鄭嬌鳳，王磊，胡英，郜發(fā)寶

四川大學華西醫(yī)院放射科，四川 成都 610041；*通信作者 郜發(fā)寶 gaofabao@wchscu.cn

心肌肥厚分為生理性肥厚和病理性肥厚，生理性心肌肥厚是無害的，甚至是有益的；病理性心肌肥厚可以由多種因素引起，如肥厚性心肌病[1]、高血壓[2]、心肌淀粉樣變[3]等。病理性心肌肥厚在心臟重構(gòu)中具有關(guān)鍵作用，并且是心律失常、心肌纖維化、心力衰竭等不良心血管事件的獨立危險因素[4-5]，其特征是收縮和舒張功能受損，與心肌細胞凋亡和纖維化增加有關(guān)。因此，對于病理性心肌肥厚，積極診斷并采取有效的治療措施，延緩甚至終止疾病進展惡化至心臟重構(gòu)及心力衰竭，減少并發(fā)癥、改善預(yù)后非常重要。

心臟磁共振（cardiac magnetic resonance，CMR）是一種非侵入性檢查，具有超高的時間、空間分辨力和極高的圖像對比度、清晰度，已成為評估心臟結(jié)構(gòu)及功能的影像學“金標準”[6-7]。CMR后處理技術(shù)，磁共振組織追蹤成像（magnetic resonance tissue tracking，MR-TT）能夠通過評估徑向應(yīng)變（radial strain，RS）、周向應(yīng)變（circumferential strain，CS）及縱向應(yīng)變（longitudinal strain，LS）等主要功能參數(shù)，反映心肌的收縮功能狀況[8-10]。當發(fā)生病理性心肌肥厚時，通過心肌應(yīng)力分析可以發(fā)現(xiàn)心肌應(yīng)力減低[3,11]。

異丙腎上腺素可作用于β腎上腺素能受體，引起病理性心肌肥厚[12-13]，是誘導左心室心肌肥厚動物模型的理想選擇。因此，本研究利用異丙腎上腺素構(gòu)建大鼠早期左心室心肌肥厚動物模型，利用CMR檢查及其后處理技術(shù)MR-TT，得到心臟結(jié)構(gòu)、心功能及心肌形變參數(shù)，探討MR-TT在左心室心肌肥厚評估中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 左心室心肌肥厚動物模型建立 共納入30只雄性SD大鼠，隨機分為對照組10只和實驗組20只，體質(zhì)量200～220 g，SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于四川大學華西科技園SPF級動物房，按國家實驗動物飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)。本研究獲得四川大學華西科技園動物實驗中心倫理認證。

異丙腎上腺素干粉（大連美侖生物公司）采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方式，配成2.5 mg/ml異丙腎上腺素溶液。自大鼠背部皮下注射給藥，劑量5 mg/kg，連續(xù)注射7 d，建立左心室心肌肥厚大鼠病理模型。

1.2 CMR檢查 采用7.0T小動物MR掃描儀（Bruker BioSpec 70/30，Ettlingen）對大鼠進行CMR掃描。掃描前用含有異氟烷和氧氣的混合氣體（異氟烷濃度為2.5%，氧流量為0.9 L/min）對大鼠進行氣體麻醉。使用大鼠心臟專用體表線圈，大鼠取俯臥位放置于掃描床上，頭先進，將大鼠心臟置于線圈的正中心處。將呼吸門控觸發(fā)墊置于大鼠腹部呼吸動度最明顯處，將心電監(jiān)護儀的3個電極分別插入大鼠雙前肢及左后肢皮下，用膠帶固定。調(diào)整麻醉濃度，持續(xù)麻醉濃度范圍一般為2%～2.5%，掃描過程中可根據(jù)大鼠呼吸狀態(tài)進行調(diào)節(jié)，以保證掃描期間大鼠呼吸基本穩(wěn)定，掃描期間大鼠呼吸頻率一般為35～45次/分。待大鼠心率及呼吸平穩(wěn)后開始掃描。

定位像：無門控成像，迅速獲得橫斷面、矢狀面及冠狀面定位圖像。初步確定大鼠心臟是否位于線圈中心，為后續(xù)掃描做好準備。掃描參數(shù)：TE 1.7 ms，TR 15 ms，翻轉(zhuǎn)角（FA）16°，視野（FOV）50 mm×50 mm；矩陣256×256，層厚1.0 mm；激勵次數(shù)6。

FLASH-cine：定位掃描獲得標準的左心室長軸二腔心圖像和長軸四腔心圖像。從左心室心底二尖瓣水平至心尖方向逐層掃描獲得標準的左心室短軸二腔心圖像。掃描參數(shù)：TE 2.5 ms，TR 8 ms，F(xiàn)A 20°，F(xiàn)OV 60 mm×60 mm；矩陣192×192；層厚1.0 mm，層間距0 mm，激勵次數(shù)6。

1.3 血生化檢測 掃描結(jié)束后，采用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用碘伏消毒皮膚。沿腹正中線向上剪開皮膚，提起劍突，沿肋骨下緣剪開膈肌，于腋中線處剪斷雙側(cè)肋骨，將胸骨向頭端掀起，充分暴露胸腔。采集右心房靜脈血并離心，分離血清，檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、高敏度肌鈣蛋白T（high-sensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT）。

1.4 組織病理學檢查 自大鼠右心房注射1.5 ml飽和氯化鉀溶液，處死大鼠。迅速取出心臟于生理鹽水中沖洗，用吸水紙吸干、稱重，計算心臟體重比，離體心臟固定于4%多聚甲醛中靜止約1周。將固定好的心臟沿左心室短軸方向切成厚約1.5 mm的組織切片，石蠟包埋，脫水，行HE染色及Massion染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 MR常規(guī)心功能參數(shù)分析 在心臟專用分析軟件CVI42.0上進行圖像分析。手動勾畫短軸二腔心圖像的左心室舒張末期與收縮末期心內(nèi)膜與心外膜輪廓，選擇室間隔插入點，剔除乳頭肌部分。軟件自動計算心功能參數(shù)，包括左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）、左心室每搏輸出量（left ventricular stroke volume，LVSV）、左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室心肌質(zhì)量（left ventricular mass，LVmass）、左心室舒張末期最大室壁厚度（left ventricular end-diastolic maximum wall thickness，LVEDTHmax）。

1.5.2 心肌應(yīng)力分析 將左心室短軸二腔心、長軸二腔心及長軸四腔心的電影序列導入CVI42.0的組織追蹤（tissue tracking，TT）模塊，手動勾畫左心室舒張末期心內(nèi)膜及心外膜（圖1），由軟件自動計算出左心室各向應(yīng)力參數(shù)，包括整體徑向應(yīng)力（global radial strain，GRS）、整體周向應(yīng)力（global circumferential strain，GCS）、整體縱向應(yīng)力（global longitudinal strain，GLS）。

圖1 組織特征追蹤（CVI42.0軟件）分析。手動勾畫電影圖像左心室舒張末期短軸二腔心（A）、長軸二腔心（B）和長軸四腔心（C）的心內(nèi)膜（紅色圈）及心外膜（綠色圈）輪廓，選擇并標記上室間隔（藍色+）及下室間隔（紅色+）插入點，由軟件自動計算左心室心肌形變參數(shù)

1.6 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件，計量資料以±s表示。方差齊性采用F檢驗，兩變量比較采用t檢驗或Welch t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 與對照組比較，實驗組大鼠心臟質(zhì)量及心臟體質(zhì)量比增大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

2.2 血生化指標 與對照組比較，實驗組大鼠AST及hs-cTnT明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組ALT差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 影像學表現(xiàn) 實驗組大鼠心臟增大，心肌增厚，心肌收縮力增強，未見心包積液。對照組心臟未見異常，未見心包積液（圖2）。

圖2 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對照組（A、C）和實驗組（B、D）左心室短軸二腔心（A、B）和長軸二腔心（C、D）的MRI圖像。A、C示對照組大鼠左心室形態(tài)、大小及信號未見異常，心室壁未見增厚，左心室壁最大厚度為1.83 cm（A中黃色線段）未見心包積液；B、D示實驗組大鼠左心室增大，左心室壁彌漫性增厚，左心室壁最大厚度為2.54 cm（B中黃色線段），心肌信號未見明顯異常，心包未見積液

2.4 常規(guī)心功能參數(shù) 與對照組比較，實驗組大鼠LVESV減低，LVEDTHmax、LVSV、LVmass及LVEF增大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。兩組LVEDV差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組大鼠MR參數(shù)及基礎(chǔ)資料比較（±s）

表1 兩組大鼠MR參數(shù)及基礎(chǔ)資料比較（±s）

注：LVEDTHmax為左心室舒張末期最大室壁厚度，LVEDV為左心室舒張末期容積，LVESV為左心室收縮末期容積，LVSV為左心室每搏輸出量，LVEF為左心室射血分數(shù)，LVmass為左心室心肌質(zhì)量，ALT為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，hs-cTnT為高敏度肌鈣蛋白T。括號內(nèi)為大鼠只數(shù)

指標對照組（n=10）實驗組（n=20）t值P值體質(zhì)量（g） 282.70±4.62（10） 277.70±3.74（20） 0.846 >0.05<0.01心臟體質(zhì)量比（mg/g） 2.98±0.06（10） 4.11±0.06（20） 11.690 <0.01心臟質(zhì)量（mg）837.10±20.13（10）1 130.00±17.08（20）10.830<0.01 LVEDV（ml） 0.40±0.01（10） 0.39±0.01（20） 1.047 >0.05 LVEDTHmax（mm）2.00±0.04（10）2.44±0.04（20）7.339<0.01 LVSV（ml） 0.26±0.00（10） 0.28±0.00（20） 3.430 <0.01 LVESV（ml）0.14±0.00（10）0.11±0.01（20）3.401<0.01 LVEF（%） 64.55±0.57（10） 69.88±1.51（20） 3.300 <0.01 LVmass（g）0.40±0.01（10）0.50±0.01（20）6.223<0.05 ALT（U/L） 36.50±2.37（8） 40.75±4.46（12） 0.918 >0.05 AST（U/L）102.60±5.78（8）158.50±21.81（12）2.482 hs-cTnT（ng/L）947.80±319.60（8）2 526.00±457.70（12）2.921<0.01

2.5 組織病理學結(jié)果 HE及Massion染色結(jié)果顯示：顯微鏡下觀察，實驗組可見心肌細胞體積增大，排列稍亂，可見心肌纖維化，心肌纖維化主要以心內(nèi)膜面為主，為彌漫性。對照組心肌未見異常（圖3～5）。

圖3 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對照組和實驗組心臟切片HE染色。實驗組心臟切片橫切面（B，×200；F，×400）和縱切面（D，×200；H，×400）觀：心肌細胞增大，排列稍紊亂，未見心肌水腫。對照組心臟切片橫切面（A，×200；E，×400）和縱切面（C，×200；G，×400）觀：心肌細胞形態(tài)、大小及排列未見異常，未見心肌水腫

2.6 心肌應(yīng)力分析 與對照組比較，實驗組左心室整體心肌應(yīng)力GRS、GCS及GLS減低，以GRS和GCS減低更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組大鼠左心室整體心肌應(yīng)變參數(shù)（%，±s）

表2 兩組大鼠左心室整體心肌應(yīng)變參數(shù)（%，±s）

注：GRS為整體徑向應(yīng)力，GCS為整體周向應(yīng)力，GLS為整體縱向應(yīng)力

指標對照組實驗組（n=10）（n=20）t值P值GRS 54.23±1.21 40.44±2.17 4.305 <0.01<0.01 GLS -22.34±0.83 -18.86±1.01 2.239 <0.05 GCS -25.02±0.28-20.95±0.73 3.831

圖4 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對照組和實驗組心臟Massion染色切片掃描圖。對照組大鼠心臟輪廓正常，左心室壁未見增厚，無心肌纖維化（×5，A）；實驗組大鼠心臟輪廓增大，心腔變小，左心室壁明顯增厚，左心室心內(nèi)膜側(cè)出現(xiàn)心肌纖維化（圖中藍色代表纖維化，×5，B）

圖5 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對照組和實驗組心臟切片Massion染色。對照組大鼠心肌細胞形態(tài)、大小正常，排列規(guī)律、有序，無心肌纖維化（×200，A）；實驗組大鼠心肌細胞增大，排列欠規(guī)律，可見網(wǎng)格狀心肌纖維化（圖中藍色代表纖維化，×200，B）

3 討論

病理性心肌肥厚是心臟重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是導致各種不良心血管事件的危險因素，深入了解該病理狀態(tài)，采取有效的干預(yù)治療方法，對于延緩甚至逆轉(zhuǎn)疾病進展，防止其惡化發(fā)展為頑固性心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死等嚴重心血管事件至關(guān)重要。因此，左心室心肌肥厚動物模型的建立對于研究病理性左心室心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后及特效藥物等相關(guān)研究意義重大。

參考既往研究[14-15]，本研究連續(xù)7 d皮下注射異丙腎上腺素5 mg/kg建立左心室心肌肥厚動物模型，影像學、形態(tài)學、組織病理學研究結(jié)果表明成功建立了異丙腎上腺素介導的左心室心肌肥厚模型，該模型與主動脈縮窄[16]比較更簡單、方便。主動脈縮窄需要開胸，感染風險高，縮窄手術(shù)操作時可因手術(shù)結(jié)扎程度過大，提高了動物死亡概率。此外，對于非外科專業(yè)的研究者采用該方法構(gòu)建左心室心肌肥厚動物模型可能具有一定的難度，導致進一步研究受阻。而異丙腎上腺素皮下注射建模非常便捷，5 mg/kg的給藥劑量下幾乎0死亡率，建模效率高，節(jié)約時間成本及勞動成本。此外，本研究結(jié)果顯示，異丙腎上腺素皮下注射7 d后，不僅出現(xiàn)病理性早期左心室心肌肥厚，同時出現(xiàn)心肌纖維化。因此，異丙腎上腺素皮下注射也是心肌纖維化動物模型造模的有效方法，已經(jīng)用于很多與心肌纖維化相關(guān)的研究[17-19]。

本研究采用MR-TT對異丙腎上腺素介導的大鼠早期左心室心肌肥厚進行評估，結(jié)果顯示：與對照組比較，實驗組大鼠左心室心肌應(yīng)力GRS、GCS、GLS減低，提示心室舒縮功能受損。由于心肌纖維分為3層結(jié)構(gòu)，纖維走向為內(nèi)縱、中環(huán)、外斜，內(nèi)側(cè)纖維主要產(chǎn)生縱向應(yīng)變，中層纖維主要產(chǎn)生周向應(yīng)變，而外層纖維主要產(chǎn)生縱向應(yīng)變和周向應(yīng)變，徑向應(yīng)變則由3層纖維共同作用而產(chǎn)生[20]，因此，GRS與GCS、GLS的改變或許可以間接反映心肌纖維基層受累情況。本研究模型中的心肌肥厚累及心肌各層，因此各基層心肌形變能力均減低。然而，與對照組比較，實驗組大鼠LVEF升高，與Hinojar等[21]及Xu等[22]的研究結(jié)果一致，上述兩項研究表明，當左心室心肌肥厚時，盡管射血分數(shù)保留（正?；蛏撸?，但左心室心肌應(yīng)力已經(jīng)降低。LVEF是反映心肌舒縮功能的一個相對指標，而非絕對指標，根據(jù)LVEF的計算公式：LVEF=（左心室舒張末期容積－左心室收縮末期容積）÷左心室舒張末期容積，即心臟每搏輸出量除以左心室舒張末期容積，因此，LVEF可以隨著左心室舒張末期容積或左心室收縮末期容積任意1項的改變或者兩者同時改變而發(fā)生相應(yīng)的變化。而MR-TT所測得的心肌應(yīng)力反映心肌形變能力的絕對值，能夠直接反映心肌舒縮功能狀況，因此，MR-TT所測得的心肌應(yīng)力比LVEF對于病理性心肌肥厚所致心肌收縮功能異常的鑒別更加敏感，故MR-TT所測得的心肌應(yīng)力可作為評估心肌收縮功能狀態(tài)的早期指標。

除MR-TT技術(shù)以外，還存在其他可用于分析心肌形變的技術(shù)，其中以心肌標記[23]和超聲斑點追蹤[24]應(yīng)用最為廣泛。然而，超聲斑點追蹤易受透聲窗影響，具有角度依賴性，也易受操作者主觀因素的影響。MR心肌標記是影像學分析心肌應(yīng)變的“金標準”[25]，但需要特定的成像序列及后處理，增加了時間和勞動成本，操作者依賴性也大；另外，由于部分容積效應(yīng)干擾，導致心外膜和心內(nèi)膜表面的應(yīng)力測量偏倚。值得關(guān)注的是，MR-TT與超聲斑點追蹤及MR心肌標記在評估心肌形變能力上具有較好的一致性[23,26]。MR-TT基于常規(guī)電影序列，無需增加特定成像序列，節(jié)約時間及勞動成本，手動標記心臟輪廓很大程度地降低血池及乳頭肌引起的部分容積效應(yīng)。因此，MR-TT在評估心肌應(yīng)力方面的價值越來越受重視，目前已廣泛應(yīng)用于各種病理性心肌肥厚相關(guān)疾病的研究，如肥厚性心肌病[27]、高血壓性心肌病[28]、心肌淀粉樣變[29]及糖尿病性心肌病[30]等，并且取得了很大進展。

本研究的局限性：本研究探究MR-TT評估異丙腎上腺素介導的早期心肌肥厚的心肌收縮功能的價值，因此僅行CMR電影序列掃描，未進行釓對比劑延遲強化、T1Mapping、T1ρMapping等序列掃描，以分析動物模型中的心肌纖維化，需要注意的是，本研究模型中的心肌纖維化以心內(nèi)膜下為主，為彌漫性，釓對比劑延遲強化對鑒別此模型的心肌纖維化作用不大。CMR的定量成像技術(shù)如T1Mapping[31]、細胞外間質(zhì)容積分數(shù)[32]、T1ρMapping[33]等將有助于彌漫性心肌纖維化的定性及定量研究。此外，本研究僅涉及左心室整體心肌應(yīng)力，徑向、周向及縱向應(yīng)力，反映一個左心室心肌整體的形變趨勢，未對心肌局部及節(jié)段性應(yīng)力進行研究，因此無法獲得更多的細節(jié)信息。

總之，異丙腎上腺素建立早期左心室心肌肥厚動物模型方便、有效，是病理性心肌肥厚相關(guān)基礎(chǔ)研究的理想模型。MR-TT可用于早期病理性心肌肥厚心肌收縮功能的評估，可望輔助或替代LVEF用于評價臨床心功能，尤其是對于射血分數(shù)保留患者的心功能評價方面，MR-TT將比LVEF更具有優(yōu)勢。