石桃雄，趙佳利，田 桃，陳慶富，鄧 嬌

(貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州貴陽 550001)

0 引言

蕎麥?zhǔn)且环N廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill.)的雙子葉小雜糧作物，甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtataricumGaertn.)是其常見的兩個栽培種[1]?？嗍w含有豐富的多酚化合物、類黃酮和不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，能夠降低膽固醇、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)高血壓、抗炎和治療糖尿病等[2,3]。此外，苦蕎還含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多種維生素和纖維素等成分，是谷類作物中唯一具有七類營養(yǎng)物質(zhì)的作物[4]。因此，苦蕎是一種很好的藥食兩用作物，具有非常高的藥用價值和營養(yǎng)價值，且具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力，能帶來良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)[3,5,6]。

花期是植物生命周期中一個十分重要的發(fā)育階段，對經(jīng)濟(jì)作物的生態(tài)適應(yīng)性、產(chǎn)量和品質(zhì)等有著非常重要的影響?？嗍w花期的早晚與產(chǎn)量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[7]，因此研究蕎麥開花的調(diào)控機(jī)理對提高苦蕎產(chǎn)量至關(guān)重要。據(jù)報道，植物CCT(即CO、COL和TOC1)轉(zhuǎn)錄因子家族具有調(diào)控花期、生物鐘和響應(yīng)光周期等功能[8,9]。此外，CTT基因還通過激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與抵抗干旱、鹽、高溫、低溫等非生物性脅迫，減少這些非生物性脅迫對植物造成的危害[10,11]。因此CCT基因在植物的生長發(fā)育及抗逆境脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。

CCT基因編碼的蛋白都含有CCT結(jié)構(gòu)域，是由CO-LIKE蛋白、CONSTANS (CO)蛋白和TIMING OF CABl (TOCl)蛋白的C末端的43個保守的氨基酸殘基組成[12]。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的不同，CCT基因家族分為3個亞家族，分別為CONSTANS-like(COL)亞家族、CCTmotif (CMF)亞家族和PRR亞家族。COL亞家族所編碼蛋白均包含1-2個B-box結(jié)構(gòu)域和1個CCT結(jié)構(gòu)域，CMF亞家族所編碼蛋白僅含有1個CCT結(jié)構(gòu)域，而PRR亞家族所編碼蛋白均含有1個CCT結(jié)構(gòu)域和1個Receiver-like (REC)結(jié)構(gòu)域[13]。目前，CCT基因家族已在擬南芥[14]、水稻[8]、小麥[11]、玉米[15]和毛竹[16]等多個物種中被報道。擬南芥的CCT基因家族有40個成員，其中CO基因是最先被發(fā)現(xiàn)的，它在長日照條件下能促進(jìn)開花，突變后擬南芥表現(xiàn)出晚花性狀[17]；TOC1基因通過晝夜節(jié)律調(diào)控開花光周期[18]；COL1基因在抵抗鹽、干旱和溫度等非生物脅迫中起到重要作用[14]。水稻中有41個CCT基因，最新研究發(fā)現(xiàn)至少有18個成員參與了水稻的開花過程，其中有4個新發(fā)現(xiàn)的成員參與抽穗期的調(diào)控；3個基因OsCCT22、OsCCT38和OsCCT41表現(xiàn)出在長日照條件下抑制開花，在短日照條件下促進(jìn)開花的作用，而OsCCT03在長、短日照條件下均能促進(jìn)水稻開花[8]。玉米中的CCT基因家族成員比其他物種稍多，共有57個，其中有15個成員與花期顯著相關(guān)[15]，而且ZmCOL3基因?qū)﹂_花、莖節(jié)數(shù)、總?cè)~片株高和穗位高均有影響，呈現(xiàn)出多功能的特點[19]。

在模式植物和大宗作物中CCT基因家族調(diào)控花期的研究報道已有不少，但在蕎麥中還未見報道。本研究利用生物信息學(xué)工具對苦蕎CCT基因家族進(jìn)行全基因組范圍的鑒定，并對其理化特性、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式等進(jìn)行分析，擬為進(jìn)一步探究苦蕎CCT基因家族功能，并利用該基因家族改良蕎麥品種奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苦蕎基因組中CCT基因的篩選及理化性質(zhì)分析

苦蕎品種‘cv.Pinku1’ 的基因組測序數(shù)據(jù)及其注釋信息均從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載(http://www.mbkbase.org/Pinku1/)。從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR (https://www.arabidopsis.org/)下載CCT基因家族序列作為本地BLAST的參考序列(query序列)。運(yùn)用TBtools(v1.082)軟件進(jìn)行BLAST比對，得到苦蕎CCT基因家族候選序列。再運(yùn)用 Conserved Domain Database (CDD)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structu- re/bwrpsb.cgi)對這些CCT基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，從候選序列中篩選出含有CCT結(jié)構(gòu)域的序列，確認(rèn)為苦蕎的CCT基因家族成員。

運(yùn)用ExPaSy提供的在線Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)，分析苦蕎CCT基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括氨基酸殘基的個數(shù)、相對分子量、等電點和親水性等。

1.2 CCT基因染色體分布

運(yùn)用TBtools (v1.082)軟件繪制苦蕎CCT基因在染色體上的分布圖并對其進(jìn)行共線性分析。

1.3 CCT基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域分析

首先運(yùn)用MEME在線工具(http://meme-suite.org/)分析苦蕎CCT蛋白的氨基酸序列的保守基序，基序個數(shù)設(shè)置為10個；然后用TBtools(v1.082)軟件將預(yù)測結(jié)果xml文件進(jìn)行可視化；最后利用TBtools(v1.082)軟件分析苦蕎CCT基因結(jié)構(gòu)，并利用CDD數(shù)據(jù)庫分析CCT基因保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 CCT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 7.0軟件的Cluster W程序?qū)嗍w和擬南芥的CCT基因家族進(jìn)行多序列比對，采用Neighbor Joining (NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 苦蕎CCT基因的表達(dá)分析

采用Zhang等[20]發(fā)表的苦蕎‘cv.Pinku1’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)4種組織(根、莖、葉和花)中的FPKM值，利用TBtools(v1.082)軟件繪制CCT基因表達(dá)水平的熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎CCT基因家族成員的鑒定及在染色體的定位

以擬南芥40個CCT基因家族成員為參考序列，并結(jié)合CCT基因家族特有的CCT結(jié)構(gòu)域，在苦蕎基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出35個CCT基因家族成員。染色體定位分析表明，苦蕎35個CCT基因在8條染色體上均有分布，其中7號染色體上分布的CCT基因數(shù)目最多，有9個；其次是8號染色體上，分布了8個成員(圖1)。分別有5個、4個和3個CCT基因定位在2號、1號和5號染色體上。3號、4號和6號染色體上各分布了2個CCT基因。共有8對CCT基因發(fā)生片段復(fù)制現(xiàn)象(圖1)，分別為FtPinG0006138300.01.T01和FtPinG0004072200.01.T01、FtPinG0004072200.01.T01和FtPinG0009564600.01.T01、FtPinG0009564600.01.T01和FtPinG0003531700.01.T01、FtPinG0001582600.01.T01和FtPinG0004578000.01.T01、FtPinG0008789300.01.T01和FtPinG006802300.01.T01、FtPinG0008422500.01.T01和FtPinG0007624400.01.T01、FtPinG0007624400.01.T01和FtPinG0004084100.01.T01以及FtPinG0004084100.01.T01和FtPinG0008422500.01.T01。

圖1 苦蕎FtCCT基因在染色體上的分布及片段復(fù)制

2.2 苦蕎FtCCT系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域

系統(tǒng)發(fā)育分析可將苦蕎35個CCT基因分成三大類(圖2a)，共含有10個保守基序(圖2b)。第Ⅰ類包含了大部分成員，共26個，又可細(xì)分為4小組：第1小組有10個CCT基因，除FtPinG0004084100.01.T01和FtPinG0007042800.01.T01只含有Motif 1，其他都含有Motif 1和Motif 8；第2小組含4個成員，除FtPinG0005510100.01.T01缺少Motif 10，其他3個都具有4個Motif (Motif 1、Motif 5、Motif 6、Motif 10)；第3小組由4個CCT基因組成，其中FtPinG0005690000.01.T01只含有Motif 1，其他3個含有Motif 1 和Motif 2；第4小組由8個成員組成，其中FtPinG0006138300.01.T01僅含有Motif 1，F(xiàn)tPinG0006374000.01.T01含有Motif 1、Motif 2，其他6個CCT基因由Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 9 組成。第Ⅱ類由6個CCT基因組成，其中2個CCT基因僅含有Motif 7，2個含有Motif 1和Motif 7，還有2個含有Motif 1、Motif 2和Motif 7。第Ⅲ類只有3個CCT基因成員，都含有Motif 1、Motif 5和Motif 10 (圖2a,b)。

35個苦蕎CCT基因中，6個CCT基因(FtPinG0004084100.01.T01、FtPinG0007042800.01.T01、FtPinG0005690000.01.T01、FtPinG0006138300.01.T01、FtPinG0009634400.01.T01和FtPinG0004756400.01.T01)只含有1個基序，其他29個CCT基因含有2-4個基序(圖2a,b)。除了兩個成員(FtPinG0009634400.01.T01和FtPinG0004756400.01.T01)不具有Motif 1,其他33個CCT基因成員都具有Motif 1，占比達(dá)到94%；12個CCT基因成員具有Motif 2的基因，比例為34%。這說明Motif 1和Motif 2可能為苦蕎CCT基因家族最保守的基序(圖2b)。在Pfam數(shù)據(jù)庫中(http://pfam.xfam.org/)，Motif 1被注釋為CCT結(jié)構(gòu)域，Motif 2和Motif 4被注釋為B-box結(jié)構(gòu)域，Motif 3和Motif 6被注釋為和調(diào)節(jié)信號響應(yīng)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，Motif 5被注釋為GATA zinc finger，Motif 10被注釋為tify結(jié)構(gòu)域，Motif 7、Motif 8和Motif 9的注釋未知。

圖2 苦蕎FtCCT基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(a)、保守基序(b)及基因結(jié)構(gòu)(c)

苦蕎的35個CCT基因內(nèi)含子數(shù)目為1-8，其中FtPinG0005619800.01.T01含有的內(nèi)含子數(shù)目最多，有8個；其次是FtPinG0005184600.01.T01、FtPinG0007821700.01.T01和FtPinG0002597300.01.T01(均位于第Ⅰ類第2小組中)，均含有7個內(nèi)含子(圖2c)，9個CCT基因成員只有1個內(nèi)含子。

苦蕎CCT基因家族所編碼蛋白中含有5種主要的保守結(jié)構(gòu)域，分別是CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC (圖3)，其中CTT結(jié)構(gòu)域在所有苦蕎CCT基因編碼蛋白中都有出現(xiàn)，說明該結(jié)構(gòu)域在植物進(jìn)化過程中高度保守?？嗍wCCT基因家族中的CMF亞家族的成員最多(18個)，此亞族所編碼的蛋白都含有1個CCT結(jié)構(gòu)域，其中還有3個含有tify結(jié)構(gòu)和Znf-GATA結(jié)構(gòu)域，并且這3個蛋白的大小相似；COL亞家族由13個CCT基因組成，所編碼蛋白中除了4個成員只含有1個B-box和1個CCT結(jié)構(gòu)域外，其他成員都含有2個B-box和1個CCT結(jié)構(gòu)域；PRR亞家族中的CCT基因數(shù)目最少，只有4個，所編碼蛋白由1個CCT和1個REC結(jié)構(gòu)域組成。

圖3 苦蕎FtCCT基因家族保守結(jié)構(gòu)域

2.3 苦蕎FtCCT基因家族的理化性質(zhì)

對35個FtCCT基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析表明，CCT基因家族編碼的蛋白質(zhì)含有117-753個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為4 082.90-82 741.52 Da，預(yù)測的理論等電點為4.96-9.51，且以偏酸性和中性居多。預(yù)測的苦蕎CCT基因家族蛋白質(zhì)的親水指數(shù)均為負(fù)值，表明蛋白質(zhì)均屬于親水性蛋白，其中以FtPinG0007624400.01.T01的親水性最強(qiáng)，平均親水指數(shù)為-9.180 (表1)。

表1 苦蕎FtCCT基因家族的理化性質(zhì)

續(xù)表1

2.4 苦蕎FtCCT基因家族進(jìn)化分析結(jié)果

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)苦蕎和擬南芥CCT基因家族成員可分為三大類：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(圖4)。其中，Ⅰ類中的基因數(shù)目最豐富，由29個擬南芥CCT基因和22個苦蕎CCT基因組成，可以進(jìn)一步分為 ⅠA和 ⅠB兩個亞類；Ⅱ類包含8個擬南芥和10個苦蕎的CCT基因成員；Ⅲ類中擬南芥和苦蕎各3個CCT基因成員。

根據(jù)姚新轉(zhuǎn)等[21]對擬南芥CCT基因家族的分類方法，可以將苦蕎的35個CCT基因家族分為COL、CMF和PRR 3個亞家族(圖4)，與圖3的結(jié)果基本一致。其中CMF亞家族包含了分布在進(jìn)化樹上的Ⅱ類和Ⅲ類中的全部CCT成員，以及IA和IB兩個亞類中的小分支；COL亞家族主要分布在進(jìn)化樹中的IA亞類以及IB亞類中的一個分支上；PRR亞家族由IB的一個分支組成。

圖4 苦蕎和擬南芥CCT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化

2.5 苦蕎CCT基因家族在組織中的表達(dá)模式

苦蕎35個CCT基因在根、莖、葉和花4個組織中的表達(dá)模式如圖5所示，有5個CCT基因在根中表達(dá)水平高，推測可能與根的生長發(fā)育調(diào)控有關(guān)；只有1個CCT基因在莖中顯著高表達(dá)，推測其可能參與莖的生長發(fā)育過程。在葉中表達(dá)水平較高的CCT基因的數(shù)目較多，而且大多數(shù)是CMF亞家族成員，他們可能參與葉的生長發(fā)育與光形態(tài)建成。在花中表達(dá)水平較高的CCT基因的數(shù)目也較多，主要是COL和CMF亞家族成員，這些基因可能參與調(diào)控開花過程，比如開花時間、花期長短等。

圖5 苦蕎CCT基因家族在不同組織中的表達(dá)模式

3 討論

植物CCT基因家族在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和抗逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用，并且大多數(shù)成員參與開花調(diào)控，與作物的產(chǎn)量也息息相關(guān)[8,16,22,23]。本研究在全基因組水平上共鑒定到35個苦蕎FtCCT基因，數(shù)目與其他物種相差不大，含有1-8個內(nèi)含子(圖2)。這些苦蕎CCT蛋白等電點為4.96-9.51，絕大多數(shù)以酸性為主，均為親水性蛋白(表1)。35個苦蕎FtCCT基因在8條染色體上均有分布，且8對FtCCT基因發(fā)生了片段復(fù)制事件(圖1)。片段重復(fù)在CCT基因家族成員的擴(kuò)增中可能起著重要的作用，推測這些同源性較高的復(fù)制基因具有相似的生物學(xué)功能?？嗍wCCT蛋白與其他物種一樣含CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC等5種主要的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。所有的苦蕎CCT蛋白都含有CCT結(jié)構(gòu)域，說明該結(jié)構(gòu)域在植物進(jìn)化過程中高度保守。

為更好地了解苦蕎FtCCT基因家族成員的分類和可能具有的功能，本研究將40個擬南芥AtCCT家族成員與35個苦蕎FtCCT家族成員進(jìn)行蛋白序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，兩者的CCT基因具有較高的同源性，說明CCT基因在物種間比較保守，可能具有相似的功能。根據(jù)姚新轉(zhuǎn)等[21]對擬南芥AtCCT基因家族的分類方法，苦蕎的35個FtCCT基因家族也可以分為COL、CMF和PRR 3個亞家族，且CCT基因家族的功能可能與Motif以及結(jié)構(gòu)域相關(guān)。Putterill等[17]研究表明，擬南芥的AtCO基因(At15840.1)屬于COL亞家族，具有促進(jìn)開花的功能，苦蕎中兩個AtCO同源基因FtPinG0008999600.01.T01和FtPinG0009408600.01.T01在花組織中具有較高的表達(dá)水平(圖5)，因此推測FtPinG0008999600.01.T01和FtPinG0009408600.01.T01可能具有相似的功能，并且苦蕎的COL亞家族的12個成員中有7個在花組織中高表達(dá)(圖5)，這與擬南芥的COL亞家族中的大部分成員參與擬南芥開花時間的調(diào)控一樣[18]。屬于擬南芥PRR亞家族的TOC1被報道影響晝夜節(jié)律[24]，苦蕎中的同源基因FtPinG0005510100.01.T01可能也參與生物鐘的調(diào)控。PRR亞家族的4個成員中有2個在花中高表達(dá)，在根和葉中各有1個表達(dá)水平較高(圖5)，因此，不同的成員可能對不同組織的生長發(fā)育起著調(diào)控作用。CMF亞家族對谷類作物的馴化和適應(yīng)起著重要作用，且對開花起著抑制作用[25,26]，而苦蕎中的CMF亞家族的成員最豐富，其中有8個成員在葉中高表達(dá)，有6個在花中高表達(dá)，還有少數(shù)成員在根和莖中具有較高的表達(dá)水平，這些基因可能調(diào)控不同組織的生長發(fā)育。因此，苦蕎CCT基因家族中的有些成員可能與擬南芥的同源基因具有相似的功能，而特異的Motif和結(jié)構(gòu)域可能是不同亞家族成員之間功能差異的主要原因。

4 結(jié)論

植物CCT基因家族在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、花期和抗逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用。本研究在全基因組水平上共鑒定出35個苦蕎CCT基因，在8條染色體上均有分布?？嗍wCCT基因編碼的蛋白的等電點為4.96-9.51，絕大多數(shù)以酸性為主，均為親水性蛋白。基于CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC等5種主要的保守結(jié)構(gòu)域，將苦蕎的CCT基因家族劃分為CMF、COL和PRR 3個亞家族?？嗍w和擬南芥CCT基因具有較高的同源性。在葉和花中高表達(dá)的CCT基因數(shù)目較多，推測這些基因可能參與了生長發(fā)育、光形態(tài)建成或開花調(diào)控過程。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步探究苦蕎CCT基因家族功能，以及利用該基因家族改良蕎麥花期奠定了基礎(chǔ)。