王瑞生，曹文文，張江山，張振凌,3*，陳祎甜

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008

2.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450008

3.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450008

百藥煎為五倍子同茶葉、酵曲等經(jīng)發(fā)酵制成的塊狀物，有潤(rùn)肺化痰、止血止瀉、解熱生津的功效[1]。臨床記載了百藥煎在中成藥中的應(yīng)用，如其組成的金霜煎、結(jié)腸安膠囊、清咽丸等。李時(shí)珍曰[2]“百藥煎功與五倍子不異。但經(jīng)釀造，其體輕虛，其性浮收，且味帶余甘……含噙尤為相宜”。相較于條件有限且質(zhì)量波動(dòng)較大的傳統(tǒng)自然發(fā)酵，現(xiàn)代發(fā)酵法已經(jīng)針對(duì)影響百藥煎發(fā)酵質(zhì)量的相關(guān)因素，如菌種、基質(zhì)和溫濕度等進(jìn)行了研究和改良[3-8]，使其炮制工藝和飲片質(zhì)量得到了較大改善。本課題組在前期研究中[9-11]利用微生物分離鑒定技術(shù)于傳統(tǒng)發(fā)酵過程中分離篩選出了五倍子發(fā)酵百藥煎的3種優(yōu)勢(shì)菌種/群：黑曲霉Aspergillus niger（BYJ.H-1）、米根霉Rhizopus oryzae（BYJ.G-1）和蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus（HMB2）、巨大芽孢桿菌菌株Bacillus megaterium（HMB5）、伯頓絲孢畢赤酵母Burton Pichia pastoris（HMY1）、克魯維酵母菌株Kluyveromyces（HMY2）4菌混合菌群，并在恒溫恒濕條件下分別進(jìn)行發(fā)酵，均可以得到五倍子的發(fā)酵品百藥煎，且主要指標(biāo)成分沒食子酸的含量都可以達(dá)到≥35%的要求[12]。但百藥煎在發(fā)酵過程中的物質(zhì)基礎(chǔ)變化涉及到酚類、酯類和兒茶素類等多種化學(xué)成分[13]，不同菌種對(duì)其發(fā)酵質(zhì)量的影響是否存在較大差異尚不明確，僅依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的單一指標(biāo)判斷上述發(fā)酵品間的差異性有所片面，有必要根據(jù)其發(fā)酵過程中的特征性成分的變化進(jìn)一步分析。

百藥煎對(duì)于呼吸及消化系統(tǒng)的治療和調(diào)理依賴于自身多種物質(zhì)基礎(chǔ)的協(xié)同作用[14-15]，但目前有關(guān)百藥煎的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用研究較少，使其功效作用機(jī)制研究難以深入到細(xì)胞分子層面。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[16]是一種基于大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下融合系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)以及多種網(wǎng)絡(luò)計(jì)算平臺(tái)的新興學(xué)科，可以在臨床研究前實(shí)現(xiàn)跨微觀（分子、生化網(wǎng)絡(luò)）到宏觀（組織、器官）的多層次理論模擬和分析，從而系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)地研究模型內(nèi)多個(gè)元素（藥物分子、靶標(biāo)、細(xì)胞、組織、器官等）之間的相互作用，從可視化角度闡釋中藥多分子、多靶點(diǎn)、多途徑的功效作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，以五倍子發(fā)酵百藥煎過程中2種新產(chǎn)生的成分2,4,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖（2,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGβG）和2,4,6-三-O-沒食子酰-α-D-葡萄糖（2,4,6-tri-O-galloyl-α-D-glucose，TGαG）及2種升高成分沒食子酸和表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）的HPLC峰面積為指標(biāo)，采用主成分分析-聚類分析（principal component analysis-cluster analysis，PCA- CA）法對(duì)比3種不同菌種/群發(fā)酵品的差異；同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)百藥煎“清熱化痰、止血止瀉、解熱生津”功效的潛在分子作用機(jī)制進(jìn)行探究，為百藥煎的發(fā)酵炮制、質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用和飲片開發(fā)提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

2487型高效液相色譜儀，上海通微分析技術(shù)有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；SPL-250型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW- CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；BSA224S-CW型電子天平和BT25S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；400Y型高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；W22型電陶爐，佛山市順德區(qū)啟偉電器有限公司。

1.2 材料及試劑

五倍子購(gòu)于安徽石田中藥飲片有限公司，批號(hào)160429，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensisMill.葉上的蟲癭，符合《中國(guó)藥典》2020年版五倍子項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定，百藥煎均為實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法見“2.1”項(xiàng)。茶葉，綠茶，河南信陽(yáng)茶葉專業(yè)市場(chǎng)，批號(hào)20160810；BYJ.G-1，實(shí)驗(yàn)室保藏，批號(hào)20180118；BYJ.H-1，實(shí)驗(yàn)室保藏，批號(hào)20190119；HMB2，實(shí)驗(yàn)室保藏，批號(hào)20180702；HMB5，實(shí)驗(yàn)室保藏，批號(hào)20180705；HMY1，實(shí)驗(yàn)室保藏，批號(hào)20180711；HMY2，實(shí)驗(yàn)室保藏，批號(hào)20180712；PDA/LB培養(yǎng)基，自制，批號(hào)20190809；沒食子酸、EGC對(duì)照品，成都普斯生物科技有限公司，批號(hào)分別為PS000688、PS0230- 0025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥99%；2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖（TGG，由于TGG結(jié)構(gòu)具有半縮醛，始終有α和β 2個(gè)互變異構(gòu)體存在，因此對(duì)照品是1個(gè)，但是在色譜圖上有2個(gè)峰）對(duì)照品，批號(hào)20150824，自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%；三氟乙酸，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)202007015，分析純；乙腈，美國(guó)Thermo公司，批號(hào)20201016，色譜純；甲醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20200713，分析純。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)及平臺(tái)

有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/ tcmsp.php），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（UniversalProtein，Uniprot，https://www.uniprot.org/），人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards-Human Genes，https://www.genecards.org/），交互式韋恩圖平臺(tái)（jvenn，http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html），功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（STRING，https://string-db.org/），高通量基因組數(shù)據(jù)分析工具平臺(tái)（Bioconductor，https:// bioconductor.org/）。

2 方法與結(jié)果

2.1 百藥煎樣品制備

取茶葉，分次加水煎煮，濾過，合并濾液，濃縮至適量，放涼，與五倍子細(xì)粉混合，制成軟材，于115 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，放至室溫。分別接種BYJ.H-1、BYJ.G-1和HMB2、HMB5、HMY1、HMY2 4菌混合菌群，置溫度35 ℃，濕度85%條件下發(fā)酵，待藥塊表面遍布白色“霉衣”時(shí)，取出，切成小方塊，低溫干燥。3種菌種各發(fā)酵9批，批號(hào)分別為BM1～BM9、BH1～BH9、BA1～BA9。

2.2 不同菌種發(fā)酵品特征性成分差異對(duì)比

2.2.1 供試品溶液的制備 取各批樣品粉碎，過4號(hào)篩，取0.2 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，稱質(zhì)量后靜置2 h，超聲提取40 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液，過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取沒食子酸、EGC、TGG對(duì)照品適量，精密稱定后加甲醇溶解，配制成含沒食子酸0.1 mg/mL、EGC 0.3 mg/mL、TGG 0.02 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 樣品測(cè)定 參照本課題組前期建立的HPLC法[12]測(cè)定27批百藥煎樣品，含量以干燥品計(jì)，色譜圖見圖1，測(cè)定結(jié)果見表1。

2.2.4 不同菌種發(fā)酵品PCA-CA分析

（1）特征性成分降維分析：采用SPSS 20.0軟件將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行降維，根據(jù)特征值＞1和累積方差貢獻(xiàn)率＞80%，選取前2個(gè)成分作為降 維后的主成分（表2），并將主成分載荷轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的特征向量（得分系數(shù)）后計(jì)算主成分得分，結(jié)果見表3、4。

圖1 混合對(duì)照品 (A) 和百藥煎樣品 (B) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and Baiyaojian sample (B)

（2）不同菌種發(fā)酵品聚類分析：以主成分得分為指標(biāo)，采用SPSS 20.0軟件對(duì)不同菌種發(fā)酵品進(jìn)行k-均值聚類分析，將群集數(shù)設(shè)置為3后輸出聚類結(jié)果并進(jìn)行可視化。結(jié)果顯示，各聚類群集中的發(fā)酵品并非單一種類，不同菌種發(fā)酵品的聚類結(jié)果存在交叉現(xiàn)象，群集聚類趨勢(shì)無規(guī)律且與菌種類別無關(guān)聯(lián)，見圖2。

2.3 百藥煎潛在分子作用機(jī)制探究

2.3.1 活性成分靶標(biāo)及功效相關(guān)靶標(biāo)篩選

（1）活性成分靶標(biāo)篩選：鑒于百藥煎基礎(chǔ)研究過少，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并未收錄相關(guān)信息，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上[17]借助PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)百藥煎的活性成分進(jìn)行整理（表5），然后以各成分名稱為關(guān)鍵詞通過TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲取相關(guān)靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)名稱，結(jié)果共得到158個(gè)靶點(diǎn)，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

表1 百藥煎不同菌種發(fā)酵品中4種特征成分峰面積Table 1 Peak area of four characteristic components in different strains fermented products of Baiyaojian

表2 主成分特征值及解釋的總方差Table 2 Principal component eigenvalues and explained total variance

表3 主成分載荷及特征向量Table 3 Principal component loads and eigenvectors

（2）百藥煎功效靶標(biāo)篩選：依據(jù)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論從“病、癥、證”角度對(duì)百藥煎的功效應(yīng)用進(jìn)行分析后整理出可供數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的方向——呼吸道疾?。╮espiratory disease，RD）、水液代謝失調(diào)（water metabolism imbalance，WI）和消化道出血（alimentary tract hemorrhage，AH）并提取其中的主要關(guān)鍵詞（圖4），然后通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，剔除重復(fù)及相關(guān)得分過低者，共得到1916個(gè)相關(guān)靶標(biāo)，主要涉及多表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)樣域10（multiple epidermal growth factor-like domains protein 10）、抗肌萎縮蛋白（dystrophin）、骨成型蛋白受體1A（bone morphogenetic protein receptor type 1A）、C-X-C趨化因子基序配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）等。

表4 特征成分的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)及主成分得分Table 4 Standardized data of feature components and scores of principal components

圖2 不同菌種發(fā)酵品k-均值聚類散點(diǎn)圖Fig.2 K-mean cluster scatter plot of different strains fermentation products

2.3.2 中藥成分-功效靶點(diǎn)交集 基于Jvenn平臺(tái)對(duì)百藥煎及其功效相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行取交集處理，得到99個(gè)共有靶點(diǎn)，在3種病證中互有交集（圖5），這些靶點(diǎn)即為百藥煎發(fā)揮功效的潛在作用靶點(diǎn)，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、前列腺素G/H合成酶1/2（prostaglandin- endoperoxide synthase 1/2，PTGS1/2）、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等。

2.3.3 百藥煎功效調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化 在明確百藥煎治療RD/WI/AH的潛在作用靶點(diǎn)后，采用Cytoscape軟件分別以“百藥煎、活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)、RD/WI/AH”為節(jié)點(diǎn)，4者間的微觀聯(lián)系為網(wǎng)絡(luò)屬性，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6），可明顯看出百藥煎是以多組分協(xié)同干預(yù)多個(gè)靶點(diǎn)起到治療RT/DS/HS的作用。

2.3.4 共有靶點(diǎn)的蛋白互作及PPI網(wǎng)路拓?fù)浞治?為進(jìn)一步探究百藥煎治療RD/WI/AH的分子作用機(jī)制，將共有靶點(diǎn)上傳至STRING平臺(tái)查詢靶點(diǎn)間的互作關(guān)系（置信度≥0.7），篩選后初步得到核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。剔除重復(fù)者及PPI網(wǎng)絡(luò)外的離散靶點(diǎn)后，RD相關(guān)網(wǎng)絡(luò)具有79個(gè)節(jié)點(diǎn)、652條邊，WI相關(guān)網(wǎng)絡(luò)具有78個(gè)節(jié)點(diǎn)、619條邊，AH相關(guān)網(wǎng)絡(luò)具有13個(gè)節(jié)點(diǎn)、41條邊，共計(jì)98個(gè)核心靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上利用Cytoscape軟件中的Network Analyzer對(duì)3個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，并依?jù)節(jié)點(diǎn)度和邊中心性將網(wǎng)絡(luò)按順時(shí)針降序布局，見圖7。

表5 百藥煎活性成分基本信息Table 5 Basic information of active ingredients of Baiyaojian

圖3 百藥煎“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 “Component-target” network diagram of Baiyaojian

2.3.5 核心靶點(diǎn)的GO及KEGG富集分析 利用Bioconductor平臺(tái)和R語言對(duì)上述具備互作關(guān)系的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析，得到112個(gè)GO條目和154條KEGG信號(hào)通路，在錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05的前提下依據(jù)P值降序排列后分別選取前20個(gè)進(jìn)行分析并做可視化處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述GO條目均與分子生物學(xué)功能相關(guān)，主要包括蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/ threonine kinase activity）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等，見圖8；上述KEGG信號(hào)通路主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、卡波西肉瘤皰疹病毒感染通路（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection pathway）、人類巨細(xì)胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection pathway）、乙型肝炎通路（hepatitis B pathway）、癌蛋白聚糖通路（proteoglycans in cancer pathway）等，見圖9。對(duì)最為顯著的PI3K-Akt信號(hào)通路的作用機(jī)制進(jìn)行深入探究，發(fā)現(xiàn)藥物可通過多個(gè)靶點(diǎn)作用在通路中的節(jié)點(diǎn)上，圖10為其代謝通路圖，圖中標(biāo)紅的節(jié)點(diǎn)即為藥物靶點(diǎn)主要作用節(jié)點(diǎn)。

圖4 百藥煎功效檢索關(guān)鍵詞分析Fig.4 Analysis of efficacy search key words of Baiyaojian

3 討論

圖5 “藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)”韋恩圖Fig.5 Venn diagram of “drug target-disease target”

圖6 百藥煎功效調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Efficacy control network diagram of Baiyaojian

目前，對(duì)于百藥煎成分變化與功效變化的內(nèi)在 聯(lián)系，尚無文獻(xiàn)報(bào)到。本課題組前期主要對(duì)百藥煎成分變化進(jìn)行了深入研究，其中TGG為百藥煎中首次發(fā)現(xiàn)的化合物，該化合物結(jié)構(gòu)由于具有半縮醛，因此始終有α和β 2個(gè)互變異構(gòu)體存在[12]，因此本研究將發(fā)酵后，百藥煎中含量升高的成分沒食子酸、EGC以及TGβG、TGαG和等特征性成分作為指標(biāo)進(jìn)行研究。由于TGG為本課題組首次從百藥煎中分離得到，得率較低；且不同菌種發(fā)酵百藥煎中該成分含量差異較大，在使用標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)誤差較大，計(jì)算出的含量不準(zhǔn)確，而峰面積作為指標(biāo)更加準(zhǔn)確，因此，在選擇指標(biāo)時(shí)選用峰面積為指標(biāo)。

圖7 共有靶點(diǎn)的拓?fù)浞治鯢ig.7 Topological analysis of shared targets

圖8 百藥煎治療RD/WI/AH核心靶點(diǎn)的GO富集分析Fig.8 Analysis of GO enrichment of Baiyaojian in treatment of RD/WI/AH core targets

本研究以特征性成分為指標(biāo)的PCA-CA分析結(jié)果顯示3種關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)菌種在五倍子發(fā)酵百藥煎的化學(xué)成分變化過程中均可產(chǎn)生類似的特征性變化。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，這種特征性變化可能是百藥煎發(fā)酵后增效減毒作用機(jī)制產(chǎn)生的關(guān)鍵過程，即降低 鞣質(zhì)含量減少其口腔澀味、胃腸道收斂刺激性和肝臟毒性的同時(shí)大量生成沒食子酸、EGC等相對(duì)分子質(zhì)量小、易吸收的藥效活性成分。結(jié)果顯示上述3種優(yōu)勢(shì)菌種均可以完成這段關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化且結(jié)果基本一致，表明3種不同菌種發(fā)酵品間不存在明顯差異性。此外，現(xiàn)行國(guó)家藥典中尚未收錄本品，相關(guān)省市的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范也僅以沒食子酸為質(zhì)控指標(biāo)，不利于其臨床療效及用藥安全性的保障，針對(duì)此現(xiàn)狀，可利用一測(cè)多評(píng)或指紋圖譜等多成分評(píng)價(jià)體系探究上述特征性成分作為質(zhì)控指標(biāo)的可行性。

網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果顯示，百藥煎中的沒食子酸、EGC、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯和EGC沒食子酸酯5種活性成分對(duì)其適應(yīng)病證存在潛在干預(yù)作用，可能是通過AKT1、STAT3、EGF、MAPK1、MAPK3、CXCL8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，AVEGFA）、前列腺素氧化環(huán)化酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等核心靶點(diǎn)的協(xié)同作用達(dá)到治療RD/WI/ AH的目的。其中，AKT1可以調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、凋亡、代謝和血管生成在內(nèi)的多種生物過程，STAT3作為急性期響應(yīng)因子在多種炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和基礎(chǔ)能量代謝中具有重要作用，表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）則在體內(nèi)外刺激各種表皮和上皮組織的生長(zhǎng)，MAPK作為MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要組成部分與呼吸及消化系統(tǒng)疾?。ǜ窝?、百日咳等）密切相關(guān)，CXCL8作為炎癥刺激響應(yīng)因子在呼吸道及消化道炎癥（支氣管炎、口腔炎、肺炎、胃炎等）發(fā)生中占據(jù)重要地位，上述各靶點(diǎn)所參與的生物過程要么涉及到呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，要么涉及到循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和破損組織的生長(zhǎng)，而RD/WI/AH的產(chǎn)生恰好與此相關(guān)，證明百藥煎很有可能是通過上述靶點(diǎn)間的協(xié)同作用達(dá)到相應(yīng)功效。GO分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)的表達(dá)主要涉及到激酶活性、連接酶及受體蛋白結(jié)合等分子功能；KEGG通路分析結(jié)果顯示，百藥煎的功效發(fā)揮主要涉及病毒感染、癌變和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)等信號(hào)通路，其中PI3K-Akt信號(hào)通路的基因富集率和差異性表達(dá)最為顯著，該通路不僅參與多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[20]。

圖9 百藥煎治療RD/WI/AH的KEGG通路富集分析Fig.9 Analysis of KEGG path enrichment of Baiyaojian in treatment of RD/WI/AH

圖10 百藥煎治療RD/WI/AH的KEGG信號(hào)通路之一 (PI3K-Akt)Fig.10 One of KEGG signaling pathways of Baiyaojian in treatment of RD/WI/AH (PI3K-Akt)

在PI3K-Akt信號(hào)通路傳導(dǎo)過程中，相關(guān)生長(zhǎng)因子與其受體酪氨酸激酶結(jié)合或G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，分別激活I(lǐng)A型和IB型PI3K基因，PI3K可以催化磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）的生產(chǎn)，PIP3可以作為第2個(gè)信使激活A(yù)kt，Akt經(jīng)過一系列磷酸化反應(yīng)后，可作用于多靶點(diǎn)，從而調(diào)控蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和DNA修復(fù)等過程[19-20]?！癛eference Network”是直接從KEGG信號(hào)通路中提取的分支信號(hào)通路，體現(xiàn)了其中部分基因之間的相互作用信息，在PI3K-Akt信號(hào)通路中有5條這樣的通路，本研究中的靶點(diǎn)主要富集在其中的EGF-EGFR-PI3K信號(hào)通路、EGF-EGFR-RAS- PI3K信號(hào)通路、IGF-IGF1R-PI3K信號(hào)通路及EGF- EGFR-PI3K-NF-κB信號(hào)通路上。在上述前2條分支信號(hào)通路中，基因主要分布在GF、RTK、AKT及BAD 4個(gè)節(jié)點(diǎn)上[21-22]。富集在GF節(jié)點(diǎn)上的基因有EGF、FGF2、FGF10、PDGFB及VEGFA，主要負(fù)責(zé)編碼一些活性因子。EGF負(fù)責(zé)編碼表皮生長(zhǎng)因子超家族的成員，可刺激體內(nèi)外各種表皮和上皮組織的生長(zhǎng)。FGF2和FGF10基因編碼的蛋白是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族的成員，F(xiàn)GF可參與各種生物過程，包括胚胎發(fā)育，細(xì)胞生長(zhǎng)，形態(tài)發(fā)生，組織修復(fù)，腫瘤生長(zhǎng)和侵襲等[23]。

PDGFB基因編碼的蛋白包括血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），為中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、皮膚及血管平滑肌細(xì)胞的正常增殖以及血管和腎小球的正常發(fā)育所需，在傷口愈合中具有重要作用，可在多種發(fā)育過程中發(fā)揮作用[24]。VEGFA也是PDGF/VEGF生長(zhǎng)因子家族的一員，編碼肝素結(jié)合蛋白，可誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對(duì)生理和病理性的血管生成都至關(guān)重要。富集在RTK節(jié)點(diǎn)上的基因有EGFR、FGFR1、FLT1、KDR、PDGFRB、IGF1R、EPHA2及ERBB2，主要負(fù)責(zé)編碼一些受體蛋白。EGFR編碼一種跨膜蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子的受體[25]。FGFR1是FGF2和FGF10等纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體。FLT1和KDR基因編碼的蛋白為VEGF的受體（VEGFR）。PDGFRB是PDGF的酪氨酸激酶受體。IGF1R編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體，也是一種酪氨酸激酶。EPHA2及ERBB2編碼的蛋白也是一種酪氨酸激酶，前者編碼的是一種腎素受體，后者則是EGF的受體。Akt節(jié)點(diǎn)是PI3K通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對(duì)應(yīng)基因?yàn)锳kt，Akt是一種蛋白激酶，依賴于PI3K通路激活。富集在BAD節(jié)點(diǎn)上的基因?yàn)锽AD，BAD是Bcl-X/Bcl-2結(jié)合蛋白，主要參與調(diào)控細(xì)胞的存活及細(xì)胞的凋亡。

在IGF-IGF1R-PI3K上富集有研究基因的節(jié)點(diǎn)主要有GF、RTK及Akt，通過此信號(hào)通路可參與蛋白質(zhì)合成生物功能并調(diào)控mTOR信號(hào)通路[26-27]。在EGF-EGFR-PI3K-NF-κB信號(hào)通路上除GF、RTK及Akt 3個(gè)節(jié)點(diǎn)外，還有TKK及NF-κB 2個(gè)節(jié)點(diǎn)。TKK節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因?yàn)镮KBKB，負(fù)責(zé)編碼的蛋白是一種血清激酶，在NF-κB信號(hào)通路中起著重要作用。NF-κB節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因?yàn)镽ELA，它負(fù)責(zé)編碼的蛋白為NF-κB家族的一員，NF-κB是一種全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有細(xì)胞類型中，是一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的終點(diǎn)。綜上所述，百藥煎是通過EGF、FGF2、EGFR、FLT1及AKT等多種基因來調(diào)控PI3K-Akt通路中的多種信號(hào)傳導(dǎo)，從而參與蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程等多種生物功能，或參與調(diào)控JAT/STAT信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路及mTOR信號(hào)通路等旁支信號(hào)通路來發(fā)揮藥物的功效，達(dá)到治療RD/WI/AH的目的。百藥煎是通過多個(gè)活性成分協(xié)同作用于多個(gè)信號(hào)通路中的多個(gè)靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)“潤(rùn)肺化痰、止血止瀉、解熱生津”功效的。

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