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        野生二粒小麥NBS-LRR類抗病基因家族的鑒定及其表達(dá)分析

        2021-09-23 08:42:46聶小軍宋衛(wèi)寧
        麥類作物學(xué)報(bào) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)域元件基因組

        李 爽,高 英,楊 光,聶小軍,宋衛(wèi)寧

        (西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

        在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中,植物形成了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來抵抗環(huán)境中的真菌、細(xì)菌、病毒等病原物[1]??共』?R)可以直接或間接地通過基因和基因之間的相互作用特異性識(shí)別病原物,然后產(chǎn)生并傳遞脅迫信號(hào),引起防御響應(yīng),并激活下游通路[2]。因此,R基因在植物免疫系統(tǒng)和防御機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。大部分植物的R蛋白都含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine rich repeat,LRR),屬于NBS-LRR 基因家族。同時(shí),一些R基因蛋白也包含Toll-白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR,與果蠅Toll蛋白和哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1受體的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源)、卷曲螺旋(coiled-coil,CC)或亮氨酸鏈?zhǔn)?leucine zipper,LZ)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TM)、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(protein kinase domain,PK)等[3]。根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同,可以將R基因分為兩大類: NBS-LRR類和非NBS-LRR類[4]。 NBS-LRR類R基因在植物的R基因中占比最高,主要由高度保守的NBS和LRR兩部分組成,同時(shí)還含有P-loop、Kinase-2、Kinase-3、GLPL等4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)N端結(jié)構(gòu)的不同,NBS-LRR基因可以分為TIR類、CC(或LZ)類和non-motif類[5]。前人圍繞NBS-LRR類R基因已開展了大量研究,不僅在全基因組水平上對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析,而且多個(gè)重要的NBS-LRR類R基因已經(jīng)被成功克隆[6-7]。在小麥基因組中,共鑒定出400多個(gè)NBS-LRR類R基因[6],其中,大部分與抗條銹病相關(guān)。截止目前,從普通小麥及其近緣種中已成功克隆出9個(gè)R基因,其中有6個(gè)R基因具有種屬特異性抗性[8]。同時(shí),在全基因組水平鑒定和分析NBS-LRR類R基因家族已在多個(gè)植物中完成,包括擬南芥、烏拉爾圖小麥、向日葵等[9-13]。

        野生二粒小麥?zhǔn)瞧胀ㄐ←淎、B染色體組的供體,具有抗病、粒大、蛋白質(zhì)含量高等重要特征,對(duì)改良小麥的抗病性具有重要價(jià)值。雖然R基因家族在多個(gè)植物(包括小麥)中已有大量研究,但是目前有關(guān)野生二粒小麥R基因的研究還比較少。野生二粒小麥全基因組的破譯為從全基因組水平上鑒定其NBS-LRR類R基因家族提供了可能[14]。因此,本研究擬利用最新發(fā)布的野生二粒小麥基因組信息,通過生物信息學(xué)分析方法,在全基因組水平上對(duì)其R基因進(jìn)行鑒定,分析其成員間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,并利用RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行分析,以期為研究野生二粒小麥R基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ),也為利用野生二粒小麥R基因改良小麥抗病性提供一定參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        本試驗(yàn)所用野生二粒小麥品系A(chǔ)9由本實(shí)驗(yàn)室保存,白粉菌菌株E09由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院韓德俊教授提供。

        1.2 研究方法

        1.2.1 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因家族的鑒定

        從Ensemble數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)下載野生二粒小麥的基因組信息及其蛋白序列,構(gòu)建本地蛋白信息庫;然后,下載擬南芥、水稻和普通小麥中已知的R基因序列作為探查序列,使用本地BLASTP程序進(jìn)行搜索(E值<1e-5,一致性>50%,覆蓋度>50%);利用擬南芥和水稻中已鑒定的R基因序列構(gòu)建HMM模型,使用hmmsearch工具搜索本地蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫;將HMMER和BLASTP的結(jié)果合并,手工去除冗余后,將得到的序列提交到NCBI Batch CD搜索數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和PFAM數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)確認(rèn)結(jié)構(gòu)域的有無及其完整性,只保留具有完整NBS和LRR結(jié)構(gòu)域的基因作為候選R基因;在此基礎(chǔ)上,利用NCBI收錄的野生二粒小麥EST序列,對(duì)候選R基因比對(duì)映射,最后保留具有EST序列支持的基因作為最終的野生二粒小麥R基因集,用于下游分析。使用在線數(shù)據(jù)庫ExPASy中的pI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算預(yù)測(cè)的R蛋白的理論等電點(diǎn)(pI)和分子量(Mw)。

        1.2.2 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及序列特征分析

        利用ClustalX工具對(duì)鑒定到的NBS-LRR類基因的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì);利用MEGA 6.0軟件的NJ法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap值設(shè)為1 000,其他參數(shù)為默認(rèn)值。從Ensemble植物數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)中下載野生二粒小麥的基因組注釋信息gtf文件,使用perl腳本提取NBS-LRR類R基因的結(jié)構(gòu)信息,然后提交到Gene Structure Display Server(GSDS)網(wǎng)站(http:/gsds.cbi.pku.edu.cn/)上,構(gòu)建其內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)示意圖;使用MEME軟件(http://meme-suite.org)預(yù)測(cè)這些基因的蛋白結(jié)構(gòu)域和保守基序,預(yù)測(cè)基序數(shù)量設(shè)置為15個(gè),其他參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值。

        1.2.3 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因染色體定位及上游順式作用元件分析

        利用Tbtools提取鑒定到的所有NBS-LRR類R基因CDS序列上游的2 000 bp序列,利用PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/html/)預(yù)測(cè)其順式作用元件。

        1.2.4 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的表達(dá)模式分析

        為了初步明確這些NBS-LRR類R基因在不同組織和不同時(shí)期中的表達(dá)特性,從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫下載野生二粒小麥的RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)(SRA檢索序列號(hào)為:ERP022006),包括穎片、外稃、根、花(105和112 d)、籽粒(123和134 d)、葉(54和77 d);利用TopHat和Cufflinks軟件計(jì)算每個(gè)基因的FPKM值,然后使用R軟件中的heatmap包繪制熱圖。

        1.2.5 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的qRT-PCR分析

        隨機(jī)選擇4個(gè)野生二粒小麥NL類R基因(TRIDC1BG003060、TRIDC7BG071700、TRIDC- 5BG013030、TRIDC1BG002860)用于驗(yàn)證其在白粉菌侵染下的表達(dá)特性,根據(jù)其cDNA序列設(shè)計(jì)引物。將野生二粒小麥品系A(chǔ)9種植于營(yíng)養(yǎng)缽,并置于23±1 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光周期為16 h光照/8 h黑暗;當(dāng)植物長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí),接種白粉菌菌株E09,以未經(jīng)處理的幼苗作為對(duì)照。在處理后0、6、12、24、48和72 h收集處理及對(duì)照條件下的葉片,3次生物學(xué)重復(fù),液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱,備用;使用Plant RNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek,USA)提取樣品的總RNA,用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性;利用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒做qRT-PCR分析,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù),具體操作參考Lei等[15]的方法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因家族的鑒定結(jié)果

        利用BLASTP和HMMER工具搜索,并結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域以及EST序列驗(yàn)證,在野生二粒小麥基因組中共鑒定到429個(gè)可信度較高的NBS-LRR類R基因,約占總基因數(shù)的0.69%。序列特征分析發(fā)現(xiàn),野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的蛋白序列長(zhǎng)度為303~1 594 aa,蛋白分子量為33.38~177.68 kD,理論等電點(diǎn)為5.12~ 9.34,表明不同成員間具有較大的理化特性差異;進(jìn)一步對(duì)這些基因所包含的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)66個(gè)蛋白只含有NBS結(jié)構(gòu)域,屬于N亞家族;205個(gè)蛋白包含有CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)域,屬于CNL亞家族;76個(gè)蛋白具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域,屬于NL亞家族;79個(gè)蛋白具有CC-NBS結(jié)構(gòu)域,屬于CN亞家族;3個(gè)蛋白具有RPW8-NBS結(jié)構(gòu)域,屬于PN亞家族(表1)。

        2.2 野生二粒小麥NBS-LRR類NL亞家族R基因的染色體定位及系統(tǒng)發(fā)育分析

        鑒于NL亞家族R基因在植物抗病上的主要作用,主要以NL亞家族R基因?yàn)閷?duì)象,進(jìn)行進(jìn)一步的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),野生二粒小麥的76個(gè)NL亞家族基因在所有染色體上都有分布,其中6B染色體上最多,達(dá)到22個(gè),其次為1B、4A和6A染色體;同時(shí),還發(fā)現(xiàn)NL亞家族基因在染色體上呈現(xiàn)出成簇存在的特性,推測(cè)這可能是由于發(fā)生了大量的基因復(fù)制造成的。在A和B兩個(gè)同源染色體組之間,NL基因的數(shù)量差異不大,分別有37和39個(gè)。

        表1 野生二粒小麥以及其他部分植物NBS-LRR類R基因各亞家族成員的數(shù)量Table 1 Distribution of the subfamilies of NBS-LRR type R genes in wild emmer wheat and other plant species

        為了初步明確野生二粒小麥NL亞家族成員間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,進(jìn)一步將這76個(gè)基因的全長(zhǎng)蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,可將這76個(gè)NL亞家族基因劃分成6類,其中第Ⅰ類基因數(shù)目最多,有30個(gè),III類次之,有20個(gè),其余Ⅱ、IV、V和VI類分別有9、5、4和8個(gè)。

        2.3 野生二粒小麥NL亞家族R基因的蛋白結(jié)構(gòu)域與上游順式作用元件分析

        進(jìn)一步對(duì)這些NL蛋白上的蛋白結(jié)構(gòu)域基序進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果共預(yù)測(cè)到20個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域(圖2),其中基序2、13、15和18最為保守,位于基因的末端;所有的R基因均包含有基序2,基序4在R基因中一般連續(xù)重復(fù)出現(xiàn)。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化樹上聚為一類的基因通常也具有相同或相似的保守結(jié)構(gòu)域,推測(cè)親緣關(guān)系較近的蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能?;蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),這些NL亞家族基因大部分都包含1~3個(gè)內(nèi)含子,另外,包含的基序越多,它們的基因結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。

        上游順式作用元件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些NL亞家族基因啟動(dòng)子序列主要包含響應(yīng)植物激素、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)生物和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件(圖3)。其中,響應(yīng)植物激素的順式作用元件種類最多,有9類,包括TATC框(TATC-box)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif)、水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)等,并且所有基因均含有響應(yīng)植物激素的順式作用元件,除TRIDC3AG061190只包含TCA-element元件外,其余75個(gè)基因均含有2個(gè)以上的激素響應(yīng)元件,而且58個(gè)NL基因還含有與MeJA合成相關(guān)的CGTCA-motif和 TGACG-motif元件;脅迫響應(yīng)順式作用元件有5類,包括干旱誘導(dǎo)元件(MBS)、光響應(yīng)元件(ARE)和逆境防御響應(yīng)元件(TC-rich)等。說明NL亞家族基因在調(diào)節(jié)激素、環(huán)境脅迫響應(yīng)和耐受性方面存在廣泛的潛在作用。

        2.4 野生二粒小麥NL亞家族R基因的表達(dá)模式

        基于RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)野生二粒小麥NL亞家族R基因的表達(dá)特性進(jìn)行初步分析。結(jié)果(圖4)表明,部分基因表現(xiàn)出組織特異性,比如TRIDC1BG002710、TRIDC2AG002690、TRID-C2AG004570、TRIDC2 BG086110、TRIDC4AG070-760、TRIDC5BG 004360、TRIDC6BG001800、TRID-C6BG068140、TRIDC6BG073310、TRIDC7AG047320等10個(gè)基因都只在105 d的花瓣中表達(dá),且表達(dá)量非常高,這說明這幾個(gè)基因?qū)τ诨ò甑纳L(zhǎng)發(fā)育有重要作用。另外,在不同的組織中表達(dá)基因的數(shù)量均有差異,在穎片,外稃,根中分別有31、49和58個(gè)基因發(fā)生了表達(dá)。在花組織中,105 d有65個(gè)基因表達(dá),而112 d則只有41個(gè)基因表達(dá)。在籽粒中,123 d和134 d分別有38和53個(gè)基因表達(dá)。在葉組織中,54 d和77 d分別有48和52個(gè)基因表達(dá)。這些結(jié)果均表明,NL亞家族R基因在野生二粒小麥中發(fā)生了時(shí)空表達(dá)差異。

        2.5 部分NL類R基因表達(dá)特性的驗(yàn)證

        隨機(jī)選取4個(gè)NL類R基因(TRIDC1BG-003060、TRIDC7BG071700、TRIDC5BG013030和TRIDC1BG002860),對(duì)其在白粉菌侵染條件下的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如表2所示,這4個(gè)基因整體上均呈現(xiàn)先下降后上升的表達(dá)模式,在接種24 h內(nèi)它們的表達(dá)量都有下降,在接種48 h后其表達(dá)量明顯上升,其中TRIDC1BG002860在48和72 h時(shí),其表達(dá)量分別是對(duì)照的4.5和5.8倍。推測(cè)其原因可能是這些R基因參與了野生二粒小麥的抗病響應(yīng)過程。

        表2 4個(gè)NL亞家族R基因在白粉病侵染不同時(shí)間的表達(dá)量Table 2 Relative expression level of the four R genes belonging to NL subfamily under Bgt infection at different time

        3 討 論

        小麥?zhǔn)俏覈?guó)乃至全世界最重要的糧食作物之一,小麥的持續(xù)增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障世界糧食安全具有重要意義[16]。當(dāng)前,隨著全球氣候變化,小麥生長(zhǎng)過程中面臨著諸多挑戰(zhàn)(生物脅迫如病蟲害,非生物脅迫如干旱脅迫、鹽脅迫等)。但由于植物馴化和人工選擇的影響,大大限制了現(xiàn)代農(nóng)作物的遺傳多樣性,使得栽培小麥對(duì)脅迫更加脆弱和敏感。野生二粒小麥?zhǔn)瞧胀ㄔ耘嘈←湹囊吧壸嫦确N,具有粒大、蛋白含量高、抗病性強(qiáng)、耐逆性好等優(yōu)異性狀,并且野生二粒小麥具有豐富的遺傳多樣性。加強(qiáng)野生二粒小麥優(yōu)異性狀基因的挖掘與利用對(duì)提高小麥抗逆性以應(yīng)對(duì)各類脅迫和逆境具有重要意義,從而保障小麥生產(chǎn)水平和糧食安全[17]。

        NBS-LRR類R基因是植物抗病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用的重要基因,且大量的研究表明,其參與了小麥對(duì)多種病原菌的抗性反應(yīng)[1,18-19]。本研究基于野生二粒小麥的基因組數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)手段,對(duì)野生二粒小麥的NBS-LRR類R基因進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。通過對(duì)野生二粒小麥基因組的篩選和驗(yàn)證,剔除NB-ARC結(jié)構(gòu)不完整的基因,共鑒定到了429個(gè)野生二粒小麥NBS-LRR基因,豐富了麥類作物R基因資源。擬南芥基因組中有170個(gè)NBS-LRR類基因,其中TNL亞家族基因的數(shù)量為79個(gè),遠(yuǎn)多于CNL等其他亞家族基因[11],而在小麥[6,20]、水稻[21]、玉米[12]、狗尾草(Setariaitalica)[22]以及野生二粒小麥等單子葉植物中,CNL亞家族成員基因的數(shù)量最多,未鑒定到TNL亞家族基因,推測(cè)R基因在單子葉和雙子葉植物進(jìn)化過程中發(fā)生了明顯的分化。

        基因的結(jié)構(gòu)往往決定基因的功能。本研究發(fā)現(xiàn),野生二粒小麥NBS-LRR類基因結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單,外顯子為1~4個(gè),內(nèi)含子為1~3個(gè),這與栽培六倍體小麥[23]和烏拉爾圖小麥[11]中R基因的結(jié)構(gòu)特征類似。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),親緣關(guān)系越近的R基因具有更相似的保守結(jié)構(gòu)域組成,推測(cè)它們具有相似的功能,這與報(bào)道的其他物種中R基因的家族特征一致[11-12]。

        研究發(fā)現(xiàn),R基因可與多個(gè)抗病相關(guān)的基因互作,共同構(gòu)建植物抗逆機(jī)制網(wǎng)絡(luò)[24]。除此之外,R基因還廣泛參與了植物體內(nèi)諸多其他生物學(xué)過程,在生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)、逆境響應(yīng)等過程中發(fā)揮了一定作用[1,25]。在本研究中,基于RNA-seq的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),在野生二粒小麥的不同組織和生長(zhǎng)時(shí)期參與的R基因數(shù)量不同。進(jìn)一步深入研究這些特異表達(dá)的R基因的生物學(xué)功能,將為闡明R基因的更多調(diào)控功能及其作用機(jī)制提供重要信息。最后,本研究采用qRT-PCR的方法,對(duì)侵染白粉病的野生二粒小麥葉片中4個(gè)R基因的表達(dá)模式進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這4個(gè)R基因在白粉病的抗性響應(yīng)過程中表達(dá)量發(fā)生了變化,說明它們可能參與了野生二粒小麥對(duì)白粉菌的抗病應(yīng)答過程,但其具體生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

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