殷文俊，唐建飛，鄭 潔，張 璐，張弘旭，劉霄誼，顏繼忠*，張 慧*

1.浙江工業(yè)大學藥學院 中藥研究所，浙江 杭州 310014

2.杭州朱養(yǎng)心藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310011

中藥配方顆粒是以優(yōu)質的中藥飲片為原料，采用先進工藝，經過提取、濃縮、干燥、制粒等工序精制而成的供醫(yī)生臨床配方使用的單味中藥濃縮顆粒[1]。提取過程是中藥配方顆粒生產的首要環(huán)節(jié)，提取液的質量直接影響后續(xù)生產環(huán)節(jié)和最終產品質量的均一性和穩(wěn)定性[2]。目前，提取工藝操控主要依靠經驗，精確度難以保證。傳統(tǒng)的質量分析方法費時費力且滯后于生產過程，無法及時反饋生產現(xiàn)狀。拉曼光譜是基于拉曼散射效應，對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息[3]。拉曼光譜集光譜分析技術、化學計量學方法和計算機技術為一體，是一種極具發(fā)展前景的高新技術[4]，分析方法具備快速、經濟和無損等特點[5]。與近紅外光譜相比，由于水引起的拉曼信號較弱，因此拉曼光譜更適合于中藥配方顆粒提取過程中的分析[6]。

本研究以甘草配方顆粒提取過程為例，依據《中國藥典》2020年版中將甘草中甘草酸和甘草苷的含量作為檢測指標，針對甘草提取過程中甘草苷和甘草酸含量的變化，利用拉曼光譜檢測速度快的特點，結合液相參考分析，通過對預處理方法和特征提取方法的優(yōu)選，分別建立甘草苷和甘草酸定量校正模型，實現(xiàn)對提取過程中的實時監(jiān)測。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜儀，美國Agilent公司；CPA225D型1/10萬分析天平，德國Sartorius公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，鞏義市予華儀器有限公司；i-Raman Plus BWS 465-785S型便攜式拉曼光譜儀，美國B&W Tek公司。

1.2 材料

甘草飲片建模集5個批次（GC1912029、GC1912030、GC1912032、GC1912034、GC1912036）和外部驗證集3個批次（GC1912038、GC1912039、GC1912040）均在安徽亳州藥材市場購買，產地為新疆。經浙江工業(yè)大學藥學院張慧副教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。對照品甘草苷（批號111610-201607，質量分數為93.1%）、甘草酸（批號110731-201619，質量分數為93.0%），中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；色譜甲醇（批號20085008）、色譜乙腈（批號20085249），美國TEDIA公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

2 方法與結果

2.1 甘草苷和甘草酸HPLC含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；柱溫25 ℃；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長237 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和甘草提取液 (B) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and extract of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (B)

2.1.2 供試品溶液的制備 精密移取甘草提取液1 mL，以13 000 r/min轉速離心5 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 分別取經五氧化二磷干燥器中干燥24 h的甘草苷、甘草酸銨對照品各10 mg，精密稱定，加70%乙醇分別制成含甘草苷20 μg/mL、甘草酸銨0.2 mg/mL的溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得對照品溶液（甘草酸質量濃度＝甘草酸銨質量濃度/1.020 7）。

2.1.4 線性關系考察 根據“2.1.1”項色譜條件，分別進樣7個不同質量濃度的甘草苷和甘草酸混合對照品溶液，分別含甘草苷398.0、159.2、79.6、39.8、19.9、10.0、5.0 μg/mL和甘草酸3 922.8、1 569.1、784.6、392.3、196.1、98.1、49.0 μg/mL，按質量濃度從低到高分別重復進樣3次，以峰面積值為縱坐標（y），甘草苷及甘草酸質量濃度為橫坐標（x），計算線性回歸方程及范圍。結果顯示甘草苷在5.0～398.0 μg/mL線性關系良好，回歸方程為y＝17 747x－12.268，R2＝0.999 9；甘草酸在49.0～3 922.8 μg/mL線性關系良好，回歸方程y＝5 011.8x－84.883，R2＝0.999 9。

2.1.5 精密度考察 取混合對照品溶液1 d內連續(xù)進樣6次，計算甘草苷和甘草酸色譜峰保留時間和峰面積的RSD來考察日內精密度。甘草苷和甘草酸保留時間和峰面積的RSD分別為0.72%和0.31%、0.20%和0.36%。連續(xù)3 d分別進樣當天配制的供試品溶液，每天連續(xù)進樣3針，分別計算甘草苷和甘草酸色譜峰保留時間和峰面積的RSD值來考察日間精密度。甘草提取液中甘草苷和甘草酸保留時間和峰面積的RSD值分別為2.11%和0.61%、0.16%和0.26%。

2.1.6 重復性考察 平行制備6份供試品溶液，連續(xù)進樣分析，計算甘草苷和甘草酸的RSD值來考察重復性。甘草苷和甘草酸質量分數RSD值為0.64%和0.25%。該方法的精密度及重復性均良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進樣分析，通過計算甘草苷和甘草酸峰面積的RSD值來考察供試品溶液的穩(wěn)定性。甘草苷和甘草酸峰面積的RSD為0.32%和0.11%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率考察 精密移取已測定甘草苷和甘草酸質量濃度提取液2.5 mL，分別精密加入質量濃度為15.9 μg/mL的甘草苷對照品溶液0.85 mL，質量濃度為100.1 μg/mL的甘草酸銨對照品溶液1.15 mL定容至5 mL，平行配制6份，搖勻，取1 mL以13 000 r/min離心5 min，過0.22 μm微孔有機濾膜，即得供試品溶液。測定供試品溶液中甘草苷和甘草酸色譜峰面積，計算供試品溶液中甘草苷和甘草酸的質量濃度，再計算加樣回收率。甘草苷的平均加樣回收率為100.88%，RSD為3.09%；甘草酸的平均加樣回收率為100.15%，RSD為2.67%。表明該方法可用于甘草水提取液中甘草苷和甘草酸的含量測定。

2.2 拉曼光譜采集

提取過程在中試提取裝置中進行，模擬甘草配方顆粒生產的提取過程。依據《中藥飲片標準湯劑》和《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》確定甘草配方顆粒的生產工藝參數：添加甘草飲片1 kg到提取罐中，加入7倍水浸泡30 min，加熱提取90 min，收集提取液，并向提取罐中加入6倍水，進行第2次提取，持續(xù)30 min。

在浸泡完成后第1次收集樣品，之后在提取過程中每10分鐘收集1次樣品，最后對2次提取液的混合液收集1次樣品。收集的樣品用于拉曼光譜測量和液相色譜分析。從每批可以收集得到15個樣品，最后從5個不同批次（GC1912029、GC1912030、GC1912032、GC1912034、GC1912036）中共收集75個樣品。

拉曼光譜可通過探頭實現(xiàn)實時采集。光源的激發(fā)波長為785 nm，激光強度為100%（激光功率為300 mW），積分時間為10 s，采集3次取平均值，總采集時間30 s。拉曼位移的光譜范圍為201.33～3100 cm-1（1701個光譜變量），分辨率為1.71 cm-1。

2.3 拉曼光譜定量模型的建立

2.3.1 樣本劃分 通過Kennard-Stone算法以7∶3的比例劃分校正集與預測集。其中校正集52個樣本，預測集23個樣本。樣本集劃分結果見表1，可以看出，預測集的質量濃度包含在校正集的范圍中，校正集和預測集的標準差與總樣本之間無明顯差異（P＜0.05）。

表1 校正集和預測集的樣本劃分結果Table 1 Division results of calibration set and prediction set

2.3.2 光譜的預處理 中藥提取液成分復雜，分析物的光譜信息會出現(xiàn)相互重疊和掩蓋現(xiàn)象，光譜采集過程中存在因儀器或環(huán)境而引入的噪聲，且存在熒光背景和基線漂移現(xiàn)象[7]。需要使用光譜預處理方法，提取有用信息，去除儀器噪聲，減少熒光背景干擾[8]。本研究中通過比較經Savitzky-Golay（SG）平滑、一階導數、二階導數、標準正態(tài)變換（standard normal variate transformation，SNV）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）等預處理的拉曼光譜數據和原始光譜數據的偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）定量模型參數，篩選出最適合甘草苷和甘草酸定量模型的預處理方法。5個不同批次提取液拉曼光譜原始光譜如圖2-a所示，隨著提取時間的增加，提取液拉曼光譜存在基線漂移現(xiàn)象。這可能是提取過程中提取液中指標成分含量的持續(xù)累積，使得熒光背景的增加所致[9]。

圖2 甘草提取過程拉曼光譜的原始光譜 (a)、SNV光譜 (b)、SG13點平滑光譜 (c)Fig.2 Raw spectra (a),spectra preprocessed with SNV (b),and spectra preprocessed with SG (window size 13) (c) of Raman spectra of extraction process of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

光譜經SG平滑、一階導數、二階導數、MSC、SNV預處理的拉曼光譜數據和對應的甘草苷和甘草酸液相數據作為輸入變量，得到不同預處理方法的PLSR定量模型與原始光譜比較結果見表2。從表2中可以看出，在提取液中甘草苷PLSR定量校 正模型中，SG-13點平滑、SG-17點平滑、一階導數和SNV預處理后，定量模型均較原始光譜模型性能有所提升，其中SNV預處理方法，對模型性能參數提升幅度最大，光譜圖如圖2-b所示，預測集決定系數為0.861 6，誤差均方根為0.033 8，選用作為甘草苷定量校正模型的預處理方法；在提取液中甘草酸PLSR定量校正模型中，除MSC方法會對模型造成負面影響以外，其他預處理方法均會對模型性能有一定程度的提升，其中SG-13點平滑預處理后，光譜圖如圖2-c所示，對提取液中甘草酸含量預測效果最好，將其作為甘草酸定量校正模型的預處理方法。

2.3.3 光譜特征波段的篩選 原始光譜經過預處理后，一些相關因素帶來的干擾信息能夠得到消除，然而光譜中依然存在大量與指標成分的含量關聯(lián)性較差的信息[10]，數據的冗雜不僅會造成模型運算時間增加，還會影響模型的預測結果。因此在構建定量模型之前，采用適當的方法進行特征波長的篩選，降低數據維度以實現(xiàn)模型快速、精準定量[11]。從特征波段的篩選和特征波長點的篩選2個方面入手：針對特征波長點的篩選主要采用競爭性自適應重加權算法（competitive adaptive reweighted sampling，CARS）、連續(xù)投影算法（successive projection algorithm，SPA）、蒙特卡羅無信息變量消除（monte carlo elimination of uninformative variables，MC-UVE）；針對特征波段的篩選主要采用聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法（synergy interval partial least squares，siPLS）。

（1）CARS法：CARS法以迭代和競爭的方式進行蒙特卡洛采樣，選擇固定比例的變量子集，建立PLSR定量校正模型，采用指數遞減函數和自適應加權采樣技術選擇較大權重變量。最后計算RMSECV值以評估子集選擇出最關鍵變量[12]。在甘草酸校正模型中設置主成分個數為7，算法進化次數為50次。CARS運行結果如圖3所示，圖3-a為篩選過程中變量個數的變化趨勢，變量個數隨采樣次數的增加而減少；圖3-b為交叉驗證誤差均方根（root mean square error of cross-validation，RMSECV）的變化趨勢，29次采樣之前隨著運行次數的增加而減少，29次采樣之后隨著運行次數的增加而升高，表明可能剔除了與水提取液中甘草酸含量相關的變量；圖3-c為回歸系數的變化路徑，圖中“*”表示最小RMSECV所對應的采樣次數，圖中各線表示不同采樣次數回歸系數變化路徑。根據交叉驗證均方差值最小原則，由圖3-a可知特征波段變量個數為36。在甘草苷校正模型中主成分個數為11，26次采樣后得到最小RMSECV，對應的最優(yōu)波長變量為54。

表2 不同預處理方法對PLSR定量模型性能的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods on performance of PLSR models

圖3 甘草酸定量校正模型CARS運行結果Fig.3 Results of CARS on quantitative calibration model of glycyrrhizic acid

（2）SPA法：SPA法通過矢量空間共線性最小化篩選出最小的冗余信息變量組，最大程度地減少建模變量的數量從而建立簡化高效的模型[13]。在甘草酸校正模型中如圖4-a所示，設定選定波長數在1～25，當模型的變量數為3時，RMSECV最小，表明此時篩選得到最高效模型，得到的特征波段在全波段中的分布見圖4-b。在甘草苷校正模型中選定波長數在1～25，當模型的變量數為4時得到最優(yōu)模型。

圖4 甘草酸定量校正模型SPA運行結果Fig.4 Results of SPA on quantitative calibration model of glycyrrhizic acid

（3）MC-UVE法：MC-UVE算法通過實施蒙特 卡洛隨機采樣，對原無信息變量消除算法進行改進。其使用校正集的隨機樣本對大量模型進行校準，通過模型相應系數來評估每個變量的可靠程度，可靠性性低于臨界值的變量被識別為無信息變量進行剔除[14]。在甘草酸校正模型中設置MC-UVE運行次數為1000次，主成分數15，以變量可靠度指數（reliability index，RI）作為篩選依據，將RI值按降序排列，運行結果如圖5所示，確定最佳變量數為50。在甘草苷校正模型中MC-UVE運行次數為500次，主成分數15，最佳變量數為18。

圖5 甘草酸定量校正模型MC-UVE運行結果Fig.5 Results of MC-UVE on quantitative calibration model of glycyrrhizic acid

（4）siPLS法：siPLS算法是將整個頻譜平均分為n個間隔，并對子間隔組合計算所有可能的PLS模型。選擇具有最低RMSECV值的子間隔組合作為最佳變量[15]。在甘草酸校正模型中通過siPLS如圖6-a所示，將全譜分為10個子區(qū)間，聯(lián)合其中4個子區(qū)間［1，4，5，8］，當主成分數為12時模型性能最佳，RMSECV為0.041 3，此時選擇波長數為681。在甘草苷校正模型中通過siPLS算法，將全譜分為13個子區(qū)間，聯(lián)合其中4個子區(qū)間［1，2，5，7］，當主成分數為4時模型性能最佳，RMSECV為0.029 7，此時選擇波長數為524。

2.3.4 定量模型的建立 采用PLSR、多層感知機（multi-layer perceptron，MLP）和貝葉斯嶺回歸（bayesian ridge regression，BRR）分別建立甘草水提取液樣品的甘草苷和甘草酸拉曼光譜定量模型。定量校正模型驗證指標包括：交叉驗證集決定系數（coefficient of determination of cross-validation，R2cv）和RMSECV作為模型優(yōu)化的參考指標，R2c、RMSEC、R2p和RMSEP作為模型性能的評價指標。其中R2p越接近1，RMSEP越小，表明所對應模型性能更好。

圖6 甘草酸定量校正模型siPLS運行結果Fig.6 Results of siPLS on quantitative calibration model of glycyrrhizic acid

采用多種特征波段篩選方法所建立的PLSR、MLP和BRR的甘草苷和甘草酸定量校正模型性能參數如表3所示。從表3中可以看出，通過特征波段的篩選能夠在確保模型性能的基礎上，大幅減少對拉曼光譜變量的使用，篩選變量后基本可以達到甚至超過全光譜變量所構建模型的性能。這表明利用特征波段提取方法能夠排除冗余信息，找到與指標成分密切相關的光譜變量，從而大幅減少計算量，顯著提升模型運行速度。其中，通過SPA篩選的甘草苷和甘草酸模型分別只需要4個和3個光譜變量即可達到全光譜變量模型水平，通過CARS篩選建立的甘草苷和甘草酸模型均為各模型中最佳結果。3種不同定量模型之間比較發(fā)現(xiàn)，除MLP模型外，PLSR和BRR建立的模型均能取得不錯的效果，其中BRR在不同篩選條件下能夠得到最優(yōu)結果。

CARS篩選后建立的BRR甘草苷和甘草酸定量模型具有全局最優(yōu)性能，如圖7-a和圖7-b分別為該模型甘草苷和甘草酸含量預測值與參考真實值的散點圖，甘草苷和甘草酸含量液相參考值與拉曼光譜的預測值相關性較高，甘草苷和甘草酸模型R2p分別為0.987 6和0.990 2，RMSEP分別為0.010 4和0.027 6，所對應的模型性能較高。

2.4 甘草苷和甘草酸含量實時監(jiān)測

將已訓練校正好的甘草苷CARS-BRR模型和甘草酸CARS-BRR模型分別輸出，利用便攜式拉 曼光譜儀按照“2.2”項中方法對新的3批次（GC1912038、GC1912039、GC1912040）甘草提取過程進行實時監(jiān)測，每批次甘草可采集得到15個樣本，3批次共可采集得到45個樣本。圖8為甘草提取過程中甘草苷CARS-BRR模型拉曼光譜預測值與實測值的趨勢對比圖，圖9為甘草酸CARS-BRR模型拉曼光譜預測值與實測值的趨勢對比圖。

表3 不同變量篩選方法建模結果比較Table 3 Comparison on modeling results under different variables selection methods

圖7 甘草苷 (a) 和甘草酸 (b) 的BRR模型預測值與參考值的相關圖Fig.7 Correlation between predicted value and reference value of BRR quantitative models of liquiritin (a) and glycyrrhizic acid (b)

由圖8、9可知，在3批甘草提取實時監(jiān)測過程中，拉曼光譜甘草苷和甘草酸預測值與實測值結果能夠很好地重疊在一起，甘草苷模型R2p為0.891 0，甘草酸模型R2p為0.969 2。上述結果顯示，所建立的模型能夠很好地運用到實時監(jiān)測甘草提取過程中甘草苷和甘草酸含量。

2.5 數據處理

本研究使用的光譜采集處理工具為美國B&W Tek公司BWSpec4軟件，采用Spyder（Python 3.7）進行光譜預處理和定量模型的構建等數據處理分析操作，采用Matlab 2017a軟件進行特征波段的篩選操作。

圖8 甘草苷CARS-BRR模型拉曼光譜預測值與實測值的趨勢對比圖Fig.8 Comparison of Raman spectra prediction values with measured values of CARS-BRR quantitative model of liquiritin

圖9 甘草酸CARS-BRR模型拉曼光譜預測值與實測值的趨勢對比圖Fig.9 Comparison of Raman spectra prediction values with measured values of CARS-BRR quantitative model of glycyrrhizic acid

3 討論

拉曼光譜應用在中藥產品生產過程的質量控制中具有制樣簡易、準備迅速、非破壞和綠色環(huán)保等優(yōu)點，可利于穩(wěn)定和提高中藥產品質量，從而促進中藥生產的自動化進程，推動中藥生產邁進智能化時代[16-17]。本研究針對甘草配方顆粒提取過程中甘草苷和甘草酸含量變化，利用便攜式拉曼光譜儀測樣方便、檢測時間短等特點[18-19]，通過建立甘草苷和甘草酸定量校正模型，實現(xiàn)對提取過程中實時監(jiān)測。通過比較5種預處理方法和4種變量篩選方法，分別建立了提取過程中甘草苷和甘草酸含量預測模型。各項評價指標表明，所建立的甘草苷和甘草酸定量模型可以剔除干擾樣本，有效地篩選出相關變量，預測效果較好，應用于實際甘草配方顆粒提取生產過程中，能準確監(jiān)控提取過程甘草苷和甘草酸含量變化規(guī)律，指導提取終點判定，為工業(yè)化實時檢測方法的開發(fā)提供技術保障。

在后續(xù)研究中，可通過不斷擴充校正集樣本數量，優(yōu)化拉曼光譜采集過程和模型構建過程，進一步提高模型的預測性能。同時工業(yè)上應用拉曼光譜過程中[20]，熒光現(xiàn)象對拉曼光譜的背景干擾和基線漂移現(xiàn)象仍值得深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突