管詠梅，萬鑫浩，吳文婷，孟曉偉，臧振中，鐘凌云，陳麗華，劉義豪，董歡歡，朱衛(wèi)豐

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

桂枝加葛根湯（Guizhi Jia Gegen Decoction，GJGD）出自東漢·張仲景著《傷寒論》[1]。由葛根四兩、桂枝二兩（去皮）、白芍二兩、甘草（炙）二兩、生姜三兩、大棗十二枚6味藥組成。具有解肌發(fā)表、升津舒經(jīng)之功效，主治風(fēng)寒客于太陽經(jīng)輸，營(yíng)衛(wèi)不和證。經(jīng)典名方是我國(guó)中醫(yī)藥寶庫中的偉大財(cái)富和智慧結(jié)晶，歷史悠久，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，其研制分為物質(zhì)基準(zhǔn)研制和制劑研制2個(gè)階段。然而中藥成分的復(fù)雜性使得保持其質(zhì)量一致性成為質(zhì)量控制的難點(diǎn)。鑒于中藥組成的多樣性和辨證施治的治療方案，檢測(cè)任何一種活性成分均不能代表其整體藥效，中藥指紋圖譜能全面、定量地反映中藥所包含的化學(xué)信息，是中藥質(zhì)量控制的有效手段，HPLC指紋圖譜法也成為最常見的質(zhì)量控制手段[2]。

目前，尚未見有關(guān)建立GJGD指紋圖譜的研究報(bào)道，中藥指紋圖譜可以科學(xué)、系統(tǒng)、全面地反映中藥的復(fù)雜化學(xué)成分組成[3]，化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可以將多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合、降維和分類分析，對(duì)指紋圖譜中的信息進(jìn)行表達(dá)、識(shí)別和處理[4]，二者結(jié)合可以更加系統(tǒng)、全面地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，目前已被廣泛用于經(jīng)典名方質(zhì)量控制。因此本研究通過HPLC法建立了GJGD標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，并對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合聚類分析（clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等化學(xué)模式識(shí)別方法評(píng)價(jià)各批次樣品間的質(zhì)量差異，為完善GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)現(xiàn)后續(xù)相關(guān)制劑的深度質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；BSA124S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ-500VDE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SIGMA3-18 K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；H22-X2電陶爐，九陽股份有限公司；3 L滎經(jīng)黑砂鍋，滎經(jīng)柴氏砂器文化發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.2 材料

葛根素、葛根素芹菜糖苷、芍藥苷、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品，成都普菲生物科技有限公司，批號(hào)分別為19011507、21051103、20030901、18102401、21022610、19121801、19082902、19032004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為98.4%、99.6%、98.2%、98.6%、98.5%、98.51%、98.13%、98.9%；肉桂酸對(duì)照品，成都普思生物科技有限公司，批號(hào)PS000800，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%；沒食子酸對(duì)照品，大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)MB2707-S，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%；染料木苷對(duì)照品，成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)CHB170223，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%。

葛根為豆科葛屬植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根，桂枝為樟科樟屬植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥嫩枝，白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，甘草為豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，生姜為姜科姜屬植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖，大棗為鼠李科棗屬植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實(shí)。這6味藥材均購于江中飲片公司，藥材均由江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定。各飲片質(zhì)量經(jīng)本課題組前期檢測(cè)均符合要求，采用隨機(jī)數(shù)表法將不同批次藥材進(jìn)行組合，藥材批號(hào)及產(chǎn)地組合信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

5C18-MS-IIC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水水溶液，梯度洗脫：0～3 min，5%～11%乙腈；3～15 min，11%乙腈；15～25 min，11%～15%乙腈；25～31 min，15%～20%乙腈；31～39 min，20%乙腈；39～43 min，20%～25%乙腈；43～48 min，25%～30%乙腈；48～52 min，30%～35%乙腈；52～57 min，35%～40%乙腈；57～61 min，40%～50%乙腈；61～66 min，50%～5%乙腈；66～67 min，5%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～30 min，245 nm；30～60 min，280 nm；60～67 min，245 nm。

表1 15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn) (S1～S15) 組方藥材的批號(hào)及產(chǎn)地信息Table 1 Lot number and origin information of 15 batches (S1—S15) of decoction pieces in GJGD substance benchmarks

2.2 溶液的制備

2.2.1 GJGD標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 《傷寒論》記載GJGD原方為“葛根（四兩）、芍藥（二兩）、生姜（三兩，切）、甘草（二兩，炙）、大棗（十二枚，擘）、桂枝（二兩，去皮）上六味，以水一斗，先煮葛根，減二升，去上沫，內(nèi)諸藥，煮取三升，去滓。溫服一升，覆取微似汗，不須啜粥，余如桂枝法將息及禁忌。”根據(jù)《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》[5]記載，東漢1升約為現(xiàn)今200 mL，一合約20 mL?；凇白鸸挪荒喙拧崩砟?，通過文獻(xiàn)查閱研究可知，古代經(jīng)典名方應(yīng)用時(shí)，不僅可根據(jù)前人考證的量制進(jìn)行折算，更重要的是依據(jù)臨床實(shí)踐，因此結(jié)合臨床用藥，最終確定1兩為當(dāng)今3 g[6]。因此確定GJGD標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法為取葛根12 g、桂枝6 g、白芍6 g、甘草6 g、生姜9 g、大棗12枚。無需粉碎過篩，加水2000 mL，先加入葛根武火煮沸，文火熬去400 mL，去掉上沫，再加入其他5味中藥，文火繼續(xù)煮至600 mL，4層200目紗布濾過，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、芍藥苷、大豆苷、甘草苷、染料木苷、肉桂酸、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成母液，各吸取適量母液于10 mL量瓶中，用比例為5∶95的乙腈與0.1%磷酸水定容稀釋，得各對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為26.83、27.64、24.29、30.36、28.50、25.90、18.28、36.48、21.44、26.89、26.66 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下制備的GJGD標(biāo)準(zhǔn)湯劑5 mL，8000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于10 mL量瓶中，超純水稀釋定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品S5的供試品溶液適量，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，以16號(hào)峰（大豆苷）為參照，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一份GJGD供試品溶液（S5），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖，以大豆苷為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品S5適量，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以16號(hào)峰（大豆苷）為參照，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4 GJGD指紋圖譜的建立

取15批GJGD供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.1 min，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，生成GJGD指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜（R），結(jié)果見圖1。共標(biāo)定29個(gè)共有峰，其中指認(rèn)11個(gè)共有峰，分別為1號(hào)峰沒食子酸、8號(hào)峰3′-羥基葛根素、11號(hào)峰葛根素、12號(hào)峰葛根素芹菜糖苷、13號(hào)峰3′-甲氧基葛根素、15號(hào)峰芍藥苷、16號(hào)峰大豆苷、20號(hào)峰甘草苷、22號(hào)峰染料木苷、26號(hào)峰肉桂酸、28號(hào)峰甘草酸銨。

2.5 共有峰歸屬

取GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)樣品S1以及缺葛根、缺桂枝、缺白芍、缺甘草、缺干姜、缺大棗的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)合色譜峰的保留時(shí)間及紫外吸收?qǐng)D，通過對(duì)比分析，對(duì)29個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬，見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5味組方飲片對(duì)GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜均有貢獻(xiàn)，其中3～14、16～19、21～25號(hào)峰來自葛根，26號(hào)峰來桂枝；1、15號(hào)峰來自白芍，20、27～29號(hào)峰來自甘草，2號(hào)峰來自大棗。在29個(gè)共有峰中，葛根占據(jù)21個(gè)，表明君藥葛根對(duì)于該復(fù)方的化學(xué)成分表征非常重要。

2.6 相似度分析

以對(duì)照指紋圖譜為參照，計(jì)算15批GJGD樣品圖譜相似度分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.965、0.999、0.999、0.998、0.999、0.941、0.997、0.989、0.999、0.976，相似度良好，均在0.90以上，表明所建立的GJGD標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜質(zhì)量穩(wěn)定，可以反映其指紋特征。樣品S6、S11、S13、S15與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均小于0.990，其他樣品都大于0.990，說明不同批次藥材的物質(zhì)基準(zhǔn)存在一定的質(zhì)量差異。

2.7 HCA

HCA常用于數(shù)據(jù)的初步探索性分析，具有直觀、結(jié)論形式簡(jiǎn)明的優(yōu)點(diǎn)[7-8]。采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)15批樣品的共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間連接法，測(cè)量區(qū)間為平方歐氏距離，聚類結(jié)果見圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歐氏距離為10時(shí)，15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)可分為2類，即樣品S6、S11、S13、S15為第1類，樣品S1～S5、S7～S10、S12、S14為第2類，此結(jié)果可與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果相互印證。

2.8 PCA[9]

選擇15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的29個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA-P＋14.1（Demo）軟件進(jìn)行PCA處理，得分矩陣圖見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)分布能分成2組，樣品S6、S11、S13、S15為一組，樣品S1～S5、S7～S10、S12、S14為第2組，與HCA結(jié)果一致。

2.9 OPLS-DA[10-12]

將15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的29個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P＋14.1（Demo）軟件進(jìn)行OPLS-DA處理，得分矩陣圖見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15批樣品聚為2類，樣品S6、S11、S13、S15為一組，樣品S1～S5、S7～S10、S12、S14為第2組，2組樣品聚類效果良好，且與PCA和HCA結(jié)果一致。圖6中的點(diǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明對(duì)應(yīng)變量（色譜峰）權(quán)重值越大[13-14]，結(jié)合以變量重要性投影（VIP）值＞1為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異組分，見圖7。結(jié)果共找到了11個(gè)成分，按VIP值大小排序分別為11（葛根素）、13（3′-甲氧基葛根素）、21、12（葛根素芹菜糖苷）、5、22（大豆苷）、19、18、1（沒食子酸）、4、8（3′-羥基葛根素）號(hào)峰。上述11個(gè)差異成分中10個(gè)來自葛根，1個(gè)來自白芍，進(jìn)一步說明嚴(yán)格控制葛根藥材質(zhì)量是確保GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量穩(wěn)定的關(guān)鍵。

3 討論

3.1 色譜條件分析

圖1 15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn) (S1～S15) 的HPLC指紋圖譜 (A) 及其共有模式 (B) 和混合對(duì)照品的HPLC圖 (C)Fig.1 HPLC fingerprints (A) and its common mode (B) of 15 batches (S1—S15) of substance benchmarks of GJGD and HPLC of mixed reference substances (C)

圖2 GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的特征峰歸屬Fig.2 Attribution of characteristic peaks in substance benchmarks of GJGD

圖3 15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的HCA樹狀圖Fig.3 Dendrogram of 15 batches of GJGD substance benchmarks by HCA

圖4 15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的PCA得分Fig.4 PCA scoring plots of 15 batches of substance benchmarks of GJGD

圖5 15批GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)OPLS-DA的得分矩陣Fig.5 OPLS-DA scoring plots of 15 batches of substance benchmarks of GJGD

圖6 GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)的OPLS-DA載荷散點(diǎn)Fig.6 OPLS-DA loading plots of GJGD substance benchmarks

圖7 GJGD湯物質(zhì)基準(zhǔn)OPLS-DA的VIP值Fig.7 VIP values of OPLS-DA of GJGD substance benchmarks

本實(shí)驗(yàn)采用分別考察了在水-乙腈、水-甲醇、0.1%磷酸水溶液-乙腈以及0.05%磷酸水溶液-乙腈4種不同的流動(dòng)相體系下色譜峰的分離情況，結(jié)果顯示流動(dòng)相為水-乙腈、水-甲醇時(shí)，色譜峰峰形較差，分離度不好。流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-乙腈以及0.05%磷酸水溶液-乙腈時(shí)，有較好的色譜峰峰形，分離度較好，無明顯拖尾，且兩者相差不大， 因此選擇0.1%磷酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相。同時(shí)，對(duì)245、255、260、270、280 nm等不同檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)肉桂酸和甘草苷在280 nm處響應(yīng)值最高，在245 nm處偏低，其他各成分在245 nm處響應(yīng)值都較高，各峰響應(yīng)值較高，綜合考慮基線、峰形、峰數(shù)、指標(biāo)成分分離度及響應(yīng)值等因素，最終確定多波長(zhǎng)切換法，分別為245 nm（0～30 min，60～67 min，色譜峰數(shù)最多）、280 nm（30～60 min，檢測(cè)甘草苷、肉桂酸）。另外，考察了柱溫（20、25、30 ℃）對(duì)色譜峰分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30 ℃條件下，各色譜峰分離度較好。

3.2 指標(biāo)成分的選擇

中藥是具有復(fù)雜成分的有機(jī)整體，藥效的發(fā)揮并非是單一有效成分的作用，而是其所含多元化活性成分共同作用的結(jié)果[15]。建立經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜時(shí)應(yīng)綜合考慮全方，選擇具有代表性且與藥效相關(guān)性強(qiáng)的成分作為質(zhì)控指標(biāo)，使物質(zhì)基準(zhǔn)能準(zhǔn)確反映原方質(zhì)量，以助于更好地發(fā)揮物質(zhì)基準(zhǔn)的參照物功能，保證經(jīng)典名方制劑的質(zhì)量[16]。GJGD是由葛根、桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗這6味藥組成，其中葛根為君藥，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉作用。桂枝、白芍均為臣藥，桂枝具有發(fā)汗解表、散寒止痛、通陽化氣作用，白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽。甘草為佐藥，大棗、生姜為使藥。諸藥并用，共奏解肌發(fā)表，升津舒經(jīng)之效。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)照品共指認(rèn)出11個(gè)成分，其中包括葛根中主要有效成分葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷。桂枝中主要有效成分肉桂酸。白芍中主要有效成分芍藥苷、沒食子酸。甘草中主要有效成分甘草苷、甘草酸按。在葛根中，解熱鎮(zhèn)痛的主要成分為異黃酮類成分，已有研究表明，葛根素能起到解熱作用，但并不是指在葛根中葛根素是發(fā)揮解熱作用的唯一有效成分[17]，而葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷均屬于異黃酮類成分，結(jié)合藥理作用，能被選擇為指標(biāo)成分之一。桂枝中主要含有桂皮醛、肉桂酸等成分發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒作用[18]。白芍和甘草的主要有效成分芍藥苷、沒食子酸、甘草苷、甘草酸銨等，均為《中國(guó)藥典》2020年版單味藥項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo)性成分。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)GJGD湯物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC指紋圖譜中11個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，可為后續(xù)含量測(cè)定等關(guān)鍵質(zhì)量控制環(huán)節(jié)研究奠定基礎(chǔ)。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

前期實(shí)驗(yàn)考察過取水煎液25 mL于錐形瓶中，加等體積的甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心10 min（轉(zhuǎn)速為8000 r/min）；精密吸取上清液2 mL于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形不整齊，且各指標(biāo)性成分峰面積過小，不利于觀察研究。后再次考察直接利用水煎液離心再濾過進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)各色譜峰面積過大，葛根素是當(dāng)中峰面積最大成分，面積超過標(biāo)準(zhǔn)，但其他指標(biāo)成分和未指認(rèn)出的色譜峰峰形均良好且面積不小，故再次修改方法，最終確定把水煎液離心后利用超純水稀釋10倍后過濾進(jìn)樣，得到的各色譜峰均符合要求。

3.4 總結(jié)

經(jīng)典名方是我國(guó)中醫(yī)藥文化寶藏，在國(guó)家政策的扶持下，經(jīng)典名方已經(jīng)成為當(dāng)今熱點(diǎn)。而經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的制備開發(fā)，關(guān)鍵在于現(xiàn)代生產(chǎn)工藝與傳統(tǒng)工藝保持“基本一致”，即投料用飲片質(zhì)量一致，生產(chǎn)工藝條件一致。因此，需要對(duì)藥材、飲片、中間體及物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制[19-20]。本研究采用HPLC法建立GJGD指紋圖譜，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，能夠較為全面地對(duì)GJGD標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為GJGD物質(zhì)基準(zhǔn)及后續(xù)復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突