劉 蕾， 楊 易， 徐金瑞*

(1.寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種最常見的慢性細(xì)菌性疾病。盡管目前已有治療藥物和疫苗，結(jié)核病在全世界的死亡率依然非常高。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是TB的致病菌，屬于兼性胞內(nèi)菌。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等均是Mtb的靶細(xì)胞。雖然大多數(shù)(90%～95%)接觸Mtb的個(gè)體不會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核，但大多都是Mtb的攜帶者，Mtb很可能存在于由免疫細(xì)胞聚集而成的肉芽腫的緊密組織中，即所謂的潛伏感染[1]。從潛伏感染或者進(jìn)行性肺病發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的病例中，因Mtb繁殖不受限制，從而導(dǎo)致病程延長(zhǎng)，并伴隨著肺實(shí)質(zhì)的破壞。TB仍然是目前影響人類最嚴(yán)重的全球性疾病之一[2]。近年來，對(duì)TB發(fā)病機(jī)制的研究揭示了Mtb感染后引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。大量研究表明，炎性小體在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其中對(duì)NLRP3炎性小體的研究最為廣泛[3-4]。

1 炎性小體

炎性小體是一種多蛋白大分子復(fù)合體，炎性小體活化是固有免疫的一部分。炎性小體通過模式識(shí)別受體 (pattern recognition receptor，PRR) 識(shí)別病原微生物和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，即病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)， 招募并且激活 Caspase-1，剪切 IL-1β 和 IL-18 分子的前體，產(chǎn)生相應(yīng)成熟的細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，參與機(jī)體對(duì)病原體的清除以及誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。目前發(fā)現(xiàn)能夠形成炎性小體的 PRR 主要有 NOD 樣受體(NOD-like receptor，NLR)、AIM2樣受體(AIM2-like receptor，ALR)以及含嘧啶和HIN結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(Pyrin and HIN domain-containing protein，PYHIN)蛋白家族受體[5]。

NLRP3 是目前研究最多的炎性小體，最初發(fā)現(xiàn)它與被稱為隱熱蛋白相關(guān)的周期性綜合征的遺傳性自身免疫疾病相關(guān)，癥狀是皮疹和發(fā)熱，NLRP3突變與90多種疾病相關(guān)。細(xì)胞外ATP、尿酸晶體、細(xì)菌成孔毒素、許多病原微生物，如金黃色葡萄球菌、李斯特菌屬、肺炎克雷伯菌、奈瑟菌屬、白色念珠菌、釀酒酵母菌、仙臺(tái)病毒、腺病毒、流感病毒等都能夠激活 NLRP3 炎性小體[6]。

NLRP1是第一個(gè)被描述的炎性小體復(fù)合物，在人類中由單個(gè)NLRP1基因編碼，在鼠中由NLRP1(a～c)編碼。NLRP1b炎性小體不像NLRP3炎性小體一樣在所有情況下都會(huì)導(dǎo)致caspase-1的自身蛋白水解切割，但它仍然能夠切割I(lǐng)L-1β并發(fā)生焦亡。 在人NLRP1中功能獲得突變會(huì)導(dǎo)致皮膚病，包括多個(gè)自愈性掌跖癌和家族性角化病[7]。研究發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌的致死毒素是小鼠NLRP1的配體，人類NLRP1和鼠NLRP1a/c的生理觸發(fā)因素仍有待發(fā)現(xiàn)。

NAIP-NLRC4炎性小體對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的細(xì)菌成分和革蘭陰性細(xì)菌的鞭毛蛋白有反應(yīng)。NAIP蛋白質(zhì)感知細(xì)菌T3SS針頭狀復(fù)合物和鞭毛蛋白質(zhì)，將多個(gè)NLRC4蛋白募集到炎性小體組合物中。最近的研究確定NLRC4炎性小體也受到沙門氏菌感染期間S533上的磷酸化過程的調(diào)節(jié)，能夠在沙門氏菌感染期間形成包含NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD，ASC)分子、caspase-1和caspase-8的炎性小體復(fù)合物[8]。

AIM2炎性小體在病毒和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染期間檢測(cè)細(xì)胞胞質(zhì)中的dsDNA以及自身DNA。 AIM2的HIN-200結(jié)構(gòu)域以序列非依賴性方式介導(dǎo)dsDNA的結(jié)合[9]。

Pyrin蛋白中的功能獲得性突變最初被發(fā)現(xiàn)與家族性地中海熱相關(guān)，家族性地中海熱是人類的自身炎癥性疾病，pyrin蛋白被鑒定為炎性小體復(fù)合體的組分。在正常條件下，來自細(xì)菌病原體(包括艱難梭菌(TcdB)、副溶血弧菌(VopS))等的Rho-滅活毒素激活pyrin炎性小體[10]。

小鼠NLRP9b炎性小體近期被發(fā)現(xiàn)可以在腸上皮細(xì)胞中被輪狀病毒感染激活。RNA解旋酶Dhx9，可以識(shí)別病毒雙鏈RNA，并導(dǎo)致NLRP9b與炎性小體適配子ASC和caspase-1裝配，并導(dǎo)致IL-18成熟和gasdermin D介導(dǎo)的焦亡[11]。

2 NLRP3炎性小體

2.1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

NLRP3炎性小體是目前研究最廣泛的炎性小體，在結(jié)核病樣本中檢測(cè)到NLRP3炎性小體的激活[3]。NLRP3炎性小體是由NLRP3分子、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD，ASC)分子、pro-caspase-1分子組成的蛋白復(fù)合體(圖1)。NLRP3包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是羧基端富含亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat，LRR)結(jié)構(gòu)域、中央的核苷酸結(jié)合和寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomenzation，NACHT)以及氨基端的含吡啶結(jié)構(gòu)的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)[12]。

在危險(xiǎn)信號(hào)刺激后，NLRP3分子會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化并導(dǎo)致自身寡聚化，與接頭蛋白ASC通過PYD-PYD相互作用結(jié)合，ASC再通過CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合pro-caspase-1，從而完成NLRP3炎性小體的組裝。炎性小體復(fù)合物在將Caspase-1前體轉(zhuǎn)化為活化的Caspase-1 p20和 p10中起著關(guān)鍵作用，并促進(jìn)下游IL-1β和IL-18的活化和分泌[13]。

圖1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)Fig.1 Simplified structure of NLRP3 inflammsome

2.2 NLRP3炎性小體活化機(jī)制

NLRP3炎性小體的激活過程分為起始和組裝兩部分。①起始階段：該階段TLR-NF-κB信號(hào)通路參與促進(jìn)NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[14]。c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1)磷酸化NLRP3，為下游炎性小體的激活做準(zhǔn)備[15]。②激活階段：發(fā)生外界刺激，NLRP3分子自身發(fā)生寡聚化，并通過ASC招募pro-caspase-1，從而完成炎性小體的組裝。NLRP3炎性小體激活后會(huì)使線粒體內(nèi)的組分釋放到胞質(zhì)中，釋放組織蛋白酶，并激活下游炎性信號(hào)。

目前，對(duì)NLRP3炎性小體激活機(jī)制主要包括鉀離子外流、溶酶體破裂、線粒體活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。①鉀離子外流引起NLRP3炎性小體活化[16](圖2)。P2X嘌呤受體7(P2X7)與ATP結(jié)合后被激活，離子通透性改變，細(xì)胞膜上的離子通道開放，胞內(nèi)鉀離子外流，使胞內(nèi)的低鉀環(huán)境激活NLRP3炎性小體[17-18]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，NIMA相關(guān)蛋白激酶7(NIMA-related kinase 7，NEK7)是NLRP3上游的重要分子[19]。NEK7與NLRP3分子的結(jié)合對(duì)于NLRP3炎性小體至關(guān)重要，研究還發(fā)現(xiàn)NEK7可以調(diào)節(jié)鉀離子流[20]，NEK7調(diào)節(jié)下游的IL-1β活化是通過與NLRP3分子的相互作用還是通過調(diào)節(jié)鉀離子流仍然需要進(jìn)一步研究。②溶酶體膜的破裂引起NLRP3炎性小體活化。溶酶體膜破裂使溶酶體的組分組織蛋白酶B釋放到胞質(zhì)中激活NLRP3炎性小體[21]。③線粒體ROS引起NLRP3炎性小體活化。研究發(fā)現(xiàn)，ROS不僅可以直接參與NLRP3炎性小體活化，而且過量ROS還會(huì)使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生硫氧還蛋白，胞內(nèi)游離的硫氧還蛋白與NLRP3分子結(jié)合，促進(jìn)NLRP3炎性小體的激活。④內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的NLRP3炎性小體活化。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白信號(hào)通路促進(jìn)pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也會(huì)引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高、線粒體損傷以及下游的ROS升高使NLRP3炎性小體激活[22]。

另外，在NLRP3分子缺陷型和ASC分子缺陷型細(xì)胞中仍然發(fā)現(xiàn)有IL-1β細(xì)胞因子的釋放[23-24]，caspase1和caspase11雙缺陷型小鼠獲得的樹突狀細(xì)胞仍然可以分泌IL-1β和IL-18，雖然比野生型細(xì)胞低[25]，說明存在NLRP3炎性小體非依賴的方式分泌這些細(xì)胞因子。

3 Mtb感染對(duì)NLRP3炎性小體活化的作用

3.1 Mtb感染對(duì)NLRP3炎性小體活化的激活作用

作為結(jié)核病的標(biāo)志，Mtb在活動(dòng)性結(jié)核期間會(huì)誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)。炎癥的分子調(diào)節(jié)與炎性小體的組裝有關(guān)。Mtb可以特異性活化NLRP3炎性小體，Mtb觸發(fā)炎性小體激活的程度影響小鼠模型中TB的嚴(yán)重程度[26]。

圖2 NLRP3炎性小體的活化Fig.2 NLRP3 inflammasome activation

ESX-1系統(tǒng)被認(rèn)為是Mtb致病性的一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)，缺乏ESX-1的突變株在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制有缺陷，并且實(shí)驗(yàn)小鼠的結(jié)核病癥狀顯著減輕。Mtb的毒力相關(guān)差異區(qū)域1(region of difference 1，RD1)基因編碼ESX-1系統(tǒng)的許多毒力因子，毒力因子釋放到受感染細(xì)胞使吞噬體膜破裂，而吞噬體膜破裂是Mtb胞質(zhì)逃逸的重要先決條件[27]。Mtb刺激巨噬細(xì)胞釋放成熟的IL-1β，而減毒的牛分枝桿菌BCG缺失RD1區(qū)，不能刺激巨噬細(xì)胞釋放成熟的IL-1β，說明ESX-1系統(tǒng)是NLRP3炎性小體活化的關(guān)鍵因素[17，28]。

ESX-1系統(tǒng)的各個(gè)組成部分如何協(xié)同工作以激活NLRP3炎性小體及產(chǎn)生一個(gè)完整的分泌機(jī)制還不完全清楚，其效應(yīng)蛋白的精確功能和性質(zhì)也不清楚。大多數(shù)關(guān)于ESX-1系統(tǒng)與免疫元件相互作用的研究都集中在6 kD早期分泌抗原靶(6 kD early secreted antigen target 6, ESAT6)和10 kD培養(yǎng)濾液蛋白(culture filter protein 10, CFP10)上，這兩種底物是Mtb免疫過程中結(jié)合T細(xì)胞的主要抗原[29]。這些蛋白質(zhì)以異二聚體的形式分泌，需在共分泌蛋白質(zhì)的輔助下通過分泌裝置[30]。ESAT-6具有膜通透性，通過其膜溶解能力激活NLRP3炎性小體[17，28]，ESAT-6缺失的細(xì)菌突變體感染能力明顯減弱[31]。除ESAT-6和CFP-10外，一些ESX-1分泌相關(guān)蛋白(ESX-1 secretion-associated proteins,Esp)被認(rèn)為是候選底物，與ESAT-6一起誘導(dǎo)宿主細(xì)胞裂解，有利于Mtb的維持。由于ESX-1在細(xì)菌效應(yīng)物向宿主細(xì)胞溶膠轉(zhuǎn)移中的重要性，其表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)包括炎性小體在內(nèi)的模式識(shí)別受體激活有強(qiáng)烈影響。

盡管ESAT-6是Mtb非常重要的毒力因子，但最近的研究表明，單獨(dú)ESX-1底物與宿主免疫反應(yīng)之間的相互作用比最初預(yù)期的更為復(fù)雜。例如，ESAT-6分泌減弱的各種減毒菌株(如H37Ra、DEspC、DEspA)仍然能夠刺激小鼠和人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β[32]。這表明其他ESX-1底物也可以在吞噬體膜上穿孔及誘發(fā)后續(xù)的炎性反應(yīng)，這些底物在Mtb侵染細(xì)胞中發(fā)揮的作用仍需要進(jìn)一步的研究。

除ESX-1，研究人員發(fā)現(xiàn)ESX-5在Mtb感染巨噬細(xì)胞后也可引起分泌IL-1β[33]。Mtb的 ESX-5突變株在體內(nèi)的生長(zhǎng)減慢，表明ESX-5可能也與Mtb的毒力有關(guān)[34]。ESX-5激活炎性小體的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

除了分泌系統(tǒng)分泌的相關(guān)蛋白外，研究還發(fā)現(xiàn)Mtb的雙鏈RNA可以使Caspase-1激活。將Mtb未處理的總RNA和RNase I(降解單鏈RNA)處理過的總RNA，RNase III(降解雙鏈RNA)處理過的RNA分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)未處理的總RNA和RNase I處理過的總RNA都可以使Caspase-1活化，但是未處理的總RNA和RNase I處理過的總RNA不能使Caspase-1活化，說明Mtb雙鏈RNA可以特異地使NLRP3炎性小體激活[35]。

3.2 Mtb感染對(duì)NLRP3炎性小體活化的抑制作用

在Mtb感染后，炎性小體的活化有助于細(xì)胞清除Mtb，限制Mtb的生存和遷移。但是在大多數(shù)情況下，感染不會(huì)導(dǎo)致疾病，因?yàn)檠堪麠U菌已經(jīng)進(jìn)化出逃避炎性小體活化的策略，與免疫反應(yīng)保持平衡，從而保持潛伏數(shù)十年[36]。機(jī)體對(duì)抗Mtb免疫反應(yīng)的一個(gè)標(biāo)志是肉芽腫的形成，肉芽腫內(nèi)一些被感染的細(xì)胞發(fā)生壞死，形成一個(gè)無細(xì)胞的中央?yún)^(qū)，Mtb在此處繼續(xù)留在肉芽腫內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb強(qiáng)毒株可能通過鋅離子依賴的金屬蛋白酶1(Zn-metalloprotease，Zmp1)和酪氨酸磷酸酶A(tyrosine phosphatase，Ptp A)調(diào)節(jié)宿主代謝，直接或間接抑制NLRP3炎性小體，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，Zmp1可以抑制吞噬體溶酶體的融合[37]和限制IL-1β的產(chǎn)生和激活，有助于Mtb的逃逸和增殖。通過用Zmp1缺失或減弱的Mtb感染巨噬細(xì)胞，觸發(fā)了NLRP3炎性小體的激活，導(dǎo)致IL-1β分泌增加，含Mtb的吞噬體成熟增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞對(duì)Mtb的清除增加，以及被氣溶膠感染的小鼠肺部載菌量降低[38]。通過使用不能抑制IL-1β產(chǎn)生的Zmp1 Mtb突變體，證實(shí)了在TB動(dòng)物模型中，吞噬體成熟的阻滯、Mtb細(xì)胞內(nèi)存活和完全毒力都依賴于Mtb對(duì)炎性小體激活的主動(dòng)抑制作用[38]。

Ptp A抑制宿主先天免疫信號(hào)通路。在細(xì)胞質(zhì)中，Ptp A抑制JNK/p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路[39]，JNK/p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而影響NLRP3 炎性小體組分的轉(zhuǎn)錄[40]。在吞噬體的成熟過程中，Ptp A可促進(jìn)吞噬體的組成通過質(zhì)膜分子再利用和依次獲得早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體和溶酶體相關(guān)分子發(fā)生改變，進(jìn)而抑制吞噬體與溶酶體的融合及吞噬體的酸化[41]，發(fā)揮對(duì)NLRP3炎性小體活化的抑制作用[42]。在細(xì)胞核中，Ptp A具有調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫、遷移、增殖等基因表達(dá)的作用[43]。Ptp A對(duì)NLRP3炎性小體活化的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

4 展 望

本文綜述了NLRP3炎性小體活化的機(jī)制及Mtb感染對(duì)NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用。通過在Mtb感染的不同時(shí)期，對(duì)NLRP3炎性小體進(jìn)行與Mtb感染相反的調(diào)控，可能對(duì)控制Mtb在體內(nèi)的侵染、增殖、遷移等起到有效的控制作用，從而有效控制結(jié)核病的發(fā)展。盡管在Mtb感染后NLRP3 炎性小體的活化研究目前已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但尚有很多問題亟需解決，包括NLRP3炎性小體在Mtb感染后參與調(diào)控的具體途徑，NLRP3炎性小體在Mtb感染后與其他信號(hào)通路之間的相互調(diào)控與聯(lián)系，以及NLRP3炎性小體在Mtb感染中具體的作用機(jī)制等。對(duì)Mtb感染期間NLRP3炎性小體活化的更全面了解將為結(jié)核的有效宿主導(dǎo)向治療或輔助治療提供新的潛在靶點(diǎn)。