孫豪杰，王雅琪，胡婷婷，萬 娜，袁 恩，伍振峰，楊 明

江西中醫(yī)藥大學 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效[1]?！吨袊幍洹?020年版收載黃芩和酒黃芩2個品種：生黃芩清熱瀉火，解毒力強，常須炮制后使用；酒黃芩可借酒升騰之力，用于治療上焦肺熱及四肢肌表之濕熱[2]。本課題組前期對黃芩炮制前后的化學成分進行分析，發(fā)現(xiàn)黃芩酒炙后，黃酮苷類成分含量下降，黃酮苷元含量上升，苷類成分與苷元的比例變化趨勢明顯，可作為區(qū)分黃芩炮制前后的化學標志物[3-6]，表明酒炙后黃芩藥材發(fā)生化學成分等內(nèi)在變化，影響藥物的性質(zhì)及作用方向。目前針對黃芩酒炙對內(nèi)源性成分、代謝通路等調(diào)控作用的研究較少，開展關(guān)于黃芩酒炙升提清肺熱的機制研究對闡述酒炙內(nèi)涵具有重要意義。

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種肺內(nèi)（肺炎、感染等）或肺外致病因素導致的急性彌漫性炎性肺損傷，進而引起急性呼吸衰竭的臨床綜合征[7-8]。全球急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的病死率高達40%以上，為威脅人類健康的重要疾病。本研究對生、酒黃芩治療脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI小鼠的藥效作用差異及其糞便中差異性內(nèi)源性代謝物進行研究，闡明生、酒黃芩抑制肺部炎性反應(yīng)潛在的生物標志物及相關(guān)代謝通路，為酒炙黃芩“行上焦、清濕熱”的作用機制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（魯）20160001。動物于相對濕度（50±10）%、溫度（20±2）℃、自然節(jié)律光照的SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號JZSYDWLL-20200611）。

1.2 藥品與試劑

生黃芩飲片（批號18062101）購自天津盛實百草藥業(yè)有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室楊明教授鑒定為唇形科植物黃芩S.baicalensisGeorgi的干燥根，酒黃芩飲片由生黃芩按《中國藥典》標準規(guī)范炮制而成；LPS（批號MB5198）購自美國Sigma公司；地塞米松磷酸鈉注射液（批號1901082）購自湖北天藥藥業(yè)有限公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號2020-06R）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；質(zhì)譜級甲醇、乙腈購自上海羅恩公司；色譜級甲酸購自德國Merck公司。

1.3 儀器

Triple TOFTM5600型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS，美國AB SCIEX公司）；Multiskan GO 1510型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA124型萬分之一電子分析天平、BT25S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；TGL-20MC型臺式高速冷凍離心機（湖南湘鑫儀器儀表有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；V3S025型漩渦儀（德國IKA公司）；Medium-E400UF型實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 生、酒黃芩提取物的制備

稱取生黃芩50 g，分別加入10、8倍量的水回流提取2 h，經(jīng)紗布濾過，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50 mL，得到含生藥量1 g/mL的生黃芩提取物。酒黃芩按同法制得酒黃芩提取物。

2.2 分組、給藥與造模

C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松（5 mg/kg）組、生黃芩（15 g/kg）組和酒黃芩（15 g/kg）組，每組8只。生黃芩組和酒黃芩組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7 d；地塞米松組第1～6天ig等體積蒸餾水，第7天ip地塞米松磷酸鈉注射液。末次給藥30 min后，小鼠吸入異氟烷麻醉，模型組和各給藥組小鼠口咽后壁滴入50 μL LPS溶液（1 mg/mL），對照組滴入生理鹽水，迅速捏住小鼠鼻孔，維持30 s，等待出現(xiàn)輕微氣管羅音，即造模成功。造模16 h后，于無菌條件下手持小鼠，擠壓小鼠肛門刺激排便，用無菌凍存管收集，于液氮中保存。

2.3 生、酒黃芩對ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影響

小鼠吸入CO2安樂死，行頸部手術(shù)暴露氣管，在甲狀腺位置做T型切口，用22 G靜脈穿刺針做氣管插管，以0.5 mL PBS溶液灌洗左肺3次，回抽灌洗液即得BALF，1500 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平。

2.4 生、酒黃芩對ALI小鼠肺干濕質(zhì)量比和臟器指數(shù)的影響

取小鼠右肺下葉，稱定質(zhì)量，計算肺干濕質(zhì)量比；取胸腺、脾臟，稱定質(zhì)量，計算小鼠臟器指數(shù)。

肺干濕質(zhì)量比＝肺干質(zhì)量/肺濕質(zhì)量

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量

2.5 生、酒黃芩對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

取小鼠右肺上葉浸泡于組織固定液中，室溫放置24 h以上，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 糞便代謝組學研究

2.6.1 糞便樣本處理 稱取各組小鼠糞便樣本20 mg，加入120 μL甲醇，勻漿1 min，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL，進行超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS）分析。稱取各糞便樣本10 mg，按上述方法處理后作為質(zhì)控樣品。分析前連續(xù)進樣3次確保儀器穩(wěn)定性良好，分析過程中每進8針樣品后進1針質(zhì)控樣品。

2.6.2 色譜條件 Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），流動相為甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，5%～25% B；4～10 min，25%～45% B；10～22 min，45%～95% B；22～25 min，95%～5% B；體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣體積為1 μL。

2.6.3 質(zhì)譜條件 離子化模式為電噴霧正離子模式和負離子模式；離子源電壓為5500 V；離子源溫度為550 ℃；去簇電壓為100 V/-100 V；碰撞能量為35 eV/-35 eV，碰撞能量擴展為20 eV；霧化氣體為N2；輔助氣1為379.225 kPa，輔助氣2為379.225 kPa，氣簾氣為241.325 kPa；一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為m/z50～1250；IDA設(shè)置響應(yīng)值超過10 cp的峰優(yōu)先進行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為m/z50～1250，開啟動態(tài)背景扣除。

2.7 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Markview 1.3.1軟件對原始數(shù)據(jù)進行峰識別、對齊、濾噪、峰面積歸一化等預(yù)處理，得到含有代謝物保留時間（tR）、質(zhì)荷比、強度等信息的數(shù)據(jù)矩陣文件。將其導入SIMCA-P 14.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），將變量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）＞1.0和P＜0.05的變量視為差異變量。

利用HMDB（http://www.hmdb.ca/）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.kegg.ca/）對差異變量的二級碎片離子進行鑒定，檢索誤差范圍設(shè)置為0.1；使用MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫（http://www.metaboanalyst.ca/）進行代謝通路分析，影響值＞0.1的代謝通路被認為是潛在的靶點路徑。

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析數(shù)據(jù)，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 8軟件繪制統(tǒng)計圖。

3 結(jié)果

3.1 生、酒黃芩對ALI小鼠BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著升高（P＜0.01），IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，生、酒黃芩組小鼠BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著降低（P＜0.01），IL-10水平顯著升高（P＜0.01）；酒黃芩抑制ALI小鼠肺部炎性反應(yīng)作用明顯優(yōu)于生黃芩（P＜0.01）。

3.2 生、酒黃芩對ALI小鼠肺干濕質(zhì)量比和臟器指數(shù)的影響

胸腺和脾臟指數(shù)通常被用作評估宿主免疫能力。如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，酒黃芩組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.05、0.01），生黃芩組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)呈升高趨勢，地塞米松組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），表明地塞米松對機體免疫器官造成損傷[9]。肺水腫是ALI最主要的病理特征之一，與對照組比較，模型組小鼠肺干濕質(zhì)量比顯著升高（P＜0.01），肺水腫嚴重；與模型組比較，地塞米松組和酒黃芩組小鼠肺干濕質(zhì)量比顯著降低（P＜0.01），生黃芩組小鼠肺干濕質(zhì)量比呈降低趨勢，表明酒黃芩改善ALI小鼠臟器損傷的作用優(yōu)于生黃芩。

圖1 生、酒黃芩對ALI小鼠BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影響 ( ±s,n=8)Fig.1 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on levels of IL-6,IL-8,IL-10 and TNF-α in BALF of ALI mice ( ±s,n=8)

圖2 生、酒黃芩對ALI小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和肺干濕質(zhì)量比的影響 ( ±s,n=8)Fig.2 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on thymus index,spleen index and lung dry-wet weight ratio in ALI mice ( ±s,n=8)

3.3 生、酒黃芩對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔及肺泡腔未見明顯病理改變；模型組小鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯，肺泡壁明顯增厚和間質(zhì)水腫，表明造模成功；各給藥組肺組織病變程度降低，炎性細胞浸潤和紅細胞滲出、增生等情況均有所改善，其中酒黃芩組與對照組小鼠肺組織形態(tài)相似。

3.4 UPLC-QTOF-MS分析

正、負離子模式下，小鼠糞便總離子流圖見圖4。針對系統(tǒng)穩(wěn)定性，隨機選取質(zhì)控樣本中的12個分子離子峰，計算其tR和峰強度的RSD見表1，選取的12個分子離子峰tR的RSD為0.02%～0.15%，峰強度的RSD為3.14%～8.78%，表明質(zhì)控樣品中的離子具有良好的質(zhì)量準確度，符合代謝組學分析要求。

3.5 多元統(tǒng)計分析

3.5.1 PCA分析 如圖5所示，正、負離子模式下，各組樣本之間存在一定的交叉，但對照組與模型組樣本可較明顯地分開，表明ALI小鼠糞便中的代謝物發(fā)生了明顯的變化。

圖3 生、酒黃芩對ALI小鼠肺組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.3 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on pathological changes of lung tissues in ALI mice (HE,× 100)

圖4 正離子 (A)、負離子 (B) 模式下的小鼠糞便總離子流圖Fig.4 Total ion chromatograms in fecal samples obtained in positive mode (A) and negative mode (B)

3.5.2 OPLS-DA分析 采用有監(jiān)督的OPLS-DA方法確定ALI小鼠造模前后及生、酒黃芩治療后糞便中內(nèi)源性差異代謝物，如圖6所示，對照組和模型組樣本區(qū)分明顯，正離子模式：R2X=0.451，R2Y=0.994，Q2=0.869；負離子模式：R2X=0.766，R2Y=1.000，Q2=0.814，表明該模型具有較好的魯棒性和預(yù)測能力。

表1 系統(tǒng)穩(wěn)定性驗證Table 1 System stability investigation

圖5 正離子 (A)、負離子 (B) 模式下各組小鼠糞便樣品的PCA得分圖Fig.5 PCA score plots of fecal samples of mice in different groups in positive mode (A) and negative mode (B)

3.6 ALI小鼠糞便差異代謝物分析

基于上述OPLS-DA模型，結(jié)合VIP＞1且P＜0.05的篩選條件及數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果，最終在對照組與模型組小鼠糞便中鑒定出10個差異代謝物（表2）。與對照組比較，模型組小鼠糞便中L-蛋氨酸、孕酮、孕烯醇酮、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸和鞘氨醇水平顯著升高，花生四烯酸、L-色氨酸、2′-脫氧尿苷和鳥苷水平顯著降低。

影響ALI的代謝通路見圖7，其中影響值＞0.1的代謝通路有9條，分別為：①苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸的生物合成；②D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝；③苯丙氨酸代謝；④花生四烯酸代謝；⑤丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；⑥鞘脂類代謝；⑦色氨酸代謝；⑧精氨酸的生物合成；⑨半胱氨酸和蛋氨酸代謝。由此可見，ALI小鼠體內(nèi)正常的氨基酸代謝與脂質(zhì)代謝水平發(fā)生紊亂。

圖6 正、負離子模式下小鼠糞便樣品OPLS-DA得分圖 (A、B) 及相應(yīng)模型驗證圖 (C、D)Fig.6 OPLS-DA score plots (A,B) and corresponding model validation plot (C,D) of fecal samples in mice in positive and negative modes

表2 ALI小鼠糞便內(nèi)源性差異代謝物Table 2 Different endogenous metabolites in fecal samples of ALI mice

圖7 ALI小鼠糞便代謝通路圖Fig.7 Fecal metabolic pathways analysis in ALI mice

3.7 生、酒黃芩對ALI小鼠糞便中差異代謝物的影響

如圖8所示，與模型組比較，生黃芩組小鼠糞便代謝物花生四烯酸、2′-脫氧尿苷、鳥苷和L-色氨酸水平顯著升高（P＜0.01），L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、孕酮、孕烯醇酮和鞘氨醇水平顯著降低（P＜0.01）；酒黃芩組小鼠糞便代謝物花生四烯酸、鳥苷和L-色氨酸水平顯著升高（P＜0.05、0.01），L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、孕酮、孕烯醇酮和鞘氨醇水平顯著降低（P＜0.01）；生、酒黃芩組L-蛋氨酸水平無明顯變化。

圖8 生、酒黃芩對ALI小鼠糞便中差異代謝物的影響 ( ±s,n=8)Fig.8 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on differential metabolites in feces of ALI mice ( ±s,n=8)

表3 生、酒黃芩干預(yù)ALI小鼠糞便內(nèi)源性差異代謝物Table 3 Different endogenous metabolites in feces of ALI mice intervened by raw and wine-processed Scutellariae Radix

圖9 生、酒黃芩干預(yù)后ALI小鼠糞便代謝通路圖Fig.9 Fecal metabolism pathway in ALI mice intervened by raw and wine-processed Scutellariae Radix

圖10 不同組間的糞便差異代謝物韋恩圖Fig.10 Venn diagram of differential metabolites in feces between different groups

生、酒黃芩干預(yù)ALI的糞便差異代謝物見表3，代謝通路見圖9，生、酒黃芩通過調(diào)節(jié)不同代謝途徑發(fā)揮作用。各組間小鼠糞便差異代謝物韋恩圖見圖10，對照組與模型組、模型組與生黃芩組重疊的差異代謝物為鞘氨醇和L-谷氨酸；對照組與模型組、模型組與酒黃芩組重疊的差異代謝物為L-苯丙氨酸。生黃芩通過D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝通路以及鞘脂類代謝通路緩解ALI，而酒黃芩則調(diào)節(jié)苯丙氨酸代謝通路發(fā)揮療效。

4 討論

本研究通過小鼠口咽吸入LPS建立ALI模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠出現(xiàn)免疫臟器損傷以及嚴重的肺組織損傷，且體內(nèi)炎性因子水平失衡；酒黃芩的療效優(yōu)于生黃芩，與炮制理論一致。采用糞便代謝組學探究ALI潛在發(fā)病機制及黃芩酒炙干預(yù)ALI的內(nèi)在機制，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ALI小鼠糞便中鑒定得到10個差異代謝物，主要包括氨基酸類、鞘氨醇及花生四烯酸等，主要涉及多種氨基酸的合成與代謝以及脂質(zhì)代謝，這些潛在的代謝通路與文獻報道一致[10]。生黃芩組中鑒定得到24個差異代謝物，酒黃芩組中鑒定得到21個差異代謝物，結(jié)合通路富集分析和組間差異代謝物的并集分析，發(fā)現(xiàn)生黃芩通過調(diào)節(jié)D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝通路和鞘脂類代謝通路發(fā)揮作用，而酒黃芩通過苯丙氨酸代謝通路發(fā)揮作用。

D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝通路中主要的代謝物L-谷氨酸和L-谷氨酰胺在抗氧化中發(fā)揮著重要作用[11-12]。活性氧自由基的過量產(chǎn)生可引起ALI[13]，因此當與抗氧化劑相關(guān)的代謝通路激活時，生成抗氧化劑清除過量氧自由基，恢復免疫系統(tǒng)的正常運行，維持機體氧化還原平衡。谷氨酸受體重要亞型之一的N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D- aspartate，NMDA）受體可因肺內(nèi)谷氨酸含量升高而過度激活，使肺組織出現(xiàn)高通透性肺水腫[14]。本研究檢測到模型組小鼠糞便中谷氨酸水平顯著升高，表明LPS刺激后谷氨酸釋放增多；在生黃芩干預(yù)下，谷氨酸水平顯著下調(diào)，提示生黃芩可能通過阻斷谷氨酸NMDA受體，發(fā)揮維持谷氨酸穩(wěn)態(tài)與抗氧化應(yīng)激的作用。近年來，大量研究表明苯丙氨酸在急性炎性疾病中發(fā)揮作用。體內(nèi)高濃度苯丙氨酸可能增加ARDS的死亡率[15]。嚴重的肺部炎性反應(yīng)導致苯丙氨酸-4-羥化酶及5,6,7,8-四氫生物蝶呤活性降低，苯丙氨酸累積，從而促進炎性反應(yīng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予酒黃芩后，ALI小鼠糞便中苯丙氨酸向正常水平回調(diào)，提示酒黃芩具有促進其轉(zhuǎn)化并抑制炎性反應(yīng)的作用。

綜上，本研究通過ALI模型模擬上焦?jié)駸岚Y，考察生、酒黃芩干預(yù)ALI小鼠的藥效差異以及內(nèi)源性代謝物的差異影響，探討黃芩酒炙“行上焦、清濕熱”的作用機制，為解釋中藥炮制機制提供了一種新模式。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突