關(guān)淑仙，黃輝躍，汪仁全，王相權(quán)，王仕林，榮飛雪，楊杰智， 鐘光躍，周海燕，陳新媛，李 明，黃書盈

(四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川內(nèi)江 641000)

由于大多數(shù)育種單位多年的定向育種，導(dǎo)致小麥的遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，抵御風(fēng)險的能力逐漸下降[1-2]。評價材料的遺傳多樣性有利于小麥育種親本的選擇，從而避免使用同一骨干親本。在遺傳分析中，分子標記是常用的工具。這些分子標記能方便和快捷地跟蹤一些優(yōu)良性狀/基因，但是分子標記不能反映染色體區(qū)段的具體結(jié)構(gòu)變異。而植物染色體核型分析是研究植物染色體數(shù)量及結(jié)構(gòu)變異、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和物種起源與進化關(guān)系的重要方法，在植物育種中具有重要應(yīng)用價值[3-6]。近年來，在植物染色體核型分析中越來越多的研究采用某些克隆重復(fù)序列或寡核苷酸序列為探針，利用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)技術(shù)建立FISH核型圖。FISH技術(shù)是一種根據(jù)堿基互補配對原則，使帶有熒光物質(zhì)的探針與目標DNA接合，最后用熒光顯微鏡可直接觀察目標DNA所在的位置。近幾年利用FISH技術(shù)，在小麥染色體結(jié)構(gòu)變異和外源染色體識別方面已經(jīng)有很多報道[7-8]。利用寡核苷酸探針和FISH技術(shù)，可以反映不同小麥品種(系)的染色體結(jié)構(gòu)差異[9]。Tang等[10]利用寡核苷酸序列探針pTa535和pSc119.2，清晰地識別了小麥A、B和D基因組染色體，并建立了中國春的標準FISH核型圖。Huang等[9 ]利用一系列寡核苷酸序列探針，對373個栽培品種及骨干親本進行FISH分析，發(fā)現(xiàn)了大量的多態(tài)類型和結(jié)構(gòu)變異，并根據(jù)FISH核型對其進行分類。蒽 瑋等[11]通過對南麥號系列小麥品種進行FISH核型分析，明確了南麥號系列小麥品種及其親本的染色體結(jié)構(gòu)特點。因此，利用基于寡核苷酸探針的FISH技術(shù)，可以快速、方便地分析小麥親本及其衍生系的染色體結(jié)構(gòu)差異，進而跟蹤親本染色體結(jié)構(gòu)在衍生系中的變異情況。內(nèi)麥系列品種(系)是由四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的高產(chǎn)且高抗條銹病品種(系)，連續(xù)多年遴選為四川省及全國主導(dǎo)品種，在長江上游區(qū)廣泛種植，取得顯著的社會經(jīng)濟效益。本研究利用內(nèi)麥號系列品種(系)進行染色體核型分析，研究這些材料的染色體結(jié)構(gòu)變異情況，以期為小麥育種提供更為直觀的遺傳變異參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

21份普通小麥(AABBDD,2n=42)材料(表1)，均由四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育。中國春(CS)作為FISH核型的對照。

1.2 方 法

每份材料隨機選取5粒種子，置于濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，4 ℃過夜(約24 h)，露白后轉(zhuǎn)移到 23 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。待根長達到1～2 cm時剪取，用一氧化二氮密封處理4 h，之后用乙酸固定5～10 min，70%乙醇保存[13]。取根尖2～3 mm部分，在纖維素酶/果膠酶溶液(2∶1，w/w)中酶解，得到的懸浮液滴到載玻片上，于顯微鏡下鏡檢并拍照[12]。

熒光原位雜交過程參照Hao等[13]的方法進行，所有材料的FISH核型分析參照Tang等[9]的標準。利用TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)和6-FAM(6-carboxy-fluorescein)分別標記的寡核苷酸pTa535和pSc119.2作為探針(pTa535和pSc119.2探針能清晰識別普通小麥A、B和D基因組所有染色體)，對所有材料進行FISH核型分析。pTa535和pSc119.2兩種重復(fù)序列最初分別來源于普通小麥和黑麥。pTa535和pSc119.2兩種寡核苷酸探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 21份小麥材料和中國春的FISH分析

利用pSc119.2和pTa535探針對21份材料和中國春根尖細胞進行原位雜交分析，建立了FISH標準核型圖(圖1)。從pSc119.2的FISH帶型看，有5份材料(內(nèi)麥482、內(nèi)麥0821、內(nèi)麥919、內(nèi)麥071和內(nèi)麥854)含1RS/1BL易位染色體。這5份1RS/1BL易位系材料在之間的試驗中高抗條銹病，為今后培育高抗條銹病材料提供了新的育種資源。

所有材料的B基因組染色體以及2D和4D染色體上都有pSc119.2信號。A基因組染色體上的pSc119.2信號有7種類型：1、1A、2A、5A和6A染色體上均有pSc119.2信號(內(nèi)麥366); 2、4A、5A和6A染色體上均有pSc119.2信號(內(nèi)麥9號、杏麥2號、靖麥19、內(nèi)麥2889、內(nèi)麥836和內(nèi)麥316)；3、5A和6A染色體上均有pSc119.2信號(內(nèi)麥5348); 4、4A和6A染色體上均有pSc119.2信號(內(nèi)麥482)；5、4A和5A染色體上均有pSc119.2信號(中國春、內(nèi)麥561、內(nèi)麥919、內(nèi)麥071和內(nèi)麥673); 6、僅5A染色體上有pSc119.2信號(內(nèi)麥416、內(nèi)麥866和內(nèi)麥101)；7、僅4A染色體上有pSc119.2信號(內(nèi)麥0821、內(nèi)麥538、內(nèi)麥7538、內(nèi)麥854和內(nèi)麥5348)。以上結(jié)果說明，A基因組染色體遺傳變異較豐富，尤其是在5A染色體上。在D基因組中，pSc119.2信號還出現(xiàn)在1D(內(nèi)麥673和內(nèi)麥101) 和3D(內(nèi)麥482、內(nèi)麥0821、內(nèi)麥538、內(nèi)麥7538、內(nèi)麥854、內(nèi)麥510、內(nèi)麥561、內(nèi)麥919、內(nèi)麥071、內(nèi)麥673、內(nèi)麥416和內(nèi)麥866)染色體上。pSc119.2信號在1D、2D、3D和4D染色體的變異類型只有1～2種(圖2)，說明D基因組染色體遺傳變異低。所有B染色體上都有pSc119.2信號，但變異類型也只有1～2種(5B和6B染色體除外)(圖2)，說明B基因組染色體遺傳變異較低。pTa535在所有材料的D基因組染色體、除5A外的其他A基因組染色體以及3B、6B和7B染色體上分別有強、較強和弱信號。同時，在中國春和內(nèi)麥101的5A染色體長臂上有較強的pTa535信號。pSc119.2和pTa535探針信號表明，A基因組染色體有較高的變異，而B和D基因組染色體有較低的變異。所以在今后的育種過程中，選擇雜交親本時要注意B和D基因組染色體的遺傳變異，這樣才能豐富育成品種的遺傳多樣性。

表1 21份材料的來源及審定情況Table 1 Source and approval status of the 21 materials

2.2 21份小麥材料的FISH核型多樣性分析

在21份小麥材料中共鑒定出49種染色體多態(tài)類型(圖2)。A基因組染色體多態(tài)類型數(shù)量最多(22種)，其次是B基因組(14種)和D基因組(13種)。所有材料每條染色體上多態(tài)類型出現(xiàn)頻率最高的被認定為類型1(5A除外)，其頻率范圍為29%～100%，平均約83%。類型1是每條染色體上最占優(yōu)勢的類型。每條染色體上多態(tài)類型頻率次于類型1的被認定為類型2，頻率為 5%～38%，平均約19%。類型2是每個染色體上第二常見的類型，有一定的選擇優(yōu)勢。每條染色體除類型1和類型2外，其他多態(tài)類型頻率為5%～19%，平均約8%。這些較低頻率的染色體多態(tài)類型可能在適應(yīng)特定環(huán)境的品種中具有 優(yōu)勢。

在A基因組染色體中，5A和6A染色體分別有7種和4種變異類型，而其余染色體都不超過3種。在B基因組染色體中，5B染色體有4種變異類型，其余染色體都不超過3種。在D基因組染色體中，變異類型最高的是3D染色體(3種)，其余染色體的變異類型為1～2種(圖2)。以上結(jié)果表明，不同染色體的變異類型數(shù)量不一致，推測在育種過程中變異類型數(shù)量多的染色體在不斷進化，而沒有變異或者變異少的染色體比較保守。5B、6B、3D和7D染色體的同源染色體之間存在不對稱核型(圖2)。pSc119.2信號分別在一條5B染色體的長臂和一條6B染色體的短臂上消失，pTa535信號分別在一條3D染色體的長臂和一條7D染色體的短臂上消失。以上染色體的不對稱核型可能是由染色體結(jié)構(gòu)變異引起。

2.3 21份小麥材料的FISH核型分類

根據(jù)A、B和D基因組染色體的FISH核型類型，把21份材料分為16類(表2)。其中內(nèi)麥538、內(nèi)麥7538和內(nèi)麥510的FISH核型一致；靖麥19、內(nèi)麥2889和內(nèi)麥836的FISH核型一致；內(nèi)麥919和內(nèi)麥071的FISH核型一致。其他材料的FISH核型都不一致。內(nèi)麥538、內(nèi)麥7538與內(nèi)麥510的親本不同，但其FISH核型一致，這說明它們的雜交親本的遺傳背景可能相似。內(nèi)麥5348與內(nèi)麥101的親本相同，但其FISH核型卻不一致，說明親本一樣的衍生系后代在染色體結(jié)構(gòu)上可能會發(fā)生變異(表1和表2)。

3 討 論

3.1 染色體FISH類型的多態(tài)性

構(gòu)建植物染色體FISH核型圖，在植物的分類、進化以及育種研究中具有重要意義[14-15]。Huang等[9]根據(jù)373個小麥栽培品種及骨干親本的高清FISH核型，鑒定出167種染色體多態(tài)類型。同時在148個品種中發(fā)現(xiàn)14種染色體結(jié)構(gòu)變異類型，包括易位、倒位和缺失等。在染色體多態(tài)類型方面，本研究結(jié)果與Huang等[9]結(jié)果一致，多態(tài)類型的數(shù)量都是A基因組>B基因組>D基因組。本研究只發(fā)現(xiàn)49種染色體多態(tài)類型，可能是研究材料比較少的原因造成的。本研究只發(fā)現(xiàn)5B、6B、3D和7D染色體上均出現(xiàn)核型不對稱的現(xiàn)象。原因可能是所用探針只有pSc119.2和pTa535，而這兩個探針不能識別出更多的染色體的結(jié)構(gòu)變異。

3.2 FISH核型分類與遺傳背景的關(guān)系

FISH核型對小麥的分類以及親本的追溯起到重要作用[9,11]。本研究選取21份內(nèi)麥系列小麥品種(系)材料，根據(jù)它們的雜交親本了解雜交后代染色體結(jié)構(gòu)變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜交組合親本相同的后代品種FISH核型不一致，可能是由于染色體結(jié)構(gòu)變異造成的[11]；同時也發(fā)現(xiàn)，雜交組合親本不同的后代品種FISH核型一致，可能是親本FISH核型一致或者是遺傳背景相似[9]。21份材料根據(jù)A、B和D基因組染色體的FISH核型將這些材料分成了16類，說明這些材料遺傳多樣性較高，并且一些品種(系)有自己獨特的FISH核型[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這16類中很多只是在少數(shù)染色體(5A、6A、5B、6B和1D等)上有信號差異，同時每條染色體多態(tài)類型出現(xiàn)頻率最高的占比29%～100%，其他類型占比5%～38%(圖 2)，在育種過程中，一些染色體有選擇優(yōu)勢，而其他染色體較保守[9]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)ISH技術(shù)可以推測小麥品種系譜，反映染色體之間的交換重組關(guān)系。因此，可以建立內(nèi)麥系列小麥品種(系)染色體FISH核型，從染色體結(jié)構(gòu)水平來反映品種間的遺傳多樣性，從而推斷小麥品種(系)的演變過程。

表2 21份小麥材料A、B、D基因組的FISH核型類型Table 2 FISH karyotypes of A,B and D genomes of the 21 wheat materials

綜上所述，利用FISH技術(shù)可以反映小麥品種(系)的染色體結(jié)構(gòu)差異，進行染色體跟蹤，可以明確小麥染色體結(jié)構(gòu)組成及遺傳背景，為下一步的分子標記育種提供可靠的參考。