楊俊莉，鐘林江，雷 陽，鄧 妍，高天賜，徐玉玲*，劉 濤,4，張 坤

1.成都大學藥學院，四川 成都 610106

2.成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106

3.成都柏瑞泰生物科技有限公司，四川 成都 610106

4.四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心，四川 成都 610106

熊膽為我國名貴中藥材，藥用為脊索動物門哺乳綱熊科熊屬黑熊Selenaretos thibetanusCuvier及棕熊UrsusarctosLinnaeus的膽囊，被譽為“藥中黃金”[1]。目前，廣泛應用于臨床的熊膽粉，為黑熊經(jīng)膽囊手術引流膽汁干燥而得，具有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血等功效[2]，屬于原國家衛(wèi)生部批準的一類新藥。據(jù)《中國熊膽粉市場供需情況與發(fā)展趨勢研究報告（2015—2020）》統(tǒng)計，由國家藥品監(jiān)督管理局正式批準的合法藥品中，含熊膽粉的中藥制劑有243種[3]。據(jù)調查，熊膽粉現(xiàn)行大生產(chǎn)干燥方式多采用常壓干燥，其干燥溫度高、時間長，經(jīng)濟效益低，造成資源浪費。不同的干燥方式的加熱方式及原理存在差異，必然會導致干燥產(chǎn)物的物理性質及成分含量的不同[4-5]。目前未見熊膽粉的生產(chǎn)工藝對其化學成分及藥理作用影響研究相關報道。

動物類中藥是中藥中極具特色的一部分，其藥性峻猛，藥效成分不明確。但多數(shù)動物類中藥的質量標準可控性差，無法準確評價藥材質量，在一定程度上制約了動物類中藥的發(fā)展。熊膽粉的化學成分主要包括膽酸類、膽固醇、色素類、磷脂、氨基酸、無機鹽以及微量元素等[6]。目前熊膽粉的研究熱點主要集中在其含量較高的膽汁酸類成分，忽略了非膽汁酸類成分與其協(xié)同發(fā)揮藥效的作用。文獻研究發(fā)現(xiàn)，熊膽粉在肝膽系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及抗腫瘤等方面展示出良好的藥效活性[7]。林國華等[8]發(fā)現(xiàn)熊膽粉能有效抑制肝膽疾病引起的腹痛；韓瑩等[9]、周超凡等[10]報道熊膽粉能有效減輕冠心病等引起的胸痛。

超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術（UPLC-MS）已被廣泛應用于中藥化學成分的快速鑒定、藥物質量控制等多個研究領域[11-12]，可通過將LC-MS掃描的碎片離子信息和化合物裂解規(guī)律與對照品或文獻比對來快速、準確地分析中藥中所含化學成分[13-14]。

本研究遵循熊膽粉歷史藥用方法，結合現(xiàn)代制劑技術的發(fā)展，采用常壓及減壓干燥制備熊膽粉，采用UPLC-QTRAP-MS技術對常壓、減壓干燥熊膽粉進行檢測，比較其差異成分，并以網(wǎng)絡藥理學為指導，利用計算機模擬和各種數(shù)據(jù)庫篩選藥物分子作用靶點，預測其信號通路和作用機制，采用相關軟件進行化合物-靶標-通路網(wǎng)絡可視化[15-16]，探究常壓、減壓干燥熊膽粉對病毒性肝炎、膽囊炎及冠心病的潛在作用靶點及作用機制，并進行鎮(zhèn)痛藥效學驗證，從整體上探索藥物與疾病的相關性，為闡明熊膽粉藥效物質基礎、提高其質量控制水平奠定了基礎。

1 儀器與材料

Shimadzu Nexera X2 CBM30A超高效液相色譜，日本島津有限公司；4500 QTRAP串聯(lián)質譜，Applied Biosystems公司；100 μL移液槍，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；1 mL注射器、5 mL注射器，湖南省綠洲惠康發(fā)展有限公司；800Y高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；SHZ-C型循環(huán)水式真空泵，鞏義式予華儀器有限責任公司；FA2004電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DZF-6050A真空恒溫干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YLS-6B智能熱板儀，山東省醫(yī)學科學院設備站。熊膽汁，采自四川養(yǎng)麝研究所，批號為201905028，經(jīng)成都大學劉濤研究員鑒定為熊科熊屬黑熊S.thibetanusCuvier膽汁；變色硅膠，成都市科隆化學藥品有限公司，批號2017050102；甲醇、乙腈，色譜純，Merck公司；水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純，均購自成都市科隆化學品有限公司。

SPF級小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，成都達碩實驗動物有限公司，批號為190729，許可證號：SCXK（川）2015-030。所有動物實驗遵循《四川省實驗動物管理條例》有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 UPLC-QTRAP-MS檢測

2.1.1 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～10.0 min，95%～10% A；10.0～11.0 min，10% A；11.0～11.1 min，10%～95% A；11.1～14.0 min，95% A；體積流量0.35 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長245 nm；進樣量5 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）+5500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設置為344.738、413.685、172.369 kPa（50、60、25.0 psi），碰撞誘導電離參數(shù)設置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10、100 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調諧和質量校準。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體（氮氣）設置為中等。各離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進行掃描檢測。

2.1.3 供試品溶液制備及分析 取潔凈的熊膽汁供試樣品，分別進行常壓干燥（熱風循環(huán)溫度105 ℃；時間36 h 18 min）和減壓干燥（溫度65 ℃；壓力-0.08 MPa；時間25 h 53 min），研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀，即得熊膽粉；稱量熊膽粉50 mg，溶解于1 mL 70%甲醇中，振蕩5 min，冰上靜置15 min；在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，離心后吸取上清液400 μL到對應的EP管中；靜置于-20 ℃冰箱，過夜；在4 ℃條件下，12 000 r/min再離心3 min；離心后取上清200 μL用微孔濾膜（0.22 μm）濾過樣品，于對應進樣瓶內襯管中，用于UPLC-MS/MS分析。

2.2 網(wǎng)絡藥理學預測

2.2.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 數(shù)據(jù)庫：PharmMapper（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Uniprot（https://www.uniprot.org/）；GeneCards（https://www.Gene cards.org/）；STRING（https://string-db.org/cgi/ input.pl）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；VENNY（https://bioinfogp.cnb.csic.es）；軟件：Cytoscape 3.6.0；Prism 6。

2.2.2 核心靶標獲取 通過PubChem數(shù)據(jù)庫[17]，檢索UPLC-QTRAP-MS檢測出的常壓、減壓熊膽粉的8種差異成分的3D結構，在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中檢索得到化學成分對應靶點的Uniprot ID，運用Uniprot數(shù)據(jù)庫，檢索靶標名稱，得到相應基因。根據(jù)腹痛、胸痛相關的臨床表型合集，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索virus hepatitis（病毒性肝炎）、cholecystitis（膽囊炎）、coronary disease（冠心?。┘膊“悬c，建立疾病的相關基因集。運用Venny2.0網(wǎng)站得到成分與疾病的交集基因。

2.2.3 靶點通路分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫中進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，觀察潛在作用靶標的生物學功能。依據(jù)通路富集結果，選擇前20個條目使用GraphPad Prism 6.0軟件繪制柱狀圖。選擇KEGG分析結果前20條信號通路使用Omicshare 數(shù)據(jù)庫（http://www.omicshare.com）繪制高級氣泡圖。

2.2.4 PPI網(wǎng)絡構建 根據(jù)藥物靶點與疾病靶點的交集基因，通過STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡。

2.2.5 成分-靶標-通路網(wǎng)絡構建及分析 根據(jù)KEGG信號通路富集分析結果前20個通路對應基因，以及基因對應化合物，構建成分、核心靶標和關鍵通路之間相互作用關系表，運用Cytoscape 3.8.0軟件構建成分-靶標-通路網(wǎng)絡圖，進行可視化分析，進一步探討熊膽粉鎮(zhèn)痛的分子機制。

2.3 鎮(zhèn)痛藥效實驗

2.3.1 供試品溶液制備 分別取“2.1.3”項下所制備的常壓、減壓熊膽粉適量，精密稱定，加入純化水配制成適宜質量濃度的溶液，超聲溶解（功率240 W，頻率40 kHz），即得。

2.3.2 熱板法 取體質量18～22 g經(jīng)痛閾篩選合格（痛閾在5～30 s）的SPF級小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組：生理鹽水組（5 mL/kg）、阿司匹林組（0.08 g/kg）、常壓干燥及減壓干燥熊膽粉組（0.208 g/kg）。給藥前測定其自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間作為該鼠正常痛閾值，連續(xù)ig給藥7 d，于第7天測定給藥后30、60、90、120 min時的痛閾值。

2.3.3 醋酸扭體法 取體質量18～22 g小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只，雌雄各5只。分組及給藥劑量同熱板法，ig給藥連續(xù)7 d。末次給藥0.5 h后ip 0.6%醋酸0.2 mL/只，觀察15 min內各鼠扭體潛伏期及其出現(xiàn)扭體反應次數(shù)。

3 結果

3.1 熊膽粉成分鑒定

圖1 常壓、減壓熊膽粉混合質譜分析總離子流圖Fig.1 Mass spectrometry total ion chromatogram of mixture of atmospheric and vacuum bear bile powder

圖2 MRM代謝物檢測多峰圖Fig.2 Multimodal graph of MRM metabolite detection

利用軟件Analyst 1.6.1處理質譜數(shù)據(jù)。圖1、2 所示為混樣質控QC樣本的總離子流圖（total ions current，TIC）及MRM代謝物檢測多峰圖（多物質提取的離子流譜圖，XIC）。

為了比較所有檢測到的代謝物中每個代謝物在不同樣本中的物質含量差異，根據(jù)代謝物保留時間與峰形的信息，對每個代謝物在常壓、減壓熊膽粉以及混合樣本中檢測到的質譜峰進行校正，以確保定性定量的準確。圖3展示了隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結果。

采用UPLC-MS/MS法對常壓干燥、減壓干燥熊膽粉進行成分定性及定量鑒定，從常壓干燥熊膽粉中發(fā)現(xiàn)了724個化學成分，從減壓干燥熊膽粉中發(fā)現(xiàn)了個726化學成分，交集成分721個，差異成分8個，結果見表1和圖4，其中差異成分為定性結果。根據(jù)峰面積顯示，交集成分主要有膽汁酸、甘油磷脂類、有機酸類、脂肪酰類、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，包括甘氨熊脫氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、豬去氧膽酸、溶血磷脂酰膽堿、棕櫚油酸、馬尿酸、犬尿酸等。

3.2 網(wǎng)絡藥理學結果

3.2.1 核心靶標獲取 將篩選出的8種差異化學成分，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫搜索得到藥物潛在靶點共1605個，主要包括木葡聚糖內轉糖基化酶、磷酸核糖胺-甘氨酸連接酶、谷氨酰-tRNA還原酶、同質兒茶酸分解代謝雙功能異構酶/脫羧酶、基因組多蛋白、核糖核酸酶HII、蛋白recA等；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到病毒性肝炎靶點7444個、膽囊炎靶點636個、冠心病靶點7563個，通過Venny2.0得出差異成分對病毒性肝炎、膽囊炎、冠心病的交集基因有282個，見圖5，包括Friend白血病整合1轉錄因子（friend leukemia integration 1，F(xiàn)LI1）、cGMP抑制3,5-環(huán)磷酸二酯酶B（cGMP-inhibited 3,5cyclic phosphodiesterase B，PDE3B）、蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶2（protein-glutamine γ- glutamyltransferase 2，TGM2）、胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、果糖醛縮酶B（fructose-bisphosphate aldolase B，ALDOB）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Toll樣受體1（Toll-like receptor 1， TLR1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Fes/Fps（tyrosine- protein kinase Fes/Fps，F(xiàn)ES）、半乳糖激酶（galactokinase，GALK1）、Ras相關蛋白Rab-31（Ras-related protein Rab-31，RAB31）等。

圖3 代謝物定量分析積分校正Fig.3 Quantitative analysis integration correction of metabolites

表1 常壓干燥、減壓干燥熊膽粉差異成分Table 1 Differential components of normal pressure drying and vacuum drying bear bile powder

圖4 常壓、減壓熊膽粉成分交集圖Fig.4 Composition diagram of normal pressure and reduced pressure bear bile powder

圖5 成分與疾病交集基因圖Fig.5 Intersection gene map of components and diseases

3.2.2 靶點通路分析 DAVID中GO功能富集分析得到GO條目759個（P＜0.05），其中包括小分子代謝過程、有機物代謝過程、有機氮化合物代謝過程、細胞代謝過程、初級代謝過程、生物調節(jié)、多細胞生物過程的調控、對有機物質的反應、發(fā)展過程等生物過程（biological processes，BP）條目717個，包括細胞質、細胞內受體、胞質溶膠、細胞器腔、細胞器、膜結合細胞器等細胞組成（cellular component，CC）條目21個，包括結合、催化活性、蛋白質結合、有機環(huán)狀化合物結合、離子結合、雜環(huán)化合物結合、小分子結合等分子功能（molecular function，MF）條目21個。

分別選擇前20個用GraphPad Prism 6.0軟件繪制柱狀圖，結果見圖6～8。KEGG通路富集篩選得到28條信號通路（P＜0.05）見表2，涉及癌癥通路、前列腺癌通路、原發(fā)性免疫缺陷通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、谷胱甘肽代謝等。選擇前20條信號通路，使用Omicshare數(shù)據(jù)庫繪制氣泡圖，見圖9，PPI網(wǎng)絡圖如圖10所示。

圖6 GO富集分析 (生物過程)Fig.6 GO enrichment analysis (biological processes)

圖7 GO富集分析 (細胞組成)Fig.7 GO enrichment analysis (cellular component)

圖8 GO富集分析 (分子功能)Fig.8 GO enrichment analysis (molecular function)

表2 常壓、減壓干燥熊膽粉成分與疾病交集基因KEGG通路Table 2 Intersection gene KEGG pathway between components and disease of normal pressure and reduced pressure dried bear bile powder

3.2.3 網(wǎng)絡構建及分析 成分-靶點網(wǎng)絡由Cytoscape 3.7.0構建得到129個節(jié)點，如圖11所示，其中菱形為對應化學成分、橢圓形為對應基因、飛鏢形為對應通路。結果采用度（degree）、平均最短路徑（ASPL）、中介中心度（BC）和接近中心性（CC）排序確定關鍵節(jié)點，網(wǎng)絡中度值≥中位數(shù)（成分度值中位數(shù)＝12.5，靶標度值中位數(shù)＝5）的成分分別是鳥苷5′-單磷酸水合物、甲基間酪氨酸、左旋甲狀腺素及大黃素8-葡萄糖苷。靶標有二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD）、過氧化氫酶-2（cationic amino acid transporter，CAT）、一氧 化氮合酶（nitric oxide synthase 2，NOS2）、囊泡蛋白（golgi transport 1，GOT1）、過氧化物酶體?；o酶A氧化酶（peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase，ACOX）、甾醇o-?；D移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）、羥酸氧化酶 1（hydroxyacid oxidase 1，HAO1）、Creb結合蛋白（CREB-binding protein，CREBBP）、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）、前蛋白轉化酶枯草桿菌素（proprotein carrier protein，PC）、精氨基琥珀酸合酶（argininosuccinate synthase，ASS）。通路主要有代謝通路和癌癥通路。

3.3 藥效實驗結果

3.3.1 熱板法 對小鼠熱板致痛抑制作用如表3所示，結果表明，與生理鹽水組比較，常壓、減壓干燥熊膽粉均能在60 min顯著提高小鼠痛閾值（P＜0.05、0.01），其中常壓與減壓干燥組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。

3.3.2 醋酸扭體法 對小鼠醋酸扭體致痛抑制作用如表4所示，結果表明，常壓、減壓干燥熊膽粉對小鼠醋酸所致疼痛均有一定的抑制作用，并能延長小鼠發(fā)生扭體反應的潛伏期，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。

圖9 KEGG富集分析前20個通路氣泡圖Fig.9 Bubble chart of top 20 channels of KEGG enrichment analysis

圖10 KEGG前20條通路基因PPI網(wǎng)絡圖Fig.10 PPI network diagram of top 20 pathway genes of KEGG

圖11 常壓、減壓熊膽粉差異成分-靶標-通路網(wǎng)絡圖Fig.11 Differential composition-target-pathway network diagram of normal pressure and reduced pressure dried bear bile powder

表3 小鼠給藥前后平均痛閾值 ( ±s,n = 12)Table 3 Average pain threshold of mice before and after administration ( ±s,n = 12)

表3 小鼠給藥前后平均痛閾值 ( ±s,n = 12)Table 3 Average pain threshold of mice before and after administration ( ±s,n = 12)

與生理鹽水組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與減壓干燥組比較：▲▲P＜0.01，表4同*P < 0.05 **P < 0.01 vs normal saline group; ▲▲P < 0.01 vs vacuum drying group,same as table 4

組別 給藥前平均痛閾值/s 給藥后不同時間平均痛閾值/s 30 min 60 min 90 min 120 min 生理鹽水 19.69±4.47 20.36±13.66 16.29±4.44 17.17±10.78 15.72±6.13 常壓干燥 19.88±6.28 20.44±10.34 22.30±15.09*▲▲ 26.55±18.94▲▲ 18.38±6.59 減壓干燥 19.83±5.39 23.60±14.87 28.68±18.71** 21.67±14.65 20.16±8.19 阿司匹林 18.79±6.60 28.87±19.22 26.04±17.34 22.65±13.90 19.64±5.85

表4 小鼠扭體潛伏期及15 min內平均扭體次數(shù) ( ±s,n = 10)Table 4 Latency period of mouse torsion and average times of torsion in 15 min ( ±s,n = 10)

表4 小鼠扭體潛伏期及15 min內平均扭體次數(shù) ( ±s,n = 10)Table 4 Latency period of mouse torsion and average times of torsion in 15 min ( ±s,n = 10)

組別 小鼠扭體潛伏期/min 15 min內扭體次數(shù) 生理鹽水 4.42±2.51 36.10±21.59 常壓干燥 6.46±2.80 15.80±16.14**▲▲ 減壓干燥 5.93±2.80 22.50±9.81** 阿司匹林 8.80±3.83 8.20±5.65

4 討論

熊膽粉的文獻報道主要活性成分熊去氧膽酸（ursodesoxycholic acid，UCDA）可通過人工合成途徑獲得，一定程度上為其替代品提供了可能性，但有專家表明熊膽粉的功效在于其UCDA與其他多種成分的協(xié)同作用，人工合成UCDA難以完全替代其療效。本研究采用UPLC-MS/MS及高通量篩選的方法代替數(shù)據(jù)庫篩選，分析測定了常壓及減壓干燥熊膽粉上千種化學成分，明確其差異性，高效研究其中活性成分，排除與主治無關或毒性成分。解決了目前僅基于一種或幾種代表性化合物相似性對藥物的藥效進行預測的問題。同時，在網(wǎng)絡藥理學指導下研究各組分對多靶點的活性，預測常壓干燥及減壓干燥差異成分鎮(zhèn)痛作用機制，通過拓撲參數(shù)分析得到常壓干燥及減壓干燥熊膽粉差異成分治療病毒性肝炎、膽囊炎及冠心病3種疾病的關鍵成分有鳥苷5′-單磷酸水合物、甲基間酪氨酸、左旋甲狀腺素及大黃素8-葡萄糖苷，關鍵基因有FLI1、PDE3B、TGM2、IGF1R、ALDOB、PCNA、TLR1、FES、GALK1、RAB31，涉及的關鍵通路有癌癥通路及代謝通路。

文獻研究表明熊膽粉可以顯著調節(jié)丙型肝炎模型樹鼩體內的?；撬峒皝喤；撬岽x、甘油磷脂代謝、色氨酸代謝及初級膽汁酸代謝途徑的擾動，從而治療病毒性肝炎[19]。常壓、減壓熊膽粉8種差異成分中大黃素和益母草堿為質譜實驗中通過數(shù)據(jù)庫檢定出的成分，而目前文獻報道熊膽粉成分大多為膽汁酸類、氨基酸類及微量元素等，未見報道大黃素、益母草堿，有待進一步進行分離鑒定，但文獻研究表明，大黃素[20]具有保護心血管、保肝護肺等生物活性，益母草堿[21]也在文獻報道中體現(xiàn)出有直接的保護心肌細胞損傷作用，這可能為熊膽粉治療病毒性肝炎、膽囊炎及冠心病的藥效物質基礎提供依據(jù)。本實驗結果表明，熊膽的主要藥效物質基礎除以往認識的熊去氧膽酸及牛磺熊去氧膽酸等膽汁酸成分外，還有氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，解決了動物藥成分復雜，藥效物質基礎研究不明確，且功效與成分難以關聯(lián)的問題。

在此基礎上，對網(wǎng)絡藥理學的研究結果進行了進一步的驗證，結果表明常壓干燥及減壓干燥熊膽粉均具有鎮(zhèn)痛作用，且2種干燥方式鎮(zhèn)痛作用具有顯著性差異，因而得出干燥方式使得熊膽粉的化學組成存在一定差異，導致其鎮(zhèn)痛作用差異，且網(wǎng)絡藥理學得出結果中關鍵藥效成分均來源于減壓干燥，而常壓干燥溫度高，時間長，故本實驗建議大生產(chǎn)中采用減壓干燥制備熊膽粉，研究成果為后續(xù)制劑工藝的選擇以及藥效物質基礎研究提供了參考。在分析成分的同時，發(fā)現(xiàn)其個別成分含量也存在差異，這也可能是造成其鎮(zhèn)痛作用差異的原因，后續(xù)有待進一步研究。

研究基于UPLC-QTRAP-MS和網(wǎng)絡藥理學，揭示了熊膽粉鎮(zhèn)痛的多成分、多靶點的協(xié)同抗菌作用特點，較合理地解釋了熊膽粉在鎮(zhèn)痛方面臨床應用的科學性。但本研究僅采用了小鼠熱板法和醋酸扭體模型對熊膽粉鎮(zhèn)痛藥效進行了驗證，熱板法為熱刺激小鼠足部產(chǎn)生痛反應，即舔足反應，以小鼠出現(xiàn)舔足的時間作為痛反應指標；醋酸扭體模型為腹腔注射損傷物質引起受試動物腹痛，表現(xiàn)為“扭體反應”，即腹部內凹、軀干與后肢伸張、臀部高起。而不同動物模型其表現(xiàn)的鎮(zhèn)痛作用機制有一定差異，因而導致實驗結果差異，后續(xù)將進一步研究其作用機制。

志謝：嘉興邁維代謝生物科技有限公司對熊膽粉UPLC-MS/MS檢測及分析數(shù)據(jù)的貢獻。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突