付麗娜，趙 寧，李偉澤，韓文霞，李 健，楊 婷，楊黎彬

西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021

苦參堿（matrine）是來源于豆科槐屬植物苦參Sophora flavescensAir.的一種生物堿類天然藥物， 具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗心律失常、抑制中樞神經(jīng)和調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[1-7]。目前在臨床上廣泛應(yīng)用的苦參堿制劑主要有注射劑、膠囊劑、片劑和栓劑等[8]。但是，傳統(tǒng)苦參堿制劑普遍存在半衰期短、需多次給藥，易造成肝腎聚集中毒等問題；并且由于苦參堿的苦味強(qiáng)烈持久，患者用藥依從性差[9-10]。這些限制了苦參堿口服制劑與注射制劑的廣泛應(yīng)用，因此，開發(fā)苦參堿的外用緩釋給藥系統(tǒng)具有重要意義。固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是粒徑為納米級別的一種新型實(shí)體骨架的微粒給藥系統(tǒng)，可作為大分子、小分子藥物的載體，具有良好的促進(jìn)藥物透皮吸收作用和皮膚貯庫效應(yīng)，能夠增加藥物的穩(wěn)定性，可提高藥物對皮膚黏膜的穿透性而提高其生物利用度，且藥物泄露問題較少，可通過透皮、口服、注射與肺部等多途徑給藥，同時(shí)其成本低與利于大規(guī)模的生產(chǎn)，是微乳、脂質(zhì)體、聚合物納米粒等的替代品[11-13]，因此SLN具有良好的應(yīng)用前景。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)研究了以微乳-低溫固化法制備苦參堿固體脂質(zhì)納米粒（matrine solid lipid nanoparticles，MA-SLN）的成型工藝及其相關(guān)藥劑學(xué)性能，并通過體外透皮給藥考察了MA-SLN透皮給藥的釋藥行為，從而為苦參堿提供了一種基于納米微粒的新型外用緩釋給藥系統(tǒng)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Verios 460掃描電子顯微鏡（SEM），美國FEI公司；JEM-2100F透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；X’Pert PRO X-射線衍射儀（XRD），荷蘭帕納科公司；ZEN-3600激光粒度儀，英國馬爾文公司；Quintix224-1 CN Sartorius分析天平，賽多斯科學(xué)儀器北京有限公司；Stare系統(tǒng)DSC差式掃描量熱儀（DSC），瑞士梅特勒-托利多公司；Allegra 64R Centrifuge離心機(jī)，美國Beckman公司。

1.2 藥材與試劑

苦參堿對照品，中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)110805-201803；苦參堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號XC20190410，西安小草植物科技有限責(zé)任公司；大豆卵磷脂，上海太偉藥業(yè)有限公司；硫酸魚精蛋白，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，Sigma公司；單硬脂酸甘油酯，南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司；普朗尼克F-68，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，批號20191003，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部。所有動物實(shí)驗(yàn)遵循陜西省有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 MA-SLN的制備

采用微乳-低溫固化法[14-15]制備MA-SLN。稱取苦參堿50 mg，適量單硬脂酸甘油脂和大豆卵磷脂，并加入5 mL無水乙醇作為油相；另取0.2 g普朗尼克F-68，加入一定量純化水作為水相；油相與水相分別置于65 ℃水浴中，使溶解；并于一定轉(zhuǎn)速條件下將水相緩慢加入油相，攪拌乳化，再高速勻質(zhì)4 min后將乳化體系分散到冷水中，300 r/min條件下攪拌固化20 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得MA-SLN。同法不加苦參堿，制備空白脂質(zhì)納米粒（blank solid lipid nanoparticles，B-SLN）。

2.2 苦參堿檢測方法的建立

2.2.1 供試品溶液的制備 取一定量MA-SLN于2 mL的離心管中，加入同體積10 μg/mL魚精蛋白溶液，靜置3 min，于10 ℃、13 000 r/min條件下離心60 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，即得。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（85∶15）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測波長220 nm。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取苦參堿對照品，加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度分別為20、30、60、100、200、400 μg/mL的對照品溶液，分別標(biāo)為1～6號，取上述各對照品溶液過0.22 μm微孔濾膜，取濾液20 μL用HPLC按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為Y＝6.649 2X＋100.99，r2＝0.999 8，表明苦參堿在20～400 μg/mL時(shí)質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.4 專屬性考察 取苦參堿對照品溶液，B-SLN和MA-SLN，其中B-SLN和MA-SLN按照2.2.1項(xiàng)下方法處理，并按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該色譜條件下，色譜峰分離度好，同時(shí)峰形穩(wěn)定，無干擾。

圖1 苦參堿對照品 (A)、B-SLN (B) 和MA-SLN (C) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of matrine reference substance (A),B-SLN (B) and MA-SLN (C)

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取1、3、6號對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測定峰面積，每天0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣3 d，測定峰面積，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果其日間和日內(nèi)精密度RSD分別為1.63%和1.87%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次MA-SLN 6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下處理后，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算苦參堿質(zhì)量濃度，RSD值為1.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一批次供試品溶液室溫下放置，分別于0、3、6、12、24、48 h取20 μL注入HPLC測定，苦參堿峰面積的RSD為0.92%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取9份B-SLN 0.5 mL，置于2 mL離心管內(nèi)，分別加入80、100、120 μg/mL 苦參堿對照品溶液0.5 mL，再按2.2.1項(xiàng)下方法加10 μg/mL魚精蛋白溶液1 mL，靜置3 min，于10 ℃、13 000 r/min條件下離心60 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，測得平均加樣回收率為99.77%，RSD為1.87%。

2.3 MA-SLN處方篩選

2.3.1 MA-SLN包封率測定 采用魚精蛋白凝聚法測定包封率[16]，精密吸取MA-SLN樣品0.8 mL，置于2 mL離心管，加10 μg/mL魚精蛋白溶液0.8 mL，混勻，靜置3 min，于10 ℃、13 000 r/min條件下離心60 min，取上清液1 mL置于10 mL量瓶中，定容，過0.22 μm微孔濾膜，取20 μL按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測定苦參堿的量，計(jì)算包封率。

2.3.2 粒徑和ζ電位的測定 取MA-SLN用蒸餾水稀釋至10倍，使溶液呈現(xiàn)半透明乳光色，用激光粒度儀測定其粒徑與ζ電位。

2.3.3 評價(jià)指標(biāo)的確定 包封率、粒徑和ζ電位為SLN質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)以包封率、粒徑和ζ電位為MA-SLN處方篩選的評價(jià)指標(biāo)。其中，包封率是納米粒質(zhì)量控制的一個(gè)重要的因素，也是提高藥物治療效果，減少藥物劑量降低不良反應(yīng)的關(guān)鍵因素。因此，設(shè)定包封率在0～100%內(nèi)，每增大10%，加1分，滿分10分，占比60%；SLN的粒徑一般為50～1000 nm，粒徑越小，納米粒的透皮吸收效果越好，根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中不同工藝所測MA-SLN的粒徑范圍，設(shè)定以490 nm為基數(shù)，減小40 nm，加1分，滿分10分，占比20%；ζ電位在一定程度上反應(yīng)粒子的荷電情況，對維持體系的穩(wěn)定性有很大影響，當(dāng)微粒表面電位的絕對值大于30 mV時(shí)，微粒間由于存在較大的靜電斥力而有利于制劑穩(wěn)定性的提高并使粒徑保持均勻，因本實(shí)驗(yàn)所制備的MA-SLN帶負(fù)電荷，因此設(shè)定，ζ電位在-60～0 mV，比0 mV小6 mV，加1分，滿分10分，占比20%。將評分進(jìn)行綜合加權(quán)處理，并以處理后的綜合得分為評價(jià)指標(biāo)。

2.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)前期單因素中各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選擇單硬脂酸甘油酯（A）、卵磷脂（B）的用量和油水兩相比例（C）進(jìn)行處方優(yōu)化考察，以綜合得分為評價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素水平、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1，方差分析見表2。由表1、2可知，各因素對MA-SLN包封率和粒徑的綜合的影響大小依次為A＞B＞C，單硬脂酸甘油酯（A）和卵磷脂（B）對MA-SLN包封率和粒徑有顯著影響，根據(jù)正交表直觀分析，選擇最佳工藝條件為A2B3C2，即MA-SLN的最佳制備處方為苦參堿50 mg、單硬脂酸甘油酯0.15 g、大豆磷脂0.3 g、普朗尼克F-68 0.2 g、油相5 mL和水相體積10 mL，制得的MA-SLN的包封率較高、粒徑小、ζ電位合適。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 ( ±s,n = 3)Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test ( ±s,n = 3)

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 ( ±s,n = 3)Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test ( ±s,n = 3)

試驗(yàn)號 A/g B/g C D (誤差) 包封率/% 包封率得分 粒徑/nm 粒徑得分 ζ電位/mV ζ電位得分 綜合得分1 0.10 (1) 0.10 (1) 1∶1 (1) (1) 52.07±1.36 5.00 361.23±8.49 4.00 -29.97±1.87 5.33 4.87 2 0.10 (1) 0.20 (2) 1∶2 (2) (2) 52.40±1.23 5.00 210.23±6.92 7.67 -39.17±1.17 7.00 5.93 3 0.10 (1) 0.30 (3) 1∶3 (3) (3) 51.93±1.42 5.00 219.70±9.83 7.33 -40.83±1.83 7.33 5.93 4 0.15 (2) 0.10 (1) 1∶2 (2) (3) 58.60±4.07 5.33 207.97±9.85 7.67 -37.67±1.12 7.00 6.13 5 0.15 (2) 0.20 (2) 1∶3 (3) (1) 58.70±3.58 5.67 198.33±8.85 8.00 -39.60±2.29 7.33 6.47 6 0.15 (2) 0.30 (3) 1∶1 (1) (2) 58.50±3.12 5.67 193.67±7.09 8.00 -38.73±1.65 7.00 6.40 7 0.20 (3) 0.10 (1) 1∶3 (3) (2) 43.67±2.43 4.00 319.87±7.01 5.00 -30.77±1.69 5.67 4.53 8 0.20 (3) 0.20 (2) 1∶1 (1) (3) 49.87±2.12 4.67 256.63±8.95 6.33 -33.20±1.90 6.00 5.22 9 0.20 (3) 0.30 (3) 1∶2 (2) (1) 59.23±2.21 5.67 234.43±9.40 7.00 -36.46±1.78 6.33 6.07 K1 16.73 15.53 16.49 17.41 K2 19.00 17.62 18.13 16.86 K3 15.82 18.40 16.93 17.28 R 3.18 2.87 1.64 0.55 優(yōu)選方案 A2 B3 C2

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.4 MA-SLN制備工藝優(yōu)化

工藝優(yōu)化的評價(jià)指標(biāo)和評判方法同“2.3.3”項(xiàng)。研究表明，乳化體系的形成過程中需要充分的乳化速度和乳化時(shí)間才能保證乳化劑的效用[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)用單因素實(shí)驗(yàn)法考察了不同攪拌時(shí)間、攪拌速度與不同稀釋相體積對MA-SLN包封率、粒徑和ζ電位的影響，按照“2.3.3”項(xiàng)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行加權(quán)處理得出綜合評分，最后根據(jù)綜合評分篩選出最優(yōu)成型工藝。

2.4.1 不同攪拌速度對MA-SLN包封率、粒徑、ζ電位的影響 按照“2.3.4”項(xiàng)下確定的最優(yōu)處方，在攪拌時(shí)間30 min，分散相體積30 mL的條件下，考察不同攪拌速度的MA-SLN綜合評分的影響。結(jié)果見表3。

2.4.2 不同攪拌時(shí)間對MA-SLN包封率、粒徑、ζ電位的影響 按照“2.3.4”項(xiàng)下確定的最優(yōu)處方，在攪拌速度1000 r/min，分散相體積30 mL的條件下，考察不同攪拌時(shí)間的MA-SLN的綜合評分的影響。結(jié)果見表4。

表3 攪拌速度對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of stirring speed on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

表3 攪拌速度對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of stirring speed on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

攪拌速度/(r·min-1) 包封率/% 包封率評分 粒徑/nm 粒徑評分 ζ電位/mV ζ電位評分 綜合評分 600 43.77±1.30 4.00 387.70±5.22 3.00 -18.07±1.42 3.33 3.67 800 51.67±0.96 5.00 361.23±7.49 4.00 -29.33±0.93 5.33 4.87 1000 56.77±3.65 5.33 215.47±5.76 7.33 -41.20±1.28 7.33 6.13 1200 53.83±1.27 5.00 208.10±4.83 7.67 -42.40±0.95 7.67 6.07 1400 51.83±1.65 5.00 211.60±6.74 7.67 -38.17±1.56 7.00 5.93

2.4.3 不同分散相體積對MA-SLN包封率、粒徑、ζ電位的影響 按照“2.3.4”項(xiàng)下確定的最優(yōu)處方，在攪拌速度1000 r/min，攪拌時(shí)間30 min的條件下，考察不同分散相體積的MA-SLN的綜合評分的影響。結(jié)果見表5。

表4 攪拌時(shí)間對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of stirring time on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

表4 攪拌時(shí)間對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of stirring time on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

攪拌時(shí)間/min 包封率/% 包封率評分 粒徑/nm 粒徑評分 ζ電位/mV ζ電位評分 綜合評分 10 26.13±0.67 2.00 396.53±6.16 3.00 -16.95±2.33 3.33 2.47 20 37.63±1.71 3.00 338.07±9.12 4.33 -29.60±2.05 5.33 3.73 30 58.27±4.85 5.33 213.27±8.89 7.67 -42.27±1.50 7.67 6.27 40 49.83±2.27 4.67 258.17±10.40 6.33 -31.80±2.01 5.67 5.20 50 44.86±1.70 4.00 343.53±5.03 4.00 -25.80±2.40 4.67 4.13

表5 分散相體積對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of dispersed phase volume on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

表5 分散相體積對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of dispersed phase volume on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

分散相體積/mL 包封率/% 包封率評分 粒徑/nm 粒徑評分 ζ電位/mV ζ電位評分 綜合評分 15 25.03±1.50 2.00 418.07±9.01 2.33 -16.27±1.29 3.00 2.27 25 37.23±1.79 3.00 327.57±8.92 4.67 -28.53±2.06 5.33 3.80 35 51.26±2.46 4.67 248.60±7.13 6.67 -37.83±1.47 7.00 5.53 45 57.33±4.67 5.33 197.20±4.35 8.00 -37.23±1.46 6.67 6.13 55 51.67±0.97 5.00 274.53±7.69 6.00 -34.90±1.48 6.33 5.47

由表4、5可知，當(dāng)攪拌速度低于800 r/min時(shí)，由于無法為乳化體系的形成提供足夠的能量因而MA-SLN成型與性能不佳，而攪拌速度過高（大于1000 r/min）會由于速度過大而增加微粒的動能、增大碰撞合并機(jī)率而影響微粒制劑的成型。乳化體系的形成是油相由整體逐漸變?yōu)槲⒘５臐u進(jìn)過程，因此需要一定的時(shí)間，當(dāng)攪拌時(shí)間低于30 min時(shí)導(dǎo)致乳化不足而粒徑過大，且微粒的形狀不規(guī)整；而攪拌時(shí)間過長，高于30 min則由于增大微粒碰撞、合并機(jī)率而影響成型與粒徑。研究表明，稀釋相體積對MA-SLN的粒徑影響較大，其原因是當(dāng)稀釋相體積過小時(shí)，單位體積內(nèi)微粒的濃度增大，因此增大了微粒的碰撞機(jī)率增加聚集程度而使粒徑變大；稀釋相體積過大時(shí)，如大于45 mL時(shí)，則由于微粒稀釋程度較大，得到的分散液固體含量過低，增加藥物泄露且后續(xù)處理困難。因此，綜合分析得到最佳制備工藝為攪拌速度為1000 r/min、攪拌時(shí)間為30 min與稀釋相相體積為45 mL。

2.5 MA-SLN制備工藝和處方的確定

按照上述處方和工藝考察結(jié)果制備MA-SLN。稱取苦參堿50 mg，單硬脂酸甘油脂0.15 g和大豆卵磷脂0.3 g，并加入5 mL無水乙醇作為油相；另取0.2 g普朗尼克F-68，加入純化水10 mL作為水相；油相與水相分別置于65 ℃水浴中，使溶解；并于1000 r/min條件下將水相緩慢加入油相，攪拌乳化30 min，高速勻質(zhì)4 min后將乳化體系分散到45 mL冷水中，300 r/min條件下攪拌固化20 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得，于4 ℃存放，備用。

制備6批MA-SLN，其外觀均勻一致無差異，MA-SLN粒徑密度分布圖和電勢分布圖見圖2。測得其包封率為（56.12±0.82）%；平均粒徑為 （196.31±6.26）nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.184±0.020；ζ電位為（-37.18±2.36）mV。表明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的制劑處方與制備工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性高。研究表明[18]，當(dāng)微粒表面電位的絕對值大于30 mV時(shí)，微粒間由于存在較大的靜電斥力而有利于制劑穩(wěn)定性的提高并使粒徑保持均勻，因此，MA-SLN具有較高的穩(wěn)定性。

2.6 MA-SLN藥劑學(xué)性質(zhì)考察

2.6.1 MA-SLN形態(tài)觀察 將MA-SLN樣品適量，按照SEM和TEM的常規(guī)操作處理后，觀察其外觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖3所示，MA-SLN為規(guī)整平滑的均勻?qū)嶓w骨架球狀結(jié)構(gòu)，球體表面無苦參堿的規(guī)則晶體析出、內(nèi)部顯示均勻一致，表明苦參堿與SLN的骨架材料相容性良好而使苦參堿在MA-SLN呈現(xiàn)均勻分布，這種分布行為利于提高藥物的穩(wěn)定性和載藥量。

圖2 MA-SLN粒徑密度分布 (A) 和電勢分布 (B)Fig.2 Particle size distribution by intensity (A) and ζ potential distribution (B)

圖3 MA-SLN掃描電鏡圖 (×2400,A) 和透射電鏡圖 (×6000,B)Fig.3 SEM image (× 2400,A) and TEM images (× 6000,B) of MA-SLN

2.6.2 苦參堿包裹情況考察

（1）DSC掃描：分別取適量MA-SLN、B-SLN、苦參堿粉末、苦參堿與SLN物理混合物用DSC掃描檢測苦參堿及載體特征峰的變化情況。DSC掃描條件為99.99% N2，升溫速度20 ℃/min，溫度范圍0～280 ℃，結(jié)果如圖4。由圖4可知，苦參堿在70～78 ℃出現(xiàn)特征峰，B-SLN在55 ℃左右出現(xiàn)特征峰，物理混合物苦參堿＋SLN分別出現(xiàn)了SLN和苦參堿的特征峰；而將苦參堿制成MA-SLN后，苦參堿的特征峰消失，僅顯示SLN的特征峰。

圖4 MA-SLN的DSC掃描分析圖Fig.4 Analysis diagram of MA-SLN by DSC scan

（2）XRD分析：用XRD測定苦參堿粉末、MA-SLN和B-SLN。樣品在45 kV、40 mA的Cu-Kα輻射下進(jìn)行分析，測試范圍5°～90°，掃描速率為 2°/min。掃描結(jié)果見圖5。由圖5可知，純藥物苦參堿的XRD譜圖在6°～25°掃描角度之間顯示出許多尖峰，表明苦參堿具有高結(jié)晶性，而MA-SLN則沒有了藥物苦參堿的主峰，結(jié)晶度降低；與B-SLN相比，MA-SLN的主峰沒有移動，整體強(qiáng)度變化不大，在7°掃描角度處強(qiáng)度略有提高，這可能是由于脂質(zhì)納米粒中苦參堿的加入，導(dǎo)致了包載苦參堿的SLN結(jié)晶度發(fā)生變化。結(jié)合DSC掃描結(jié)果推斷，苦參堿可被充分包裹到SLN中的實(shí)體骨架中，且苦參堿與SLN骨架材料相容性良好。

2.7 MA-SLN體外釋藥特點(diǎn)

圖5 MA-SLN的XRD掃描分析圖Fig.5 Analysis diagram of MA-SLN by XRD

采用透析法考察MA-SLN的釋藥特點(diǎn)，精密稱取MA-SLN 2 mL，放入截留相對分子質(zhì)量為2500的透析袋中，扎緊，置于50 mL的生理鹽水溶液中，調(diào)整介質(zhì)37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min進(jìn)行體外透析試驗(yàn)，取樣時(shí)間為1、2、3、4、6、9、12、18、24 h，取樣量為3 mL，并補(bǔ)充同溫等量的生理鹽水，同法以相同質(zhì)量濃度的苦參堿水溶液作為對照，計(jì)算累積釋放率。結(jié)果見圖6。由圖6可知，苦參堿水溶液中苦參堿可快速釋藥，并在6 h后達(dá)基本釋放完藥物到平衡。而MA-SLN較苦參堿水溶液體外透析釋藥過程緩慢，在24 h后才逐漸達(dá)到平衡，因此MA-SLN體外釋藥具有緩釋效果。

圖6 苦參堿水溶液和MA-SLN體外釋放曲線 ( ±s,n = 3)Fig.6 In vitro release of WMA and MA-SLN ( ±s,n = 3)

2.8 MA-SLN經(jīng)皮滲透研究

取昆明種小鼠，脫頸處死后剝離皮膚，剪凈皮膚上的毛，小心剔除皮下黏膜膜和脂肪組織，用生理鹽水沖洗干凈后切成小塊（3.0 cm×3.0 cm），-20 ℃冷凍保存，1周內(nèi)使用。

將角質(zhì)層向上固定于立式雙室擴(kuò)散池上，在接收池加入7 mL生理鹽水作為接收液，保持恒溫在（32.0±0.5）℃，攪拌速度300 r/min；在供給池中分別加入相同苦參堿量的MA-SLN和苦參堿水溶液。分別在1、2、3、4、6、9、12、18、24 h取接收液0.5 mL，并補(bǔ)加0.5 mL新鮮接收液，將取得樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜。按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測定苦參堿含量，按公式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)苦參堿累積透過量（ΔM）[19]。

C為接收液中的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL），V為接收液的體積（mL），Ae為擴(kuò)散池的有效面積（cm2）

圖7 苦參堿累積透過量 ( ±s,n = 3)Fig.7 Cumulative permeation of matrine ( ±s,n = 3)

結(jié)果如圖7所示。由圖可知MA-SLN較苦參堿經(jīng)皮滲透釋藥快，1～9 h時(shí)ΔM達(dá)到500 μg/cm2左右，是苦參堿水溶液的3.93倍（t檢驗(yàn)，P＜0.05），表明MA-SLN能夠顯著促進(jìn)苦參堿的經(jīng)皮滲透，其原因可能是MA-SLN以其較小的粒徑（197 nm）和 親脂性而增強(qiáng)了苦參堿的經(jīng)皮滲透性，同時(shí)，藥物在MA-SLN微粒中以高濃度的分子狀態(tài)分布增大了其熱力學(xué)活度，進(jìn)一步利于苦參堿的經(jīng)皮滲透吸收。9～24 h，MA-SLN可以持續(xù)穩(wěn)定釋放藥物，以維持藥物的經(jīng)皮滲透吸收，表明MA-SLN具有良好的緩釋行為；而水溶液中藥物雖然也隨時(shí)間延長而ΔM緩慢增加，但是增加不明顯（t檢查，P＞0.05），表明苦參堿在苦參堿水溶液中難于經(jīng)皮滲透吸收。結(jié)果表明MA-SLN不僅可以提高藥物經(jīng)皮滲透吸收的效率，還具有良好的緩釋行為。

3 討論

苦參堿具有多種藥理作用，是一種具有巨大臨床應(yīng)用價(jià)值的天然藥物。但是，由于苦參堿存在強(qiáng)烈持久的苦味且對胃腸道黏膜存在刺激，加之其生物半衰期較短，血漿清除快，臨床為保證療效需大劑量給藥，進(jìn)而增加不良反應(yīng)發(fā)生頻次，這些限制了苦參堿口服給藥與注射給藥的廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)研究了以微乳-低溫固化法制備MA- SLN，并對其藥劑學(xué)性質(zhì)與透皮給藥行為進(jìn)行了考察。研究發(fā)現(xiàn)，采用微乳-低溫固化法制備MA-SLN，其工藝簡單、周期短、成本低與可控性高，因此易于產(chǎn)業(yè)化放大。

實(shí)驗(yàn)中，為了準(zhǔn)確測定苦參堿固體脂質(zhì)納米粒的包封率，必須將納米粒和游離的藥物有效分離。常用葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法和超速離心法等分離方法。其中透析法過程緩慢，藥物容易泄露；實(shí)驗(yàn)過程中也采用過超速離心法，但實(shí)驗(yàn)不易產(chǎn)生沉淀，且結(jié)果不穩(wěn)定；而魚精蛋白凝聚法主要是通過在納米粒表面吸附某種蛋白質(zhì)來增加固體脂質(zhì)納米粒的密度使游離藥物與納米粒通過離心后達(dá)到有效分離。本實(shí)驗(yàn)用約含2/3以上精氨酸的鮭魚精蛋白，一種含有胍基的帶正電的堿性氨基酸。苦參堿固體脂質(zhì)納米粒帶有負(fù)電荷。多聚陽離子魚精蛋白會與帶負(fù)電的納米粒產(chǎn)生絮凝作用，并通過離心將納米粒和游離藥物分離，該法簡單易行，且分離效果較好。

本實(shí)驗(yàn)制備的MA-SLN呈規(guī)整平滑的均勻?qū)嶓w骨架球狀結(jié)構(gòu)，苦參堿在SLN均勻分布且二者相容性良好，MA-SLN對苦參堿具有較高的包封率（56.12±0.82）%，因此載藥量大，可滿足不同疾病治療的需求；MA-SLN的平均粒徑為197 nm（PDI為0.184），電位為（-32.0±2.1）mV，表明MA-SLN粒徑分布均勻并具有良好的穩(wěn)定性。MA-SLN具有較小的粒徑，并且由于SLN的親脂性材料將藥物包裹于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中，增加了藥物的穩(wěn)定性和細(xì)胞透過率，因此，可以極大地促進(jìn)苦參堿的透皮吸收[20-21]，9 h時(shí)ΔM達(dá)到500 μg/cm2是苦參堿水溶液的3.93倍（t檢驗(yàn)，P＜0.05），同時(shí)，由于苦參堿被充分包埋于MA-SLN的實(shí)體骨架材料中因而具有較好的緩釋行為，可持續(xù)釋藥24 h。MA-SLN為苦參堿提供了一種基于納米微粒的新型外用緩釋給藥系統(tǒng)，在一定程度上促進(jìn)了中藥的傳承與創(chuàng)新，因此，MA-SLN具有廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突