段曉晨，程起群

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

現代高通量測序技術的迅速發(fā)展，使得通過不同方式來獲得魚類基因信息的過程變得更加快捷高效，轉錄組測序的對象變得更加廣泛，精準率也得到了明顯提高。第二代測序技術出現后，魚類的轉錄組學研究達到了空前的熱度。但是，測序技術的迅猛發(fā)展也逐漸暴露出一些問題，魚類轉錄組學的發(fā)展面臨著新的挑戰(zhàn)，例如：缺乏大量的基因組信息、惡劣環(huán)境下的魚類樣本難以采集和有效保存、單細胞轉錄組測序技術應用少等。本文對轉錄組學技術的發(fā)展歷程及其在魚類研究中的應用概況進行了介紹，并對魚類轉錄組學的研究進行了總結與展望。

1 轉錄組與轉錄組學的含義

轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學等各種組學技術陸續(xù)出現，其中轉錄組學技術率先取得進步并被認為是應用最為深入的技術手段之一［1］。遺傳學的中心法則顯示：DNA上的一系列遺傳信息可以經由生物細胞內的信使RNA（mRNA）在各項程序的精密調控下傳遞給蛋白質。因此，科學家們認為，RNA在DNA與蛋白質之間承擔著生物信息傳遞的“紐帶”職能，而所有能夠進行表達的基因所轉錄出的RNA及其轉錄水平，綜合起來被稱為轉錄組（transcriptome）［2］。轉錄組最重要的特點是特定的時間性和空間性，轉錄組研究不僅反映了個體的特定組織在某種生長發(fā)育階段下基因的表達水平，還可以用來比較同一部位在不同生存環(huán)境下基因表達水平的不同，這正是由轉錄組所具有的時間特性和空間特性所決定的［3］。轉錄組分為廣義轉錄組和狹義轉錄組，其中細胞或組織所轉錄出來的RNA總和被稱為廣義轉錄組，細胞中參與翻譯蛋白質的所有mRNA的總和則被稱為狹義轉錄組［3］。而轉錄組學（transcriptomics）則是指一門在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規(guī)律的學科［1］。

2 轉錄組學技術的優(yōu)點

隨著生物個體所處生長發(fā)育階段的不同及其生理狀態(tài)與外界環(huán)境的改變，該生物個體的轉錄組信息也隨之而改變。因此，為了更完整地研究生物生長發(fā)育、應激免疫等生理作用機制，將轉錄組分析作為重要的研究途徑是必然的。通過對轉錄組圖譜的全面分析，能夠獲得如基因表達信息、反義轉錄本、可變剪接、差異表達基因和新基因等眾多信息［4］。相對于基因組分析而言，轉錄組分析的優(yōu)點除了所需要的花費大大減少以外，其針對性也相對更強，從轉錄組中篩選的遺傳標記可直接進行應用［5］。

轉錄組學技術具有許多優(yōu)點：

（1）靈敏度較高，因此可以檢測和定額痕量的RNA；

（2）不需預先得到所要研究物種的基因信息，因此適用于無參考基因序列的物種；

（3）獲得的數據豐富；

（4）能夠獲得細胞或組織中全部的RNA信息。通過將RNA反轉錄為cDNA的方式進行測序，開發(fā)大量的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記和微衛(wèi)星（simple sequence repeats，SSR）標記，并進行可變剪接的研究和定量分析［6－7］。

3 轉錄組學技術分類與流程

3.1 轉錄組學技術分類

由于轉錄組所具有的技術復雜性，一系列具有相應高通量的轉錄組學技術應運而生。轉錄組學技術主要包括以測序和雜交為基礎的兩類技術［4，8］，目前這兩類技術作為良好的研究工具均在魚類的轉錄組學研究中得到了普遍運用。

依據不同的原理，可以將轉錄組學技術劃分為兩類［9］，如表1所示。

表1 轉錄組學技術的分類及優(yōu)點Tab.1 Classification and advantages of transcriptomics technology

測序技術的進步促進了轉錄組學研究的快速發(fā)展。20世紀70年代末，SANGER等［14］發(fā)明了雙脫氧終止法，從而使DNA序列的高效測定成為可能，第一代測序技術由此誕生。第一代測序技術優(yōu)點很明顯，如讀長可達300～1 000 bp、準確度高、可對高重復序列進行測序。但是由于自動化水平較低、測序通量較低且對基因的定量存在一定的偏差，因此限制了其在轉錄組學研究中的應用［15］。

繼第一代測序技術得到普遍應用后，以第二代測序技術（next generation sequencing，NGS）為代表的高通量測序技術在魚類轉錄組研究領域得到了穩(wěn)步發(fā)展［16］。第二代測序技術的讀長最高為2×150 bp，彌補了第一代測序技術閱讀通量低、自動化程度低的缺陷，同時顯著地提高了測序速度并減少了測序成本［17－18］。目前在研究中應用較多的測序方法為第二代測序技術，然而第二代測序技術仍存在著諸多問題，如讀長相對較短，測序之后還需要復雜的拼接過程［19］。

近年來，隨著第三代轉錄組測序技術的興起，在很大程度上解決了第二代測序技術所存在的問題。第三代測序技術能夠做到單分子實時測序，而且測序過程中免除了PCR擴增步驟，除此之外，還具有超長的讀長功能。第三代測序技術在轉錄組學研究中可以更好地糾正錯誤拼接的基因，檢測選擇性剪切（alternative splicing）與多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA），鑒定長鏈非編碼RNA（lncRNA），鑒定新基因等［20］。

3.2 轉錄組學技術流程

轉錄組測序流程和項目分析的流程［8］如圖1所示。

圖1 轉錄組測序流程和項目分析的流程Fig.1 Transcriptome sequencing process and project analysis process

為了避免組織中RNA的降解，轉錄組測序流程中的樣本采集和處理需要快速完成，其關鍵步驟為：首先將RNA保存液按樣品量的5～10倍加入到凍存管中，然后將采集的生物樣本麻醉，待麻醉劑起作用后將樣本解剖，取出所需組織立即放入RNA保存液中（注意將組織切割成小于5 mm的小片），做好標記后置于4℃冰箱過夜，然后轉入－20℃冰箱，最后按照步驟提取RNA。

4 轉錄組學技術在魚類研究中的應用

高通量測序技術的快速發(fā)展，使通過不同途徑來獲得魚類基因信息的過程變得更加便捷高效，轉錄組測序范圍變得更加廣泛，精確率也得到了顯著的提高。研究者們可以從整體上集中對基因的功能、信號通路、基因的表達模式等方面進行全新的研究［11］。目前，轉錄組分析被廣泛應用于分析魚類發(fā)育生物學，研究包括化學脅迫、溫度脅迫等環(huán)境脅迫對基因表達的影響，研究生物的適應性進化等。

4.1 在魚類發(fā)育生物學研究中的應用

魚類遺傳育種、人工繁殖、動物胚胎與生殖工程等技術的發(fā)展和應用要求對魚類生殖細胞的發(fā)生、受精等過程進行更為深入地研究，因此運用轉錄組學技術開展魚類發(fā)育生物學各個領域的研究工作正在穩(wěn)步進行中。

袁靜［21］應用第二代測序技術對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）性腺發(fā)育的關鍵時期（孵化后5、30、90和180 d）進行高通量測序，發(fā)現在其性腺中共有21 334個基因得到表達，其中有21 006個基因在雌、雄性腺中均得到表達，有259個基因特異表達于雄魚性腺，而僅有69個基因在雌魚性腺中得到特異表達。該研究建立了當時尼羅羅非魚中最大的性腺轉錄組數據庫，轉錄組數據進一步證明雌激素對羅非魚的性別決定和維持有重要作用。CHAPMAN等［22］利用454焦磷酸測序法對條紋鱸（Morone saxatilis）的卵巢進行了研究，共得到230 151個表達序列。通過Blastx比對獲得的5 482個直系同源基因中，有4 120個得到GO（gene ontology）注釋，其中與繁殖和發(fā)育過程有關的基因超過 1 300 個。GUDBRANDSSON等［23］將轉錄組學分析運用到來自于不同群體的北極紅點鮭（Salvelinus alpinus）胚胎發(fā)育的4個階段，發(fā)現一些與生物途徑相關的基因表達量有差異，而和血液凝結與能量代謝相關的基因卻在鮭魚的不同群體中實現了差異性表達。何飛祥［16］利用RNA測序（RNA sequencing，RNA-Seq）技術對金錢魚（Scatophagus argus）發(fā)育成熟的精巢和卵巢進行高通量測序并構建了cDNA文庫，組裝獲得136 561個unigene，然后通過與數據庫比對后獲得大量注釋信息，通過篩選得到32 122個差異表達基因，其中在精巢中高表達的有11 156個，在卵巢中高表達的有20 966個。

4.2 在魚類受環(huán)境脅迫研究中的應用

不同的養(yǎng)殖環(huán)境會對魚類組織的生理生化水平造成不同程度的影響，分析魚類組織在環(huán)境脅迫下的轉錄組變化及其涉及到的調控機理可以揭示魚體針對不同環(huán)境改變所做出的生長發(fā)育、物質代謝、免疫調控及相關信號通路的響應。因此，轉錄組分析被廣泛應用于研究魚類基因表達受環(huán)境脅迫的影響領域。

王美垚［24］首先研究了降溫與升鹽的協(xié)同作用對刀鱭（Coilia nasus）（同種異名C.ectenes）幼魚腦組織轉錄組的影響，共得到4 721個差異表達基因，其中上調表達的基因有2 028個，下調表達的基因有2 693個，然后進一步分析得到差異最顯著的前十名GO注釋條目。結果顯示差異最顯著的基因主要涉及“突觸傳導”“神經信號傳導”等生物過程。李永娟［25］對熱激組的6尾虹鱒（Oncorhynchus mykiss）和對照組進行轉錄組測序，熱激組與對照組共獲得27 796個mRNA，其中兩個組共有24 012個，熱激組獨有2 332個，對照組獨有1 452個；以q-value＜0.05為臨界閾值，在受到熱應激后共有128個肝臟基因的表達水平出現明顯差異。這為進一步揭示虹鱒熱應激反應的分子調控機理及拓展有關基因在應對未來氣候變化中的運用奠定了大量數據基礎。朱婷芳等［26］采用Illumina Hiseq 4000平臺對大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）進行高通量測序后獲得該魚短時低氧脅迫相關的轉錄組數據，低氧脅迫處理組中累計獲得4 487個DEGs，其中包括2 507個上調的DEGs和1 980個下調的DEGs。其中低氧誘導組轉錄本的表達未發(fā)現顯著變化，而3－磷酸甘油醛脫氫酶和血管內皮生長因子基因轉錄本的表達則上調。

4.3 在魚類適應性進化研究中的運用

通過分子生物學手段研究生物的環(huán)境適應性及其遺傳與變異是進化生物學領域所面臨的機遇與挑戰(zhàn)，而轉錄組學技術提供了一種對生物體在不同狀態(tài)下基因的差異表達狀態(tài)進行深入探究的工具。因此，轉錄組分析近年來也應用于研究魚類的適應性進化方面。

JEUKENS等［27］利用RNA-Seq技術研究了短小型和正常鯡形白鮭（Coregonus clupeaformis）的轉錄組變化，結果顯示正常鯡形白鮭高表達的基因主要集中在蛋白質的合成途徑，而短小型高表達的基因主要位于免疫、DNA復制和修復等過程。俞孟超［28］選擇分布于不同海拔的兩種裂腹魚類，軟刺裸鯉（Gymnocypris dobula）和怒江裂腹魚（Schizothorax nukiangensis），同生活在平原的鯉科魚類斑馬魚（Danio rerio）作比較分析，應用Illumina平臺進行轉錄組測序，獲得兩種裂腹魚類共8個組織的測序原始reads，對預測的編碼基因進行注釋，共計得到11 007個單拷貝直系同源基因以用于后續(xù)的進化分析。結果顯示，環(huán)境改變使裂腹魚類發(fā)生了快速進化，且兩種裂腹魚對高原的適應機制可能是不同的。趙胤丞［29］運用二代測序技術對軟鰭金線鲃（地表種）（Sinocyclocheilus malacopterus）和犀角金線鲃（洞穴種）（S.rhinocerous）進行了腦組織轉錄組測序，篩選得到的20 344個差異表達基因中，顯著差異表達基因有3 289個；其中顯著下調表達基因有2 598個，顯著上調表達基因有691個。研究結果表明，洞穴種犀角金線鲃的腦在適應性進化過程中扮演著重要的角色。

4.4 在魚類免疫學研究中的運用

高密度養(yǎng)殖是人工養(yǎng)殖的重要特點，然而魚類病害卻制約著水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。為了減少經濟損失，轉錄組學技術也應用到了魚類的免疫學研究中。目前轉錄組學在魚類免疫方面的研究主要集中在魚類被寄生蟲、細菌或病毒感染前后的免疫相關基因的差異表達和分子標記物的發(fā)現等方面。

杜光迅［30］對采自黃海海域的水樣進行了菌種篩選，最終篩選出一株殺蟲活性最強的菌株，在得到該細菌全基因組的基礎上，對不同培養(yǎng)時間的該細菌轉錄組進行了分析，預測到大量差異表達基因。此研究對開發(fā)用于治療大菱鲆（Scophthalmus maximus）盾纖毛蟲病的安全藥劑起到了促進作用。劉凱［31］利用RNA-Seq技術對感染異尖線蟲（Anisakis）后的長江刀鱭肝臟組織進行測序分析。然后對原始數據進行過濾、組裝后共獲得62 604條Unigene，運用GO和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書，用來指一種分析基因產物生物細胞中的代謝途徑的方法）等生物信息學方法對其進行注釋分析并預測其功能，共獲得961個差異表達基因，包括545個上調基因和416個下調基因。張明洋［32］采用高通量測序技術開展類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）感染對鱘脾臟轉錄組和腸道菌群結構的影響研究，發(fā)現類志賀鄰單胞菌感染可導致鱘脾臟和腸道轉錄組發(fā)生改變，其中有14 069個為脾臟差異表達基因，包括10 099個上調基因和3 970個下調基因；有16 091個為腸道差異表達基因，包含12 828個上調基因和3 263個下調基因。該研究得到的大量數據可為鱘魚類志賀鄰單胞菌感染的預防與控制提供科學依據。吳霆［33］通過轉錄組學分析發(fā)現異育銀鯽（Carassius auratus gibelio♀×Cyprinus carpio var.Singuonensis♂）感染CyHV-2后的頭腎中顯著上調基因有3 090個，而顯著下調基因有3 995個，KEGG信號通路分析進一步發(fā)現上調基因主要富集在單純皰疹病毒感染信號通路和壞死性凋亡等免疫相關信號通路中。

5 總結與展望

以第二代測序技術為代表的高通量測序技術得到廣泛應用后，轉錄組學領域獲得快速發(fā)展。例如對于癌癥治療來說，目前已經逐步進入了精準治療時代，即根據癌癥患者的基因組特征和轉錄組特征來精準指導用藥，這種治療模式因其無創(chuàng)性和精準性獲得了醫(yī)生和患者的青睞。對于新型冠狀病毒的研究，可以對其基因組進行測序分析，根據不同病毒亞型之間的基因組差異來做進化分析，對病毒的發(fā)生進行溯源并區(qū)分不同亞型的毒性強弱等，甚至對疫苗研究也有一定的指導意義。近年來，轉錄組學技術相繼應用到魚類的發(fā)育生物學、環(huán)境脅迫、適應性進化和免疫生物學等領域中，得到大量的基因差異表達和結構功能信息，對深入研究魚類的生長發(fā)育、病蟲害和遺傳進化等起到了重要作用。

與此同時，現階段轉錄組學在魚類研究中面臨的問題與挑戰(zhàn)也是不容忽視的。第一，與人類和其他主要農作物相比，魚類轉錄組學研究在轉錄組學研究領域還相對落后。尤其是魚類種類龐雜，缺少大量的基因組信息，這就給基因注釋造成了困難。第二，我國幅員遼闊、生物資源豐富，高海拔地區(qū)和其他極端環(huán)境中也存在多種魚類，然而由于環(huán)境惡劣，魚類的樣本采集和有效保存都存在著巨大問題。第三，當前魚類轉錄組學方面的研究很少應用單細胞轉錄組測序技術，基本上仍是用魚類的整個組織或器官，然而魚類的基因表達情況在不同的細胞行使的功能是不同的。

未來魚類的轉錄組學研究趨勢，首先要擴大魚類轉錄組學的研究領域，進一步發(fā)展和豐富魚類的基因組信息。除此之外，要增強對極端環(huán)境中魚類的了解，解決目前普遍存在的如何有針對性地采集組織樣品進行專項研究以及如何妥善保存樣品并應用到以后的科學研究等方面的問題。隨著單細胞轉錄組測序技術取得突破性進展和成本的逐步下降，采取單細胞轉錄組測序方法能夠具體研究不同細胞中基因的表達狀態(tài)，從而減少誤差發(fā)生；但僅僅應用轉錄組學這一種組學技術尚存在一定的局限性，因此轉錄組測序技術與基因組學、甲基化組學、代謝組學以及蛋白質組學等方法結合的策略應當被廣泛應用，多組學聯(lián)合分析是轉錄組學研究發(fā)展的重要方向。

綜上所述，轉錄組學技術為魚類生長發(fā)育、抗病免疫等方面提供了一種嶄新的研究手段，并因其高靈敏度和較低的成本等優(yōu)點得到了眾多研究者的青睞。盡管轉錄組學技術在魚類的研究中尚存在一定的局限性，但隨著測序技術的進步和單分子測序技術的發(fā)展，轉錄組也與基因組、代謝組等組學進行多組學聯(lián)合分析，這將為更加深入地研究魚類生長發(fā)育、適應性進化、抗病免疫和遺傳育種等創(chuàng)造條件。