lái)，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和大數(shù)據(jù)時(shí)代的蓬勃發(fā)展以及基因芯片、高通量測(cè)序等生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，與多種疾病發(fā)生、發(fā)展、診治及預(yù)后相關(guān)的特定miRNA日益被發(fā)掘并予以鑒定，從而為闡明疾病的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新思路。本研究通過(guò)分別對(duì)對(duì)照組、模型組及黃芪-丹參藥對(duì)組大鼠腎組織進(jìn)行miRNA測(cè)序，構(gòu)建各組間差異miRNA的表達(dá)譜，并預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶基因；應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析，篩選與黃芪-丹參藥對(duì)干預(yù)高血壓腎損害密切相關(guān)的miRNA靶點(diǎn)及調(diào)控通路，為高血壓腎損害的機(jī)制研究和防治提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突