楊俊莉，鐘林江，雷 陽(yáng)，鄧 妍，高天賜，徐玉玲*，劉 濤,4，張 坤

1.成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610106

2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106

3.成都柏瑞泰生物科技有限公司，四川 成都 610106

4.四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610106

熊膽為我國(guó)名貴中藥材，藥用為脊索動(dòng)物門哺乳綱熊科熊屬黑熊Selenaretos thibetanusCuvier及棕熊UrsusarctosLinnaeus的膽囊，被譽(yù)為“藥中黃金”[1]。目前，廣泛應(yīng)用于臨床的熊膽粉，為黑熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁干燥而得，具有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血等功效[2]，屬于原國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的一類新藥。據(jù)《中國(guó)熊膽粉市場(chǎng)供需情況與發(fā)展趨勢(shì)研究報(bào)告（2015—2020）》統(tǒng)計(jì)，由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)的合法藥品中，含熊膽粉的中藥制劑有243種[3]。據(jù)調(diào)查，熊膽粉現(xiàn)行大生產(chǎn)干燥方式多采用常壓干燥，其干燥溫度高、時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)效益低，造成資源浪費(fèi)。不同的干燥方式的加熱方式及原理存在差異，必然會(huì)導(dǎo)致干燥產(chǎn)物的物理性質(zhì)及成分含量的不同[4-5]。目前未見(jiàn)熊膽粉的生產(chǎn)工藝對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用影響研究相關(guān)報(bào)道。

動(dòng)物類中藥是中藥中極具特色的一部分，其藥性峻猛，藥效成分不明確。但多數(shù)動(dòng)物類中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控性差，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，在一定程度上制約了動(dòng)物類中藥的發(fā)展。熊膽粉的化學(xué)成分主要包括膽酸類、膽固醇、色素類、磷脂、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽以及微量元素等[6]。目前熊膽粉的研究熱點(diǎn)主要集中在其含量較高的膽汁酸類成分，忽略了非膽汁酸類成分與其協(xié)同發(fā)揮藥效的作用。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，熊膽粉在肝膽系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及抗腫瘤等方面展示出良好的藥效活性[7]。林國(guó)華等[8]發(fā)現(xiàn)熊膽粉能有效抑制肝膽疾病引起的腹痛；韓瑩等[9]、周超凡等[10]報(bào)道熊膽粉能有效減輕冠心病等引起的胸痛。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS）已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速鑒定、藥物質(zhì)量控制等多個(gè)研究領(lǐng)域[11-12]，可通過(guò)將LC-MS掃描的碎片離子信息和化合物裂解規(guī)律與對(duì)照品或文獻(xiàn)比對(duì)來(lái)快速、準(zhǔn)確地分析中藥中所含化學(xué)成分[13-14]。

本研究遵循熊膽粉歷史藥用方法，結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)的發(fā)展，采用常壓及減壓干燥制備熊膽粉，采用UPLC-QTRAP-MS技術(shù)對(duì)常壓、減壓干燥熊膽粉進(jìn)行檢測(cè)，比較其差異成分，并以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為指導(dǎo)，利用計(jì)算機(jī)模擬和各種數(shù)據(jù)庫(kù)篩選藥物分子作用靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)其信號(hào)通路和作用機(jī)制，采用相關(guān)軟件進(jìn)行化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)可視化[15-16]，探究常壓、減壓干燥熊膽粉對(duì)病毒性肝炎、膽囊炎及冠心病的潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并進(jìn)行鎮(zhèn)痛藥效學(xué)驗(yàn)證，從整體上探索藥物與疾病的相關(guān)性，為闡明熊膽粉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、提高其質(zhì)量控制水平奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Shimadzu Nexera X2 CBM30A超高效液相色譜，日本島津有限公司；4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜，Applied Biosystems公司；100 μL移液槍，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；1 mL注射器、5 mL注射器，湖南省綠洲惠康發(fā)展有限公司；800Y高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；SHZ-C型循環(huán)水式真空泵，鞏義式予華儀器有限責(zé)任公司；FA2004電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DZF-6050A真空恒溫干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YLS-6B智能熱板儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站。熊膽汁，采自四川養(yǎng)麝研究所，批號(hào)為201905028，經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員鑒定為熊科熊屬黑熊S.thibetanusCuvier膽汁；變色硅膠，成都市科隆化學(xué)藥品有限公司，批號(hào)2017050102；甲醇、乙腈，色譜純，Merck公司；水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純，均購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

SPF級(jí)小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，批號(hào)為190729，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循《四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-QTRAP-MS檢測(cè)

2.1.1 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～10.0 min，95%～10% A；10.0～11.0 min，10% A；11.0～11.1 min，10%～95% A；11.1～14.0 min，95% A；體積流量0.35 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）+5500 V（正離子模式）/-4500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為344.738、413.685、172.369 kPa（50、60、25.0 psi），碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10、100 μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。各離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進(jìn)行掃描檢測(cè)。

2.1.3 供試品溶液制備及分析 取潔凈的熊膽汁供試樣品，分別進(jìn)行常壓干燥（熱風(fēng)循環(huán)溫度105 ℃；時(shí)間36 h 18 min）和減壓干燥（溫度65 ℃；壓力-0.08 MPa；時(shí)間25 h 53 min），研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀，即得熊膽粉；稱量熊膽粉50 mg，溶解于1 mL 70%甲醇中，振蕩5 min，冰上靜置15 min；在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，離心后吸取上清液400 μL到對(duì)應(yīng)的EP管中；靜置于-20 ℃冰箱，過(guò)夜；在4 ℃條件下，12 000 r/min再離心3 min；離心后取上清200 μL用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)樣品，于對(duì)應(yīng)進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)襯管中，用于UPLC-MS/MS分析。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

2.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件 數(shù)據(jù)庫(kù)：PharmMapper（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Uniprot（https://www.uniprot.org/）；GeneCards（https://www.Gene cards.org/）；STRING（https://string-db.org/cgi/ input.pl）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；VENNY（https://bioinfogp.cnb.csic.es）；軟件：Cytoscape 3.6.0；Prism 6。

2.2.2 核心靶標(biāo)獲取 通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)[17]，檢索UPLC-QTRAP-MS檢測(cè)出的常壓、減壓熊膽粉的8種差異成分的3D結(jié)構(gòu)，在PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的Uniprot ID，運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索靶標(biāo)名稱，得到相應(yīng)基因。根據(jù)腹痛、胸痛相關(guān)的臨床表型合集，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索virus hepatitis（病毒性肝炎）、cholecystitis（膽囊炎）、coronary disease（冠心?。┘膊“悬c(diǎn)，建立疾病的相關(guān)基因集。運(yùn)用Venny2.0網(wǎng)站得到成分與疾病的交集基因。

2.2.3 靶點(diǎn)通路分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，觀察潛在作用靶標(biāo)的生物學(xué)功能。依據(jù)通路富集結(jié)果，選擇前20個(gè)條目使用GraphPad Prism 6.0軟件繪制柱狀圖。選擇KEGG分析結(jié)果前20條信號(hào)通路使用Omicshare 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omicshare.com）繪制高級(jí)氣泡圖。

2.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集基因，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.2.5 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 根據(jù)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果前20個(gè)通路對(duì)應(yīng)基因，以及基因?qū)?yīng)化合物，構(gòu)建成分、核心靶標(biāo)和關(guān)鍵通路之間相互作用關(guān)系表，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析，進(jìn)一步探討熊膽粉鎮(zhèn)痛的分子機(jī)制。

2.3 鎮(zhèn)痛藥效實(shí)驗(yàn)

2.3.1 供試品溶液制備 分別取“2.1.3”項(xiàng)下所制備的常壓、減壓熊膽粉適量，精密稱定，加入純化水配制成適宜質(zhì)量濃度的溶液，超聲溶解（功率240 W，頻率40 kHz），即得。

2.3.2 熱板法 取體質(zhì)量18～22 g經(jīng)痛閾篩選合格（痛閾在5～30 s）的SPF級(jí)小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組：生理鹽水組（5 mL/kg）、阿司匹林組（0.08 g/kg）、常壓干燥及減壓干燥熊膽粉組（0.208 g/kg）。給藥前測(cè)定其自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間作為該鼠正常痛閾值，連續(xù)ig給藥7 d，于第7天測(cè)定給藥后30、60、90、120 min時(shí)的痛閾值。

2.3.3 醋酸扭體法 取體質(zhì)量18～22 g小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各5只。分組及給藥劑量同熱板法，ig給藥連續(xù)7 d。末次給藥0.5 h后ip 0.6%醋酸0.2 mL/只，觀察15 min內(nèi)各鼠扭體潛伏期及其出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 熊膽粉成分鑒定

圖1 常壓、減壓熊膽粉混合質(zhì)譜分析總離子流圖Fig.1 Mass spectrometry total ion chromatogram of mixture of atmospheric and vacuum bear bile powder

圖2 MRM代謝物檢測(cè)多峰圖Fig.2 Multimodal graph of MRM metabolite detection

利用軟件Analyst 1.6.1處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖1、2 所示為混樣質(zhì)控QC樣本的總離子流圖（total ions current，TIC）及MRM代謝物檢測(cè)多峰圖（多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC）。

為了比較所有檢測(cè)到的代謝物中每個(gè)代謝物在不同樣本中的物質(zhì)含量差異，根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰形的信息，對(duì)每個(gè)代謝物在常壓、減壓熊膽粉以及混合樣本中檢測(cè)到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。圖3展示了隨機(jī)抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果。

采用UPLC-MS/MS法對(duì)常壓干燥、減壓干燥熊膽粉進(jìn)行成分定性及定量鑒定，從常壓干燥熊膽粉中發(fā)現(xiàn)了724個(gè)化學(xué)成分，從減壓干燥熊膽粉中發(fā)現(xiàn)了個(gè)726化學(xué)成分，交集成分721個(gè)，差異成分8個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1和圖4，其中差異成分為定性結(jié)果。根據(jù)峰面積顯示，交集成分主要有膽汁酸、甘油磷脂類、有機(jī)酸類、脂肪酰類、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，包括甘氨熊脫氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、豬去氧膽酸、溶血磷脂酰膽堿、棕櫚油酸、馬尿酸、犬尿酸等。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.2.1 核心靶標(biāo)獲取 將篩選出的8種差異化學(xué)成分，通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到藥物潛在靶點(diǎn)共1605個(gè)，主要包括木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化酶、磷酸核糖胺-甘氨酸連接酶、谷氨酰-tRNA還原酶、同質(zhì)兒茶酸分解代謝雙功能異構(gòu)酶/脫羧酶、基因組多蛋白、核糖核酸酶HII、蛋白recA等；通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到病毒性肝炎靶點(diǎn)7444個(gè)、膽囊炎靶點(diǎn)636個(gè)、冠心病靶點(diǎn)7563個(gè)，通過(guò)Venny2.0得出差異成分對(duì)病毒性肝炎、膽囊炎、冠心病的交集基因有282個(gè)，見(jiàn)圖5，包括Friend白血病整合1轉(zhuǎn)錄因子（friend leukemia integration 1，F(xiàn)LI1）、cGMP抑制3,5-環(huán)磷酸二酯酶B（cGMP-inhibited 3,5cyclic phosphodiesterase B，PDE3B）、蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶2（protein-glutamine γ- glutamyltransferase 2，TGM2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、果糖醛縮酶B（fructose-bisphosphate aldolase B，ALDOB）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Toll樣受體1（Toll-like receptor 1， TLR1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Fes/Fps（tyrosine- protein kinase Fes/Fps，F(xiàn)ES）、半乳糖激酶（galactokinase，GALK1）、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-31（Ras-related protein Rab-31，RAB31）等。

圖3 代謝物定量分析積分校正Fig.3 Quantitative analysis integration correction of metabolites

表1 常壓干燥、減壓干燥熊膽粉差異成分Table 1 Differential components of normal pressure drying and vacuum drying bear bile powder

圖4 常壓、減壓熊膽粉成分交集圖Fig.4 Composition diagram of normal pressure and reduced pressure bear bile powder

圖5 成分與疾病交集基因圖Fig.5 Intersection gene map of components and diseases

3.2.2 靶點(diǎn)通路分析 DAVID中GO功能富集分析得到GO條目759個(gè)（P＜0.05），其中包括小分子代謝過(guò)程、有機(jī)物代謝過(guò)程、有機(jī)氮化合物代謝過(guò)程、細(xì)胞代謝過(guò)程、初級(jí)代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物過(guò)程的調(diào)控、對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、發(fā)展過(guò)程等生物過(guò)程（biological processes，BP）條目717個(gè)，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)受體、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞器腔、細(xì)胞器、膜結(jié)合細(xì)胞器等細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目21個(gè)，包括結(jié)合、催化活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、離子結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、小分子結(jié)合等分子功能（molecular function，MF）條目21個(gè)。

分別選擇前20個(gè)用GraphPad Prism 6.0軟件繪制柱狀圖，結(jié)果見(jiàn)圖6～8。KEGG通路富集篩選得到28條信號(hào)通路（P＜0.05）見(jiàn)表2，涉及癌癥通路、前列腺癌通路、原發(fā)性免疫缺陷通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、谷胱甘肽代謝等。選擇前20條信號(hào)通路，使用Omicshare數(shù)據(jù)庫(kù)繪制氣泡圖，見(jiàn)圖9，PPI網(wǎng)絡(luò)圖如圖10所示。

圖6 GO富集分析 (生物過(guò)程)Fig.6 GO enrichment analysis (biological processes)

圖7 GO富集分析 (細(xì)胞組成)Fig.7 GO enrichment analysis (cellular component)

圖8 GO富集分析 (分子功能)Fig.8 GO enrichment analysis (molecular function)

表2 常壓、減壓干燥熊膽粉成分與疾病交集基因KEGG通路Table 2 Intersection gene KEGG pathway between components and disease of normal pressure and reduced pressure dried bear bile powder

3.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由Cytoscape 3.7.0構(gòu)建得到129個(gè)節(jié)點(diǎn)，如圖11所示，其中菱形為對(duì)應(yīng)化學(xué)成分、橢圓形為對(duì)應(yīng)基因、飛鏢形為對(duì)應(yīng)通路。結(jié)果采用度（degree）、平均最短路徑（ASPL）、中介中心度（BC）和接近中心性（CC）排序確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中度值≥中位數(shù)（成分度值中位數(shù)＝12.5，靶標(biāo)度值中位數(shù)＝5）的成分分別是鳥苷5′-單磷酸水合物、甲基間酪氨酸、左旋甲狀腺素及大黃素8-葡萄糖苷。靶標(biāo)有二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD）、過(guò)氧化氫酶-2（cationic amino acid transporter，CAT）、一氧 化氮合酶（nitric oxide synthase 2，NOS2）、囊泡蛋白（golgi transport 1，GOT1）、過(guò)氧化物酶體?；o酶A氧化酶（peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase，ACOX）、甾醇o(jì)-酰基轉(zhuǎn)移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）、羥酸氧化酶 1（hydroxyacid oxidase 1，HAO1）、Creb結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CREBBP）、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素（proprotein carrier protein，PC）、精氨基琥珀酸合酶（argininosuccinate synthase，ASS）。通路主要有代謝通路和癌癥通路。

3.3 藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 熱板法 對(duì)小鼠熱板致痛抑制作用如表3所示，結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，常壓、減壓干燥熊膽粉均能在60 min顯著提高小鼠痛閾值（P＜0.05、0.01），其中常壓與減壓干燥組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。

3.3.2 醋酸扭體法 對(duì)小鼠醋酸扭體致痛抑制作用如表4所示，結(jié)果表明，常壓、減壓干燥熊膽粉對(duì)小鼠醋酸所致疼痛均有一定的抑制作用，并能延長(zhǎng)小鼠發(fā)生扭體反應(yīng)的潛伏期，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。

圖9 KEGG富集分析前20個(gè)通路氣泡圖Fig.9 Bubble chart of top 20 channels of KEGG enrichment analysis

圖10 KEGG前20條通路基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 PPI network diagram of top 20 pathway genes of KEGG

圖11 常壓、減壓熊膽粉差異成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.11 Differential composition-target-pathway network diagram of normal pressure and reduced pressure dried bear bile powder

表3 小鼠給藥前后平均痛閾值 ( ±s,n = 12)Table 3 Average pain threshold of mice before and after administration ( ±s,n = 12)

表3 小鼠給藥前后平均痛閾值 ( ±s,n = 12)Table 3 Average pain threshold of mice before and after administration ( ±s,n = 12)

與生理鹽水組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與減壓干燥組比較：▲▲P＜0.01，表4同*P < 0.05 **P < 0.01 vs normal saline group; ▲▲P < 0.01 vs vacuum drying group,same as table 4

組別 給藥前平均痛閾值/s 給藥后不同時(shí)間平均痛閾值/s 30 min 60 min 90 min 120 min 生理鹽水 19.69±4.47 20.36±13.66 16.29±4.44 17.17±10.78 15.72±6.13 常壓干燥 19.88±6.28 20.44±10.34 22.30±15.09*▲▲ 26.55±18.94▲▲ 18.38±6.59 減壓干燥 19.83±5.39 23.60±14.87 28.68±18.71** 21.67±14.65 20.16±8.19 阿司匹林 18.79±6.60 28.87±19.22 26.04±17.34 22.65±13.90 19.64±5.85

表4 小鼠扭體潛伏期及15 min內(nèi)平均扭體次數(shù) ( ±s,n = 10)Table 4 Latency period of mouse torsion and average times of torsion in 15 min ( ±s,n = 10)

表4 小鼠扭體潛伏期及15 min內(nèi)平均扭體次數(shù) ( ±s,n = 10)Table 4 Latency period of mouse torsion and average times of torsion in 15 min ( ±s,n = 10)

組別 小鼠扭體潛伏期/min 15 min內(nèi)扭體次數(shù) 生理鹽水 4.42±2.51 36.10±21.59 常壓干燥 6.46±2.80 15.80±16.14**▲▲ 減壓干燥 5.93±2.80 22.50±9.81** 阿司匹林 8.80±3.83 8.20±5.65

4 討論

熊膽粉的文獻(xiàn)報(bào)道主要活性成分熊去氧膽酸（ursodesoxycholic acid，UCDA）可通過(guò)人工合成途徑獲得，一定程度上為其替代品提供了可能性，但有專家表明熊膽粉的功效在于其UCDA與其他多種成分的協(xié)同作用，人工合成UCDA難以完全替代其療效。本研究采用UPLC-MS/MS及高通量篩選的方法代替數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，分析測(cè)定了常壓及減壓干燥熊膽粉上千種化學(xué)成分，明確其差異性，高效研究其中活性成分，排除與主治無(wú)關(guān)或毒性成分。解決了目前僅基于一種或幾種代表性化合物相似性對(duì)藥物的藥效進(jìn)行預(yù)測(cè)的問(wèn)題。同時(shí)，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)指導(dǎo)下研究各組分對(duì)多靶點(diǎn)的活性，預(yù)測(cè)常壓干燥及減壓干燥差異成分鎮(zhèn)痛作用機(jī)制，通過(guò)拓?fù)鋮?shù)分析得到常壓干燥及減壓干燥熊膽粉差異成分治療病毒性肝炎、膽囊炎及冠心病3種疾病的關(guān)鍵成分有鳥苷5′-單磷酸水合物、甲基間酪氨酸、左旋甲狀腺素及大黃素8-葡萄糖苷，關(guān)鍵基因有FLI1、PDE3B、TGM2、IGF1R、ALDOB、PCNA、TLR1、FES、GALK1、RAB31，涉及的關(guān)鍵通路有癌癥通路及代謝通路。

文獻(xiàn)研究表明熊膽粉可以顯著調(diào)節(jié)丙型肝炎模型樹鼩體內(nèi)的?；撬峒皝喤；撬岽x、甘油磷脂代謝、色氨酸代謝及初級(jí)膽汁酸代謝途徑的擾動(dòng)，從而治療病毒性肝炎[19]。常壓、減壓熊膽粉8種差異成分中大黃素和益母草堿為質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢定出的成分，而目前文獻(xiàn)報(bào)道熊膽粉成分大多為膽汁酸類、氨基酸類及微量元素等，未見(jiàn)報(bào)道大黃素、益母草堿，有待進(jìn)一步進(jìn)行分離鑒定，但文獻(xiàn)研究表明，大黃素[20]具有保護(hù)心血管、保肝護(hù)肺等生物活性，益母草堿[21]也在文獻(xiàn)報(bào)道中體現(xiàn)出有直接的保護(hù)心肌細(xì)胞損傷作用，這可能為熊膽粉治療病毒性肝炎、膽囊炎及冠心病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熊膽的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)除以往認(rèn)識(shí)的熊去氧膽酸及?；切苋パ跄懰岬饶懼岢煞滞?，還有氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，解決了動(dòng)物藥成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究不明確，且功效與成分難以關(guān)聯(lián)的問(wèn)題。

在此基礎(chǔ)上，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果表明常壓干燥及減壓干燥熊膽粉均具有鎮(zhèn)痛作用，且2種干燥方式鎮(zhèn)痛作用具有顯著性差異，因而得出干燥方式使得熊膽粉的化學(xué)組成存在一定差異，導(dǎo)致其鎮(zhèn)痛作用差異，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出結(jié)果中關(guān)鍵藥效成分均來(lái)源于減壓干燥，而常壓干燥溫度高，時(shí)間長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)建議大生產(chǎn)中采用減壓干燥制備熊膽粉，研究成果為后續(xù)制劑工藝的選擇以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。在分析成分的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)其個(gè)別成分含量也存在差異，這也可能是造成其鎮(zhèn)痛作用差異的原因，后續(xù)有待進(jìn)一步研究。

研究基于UPLC-QTRAP-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，揭示了熊膽粉鎮(zhèn)痛的多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同抗菌作用特點(diǎn)，較合理地解釋了熊膽粉在鎮(zhèn)痛方面臨床應(yīng)用的科學(xué)性。但本研究?jī)H采用了小鼠熱板法和醋酸扭體模型對(duì)熊膽粉鎮(zhèn)痛藥效進(jìn)行了驗(yàn)證，熱板法為熱刺激小鼠足部產(chǎn)生痛反應(yīng)，即舔足反應(yīng)，以小鼠出現(xiàn)舔足的時(shí)間作為痛反應(yīng)指標(biāo)；醋酸扭體模型為腹腔注射損傷物質(zhì)引起受試動(dòng)物腹痛，表現(xiàn)為“扭體反應(yīng)”，即腹部?jī)?nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起。而不同動(dòng)物模型其表現(xiàn)的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制有一定差異，因而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異，后續(xù)將進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

志謝：嘉興邁維代謝生物科技有限公司對(duì)熊膽粉UPLC-MS/MS檢測(cè)及分析數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突